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南方医科大学学报 2024年第5期44卷 818-826页

作者：崔芝马萃娇王倩茹陈金豪严子阳杨建林吕亚丰曹春雨肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室三峡大学基础医学院湖北宜昌443002

目的研究腺相关病毒(AAV2)介导的TGF-βⅡ受体(TβRⅡ)胞外结构域和IgG2a Fc段融合基因对小鼠4T1细胞在体内增殖和迁移的影响。方法通过分子克隆构建表达sTβRⅡ-Fc的腺相关病毒核心质粒载体pAAV-sTβRⅡ-Fc,转染至HEK 293T细胞验证分泌... 详细信息

目的研究腺相关病毒(AAV2)介导的TGF-βⅡ受体(TβRⅡ)胞外结构域和IgG2a Fc段融合基因对小鼠4T1细胞在体内增殖和迁移的影响。方法通过分子克隆构建表达sTβRⅡ-Fc的腺相关病毒核心质粒载体pAAV-sTβRⅡ-Fc,转染至HEK 293T细胞验证分泌性sTβRⅡ的表达。在HEK 293T细胞中共转染重组腺相关病毒核心质粒pAAV-sTβRⅡ-Fc、衣壳蛋白表达质粒pAAV2和辅助质粒pHelper以制备AAV2-sTβRⅡ,碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒。Western blot检测AAV2-sTβRⅡ对TGF-β信号通路下游关键蛋白Smad2/3磷酸化水平的影响,以及经治疗后各组小鼠4T1移植瘤内E-钙黏蛋白、波形蛋白、p-Smad2/3的表达水平。构建Luciferase标记的4T1细胞并荷瘤BALB/c小鼠,荷瘤小鼠随机分为处理组AAV2-sTβRⅡ、对照组AAV2-GFP和溶剂对照组PBS(6只/组),各组病毒均经尾静注射到小鼠体内。小动物活体成像观察AAV2-sTβRⅡ在小鼠体内对4T1移植瘤增殖的影响。免疫组织化学检测肿瘤组织Ki67蛋白的表达水平。免疫荧光检测小鼠肝脏内sTβRⅡ蛋白的表达水平。H&E染色观察小鼠肺部肿瘤转移灶和主要脏器的病理学改变。结果pAAV-sTβRⅡ-Fc重组质粒构建成功并在HEK 293T细胞中分泌表达sTβRⅡ。AAV2-sTβRⅡ能够感染4T1细胞并显著降低TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化(P0.05)。结论重组腺相关病毒载体AAV2介导的TβRⅡ胞外结构域编码序列,可阻断4T1细胞中的TGF-β信号通路,显著抑制小鼠体内4T1细胞增殖和肺转移。

关键词：三阴性乳腺癌 TGF-βⅡ 迁移 TGF-β信号通路腺相关病毒

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腺相关病毒9衣壳可变区蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2024年第7期37卷 837-842页

作者：李舒月张浩张雄洲赵云汉杨建林曹春雨吕亚丰肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室三峡大学基础医学院湖北宜昌443002

目的原核表达、纯化腺相关病毒9(adeno-associated virus 9,AAV9)衣壳可变区蛋白,并制备针对AAV9衣壳可变区的兔多克隆抗体。方法设计并合成编码AAV9衣壳蛋白可变区的DNA序列,插入原核表达载体pET-30a获得质粒pET-30a-AAV-VR,转化*** ... 详细信息

目的原核表达、纯化腺相关病毒9(adeno-associated virus 9,AAV9)衣壳可变区蛋白,并制备针对AAV9衣壳可变区的兔多克隆抗体。方法设计并合成编码AAV9衣壳蛋白可变区的DNA序列,插入原核表达载体pET-30a获得质粒pET-30a-AAV-VR,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达多价抗原肽,在变性条件下经Ni-NTA树脂纯化,透析复性后将AAV9可变区蛋白免疫雄性日本大耳白兔,制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot及细胞免疫荧光法检测抗体的特异性。结果表达AAV9衣壳可变区蛋白的重组原核表达质粒pET-30a-AAV-VR经XhoⅠ和BglⅡ双酶切鉴定构建正确。表达的蛋白相对分子质量约为20 000,纯化后可被His标签抗体识别。制备的兔多克隆抗体效价为1∶10 240 000,能特异性识别AAV9衣壳蛋白。结论成功表达了AAV9衣壳可变区蛋白,并制备了高效价的兔多克隆抗体,为后续AAV载体开发以及AAV生物学功能研究奠定了基础。

关键词：腺相关病毒9 衣壳可变区原核表达多克隆抗体

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浅谈双创教育视角下的医学生创新能力培养策略

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中国科技经济新闻数据库教育 2024年第8期 0034-0037页

作者：吕亚丰刘亚云侯亚男曹春雨三峡大学基础医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室湖北宜昌443002

现如今,随着国家创新驱动发展战略的深入实施,"双创"(即创新创业)教育已成为高等教育改革的重要方向。在医学教育领域,培养具有创新意识和创业能力的医学生是提升医疗卫生服务水平、促进医疗健康产业发展的关键。本文旨在分析当前医学... 详细信息

现如今,随着国家创新驱动发展战略的深入实施,"双创"(即创新创业)教育已成为高等教育改革的重要方向。在医学教育领域,培养具有创新意识和创业能力的医学生是提升医疗卫生服务水平、促进医疗健康产业发展的关键。本文旨在分析当前医学生双创教育的现状与挑战,并提出相应的策略和建议,以期为医学教育改革提供建议与参考。

关键词：双创医学教育创新能力

新型精胺氧化酶抑制剂SI-4650对人卵巢癌SKVO-3细胞增殖和上皮细胞间质化的影响

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中国应用生理学杂志 2022年第2期38卷 175-180,192页

作者：杨建林田家俊张浩陈倩影吕亚丰曹春雨三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室湖北宜昌443002

目的:研究新型精胺氧化酶(SMO)小分子抑制剂SI-4650对人卵巢癌SKVO-3细胞增殖和上皮细胞间质化影响及其分子机制。方法:体外培养SKVO-3细胞,以未加药作为对照组,30、60μmol/L SI-4650处理48 h细胞为实验组,每组设3个复孔,检测SI-4650对... 详细信息

目的:研究新型精胺氧化酶(SMO)小分子抑制剂SI-4650对人卵巢癌SKVO-3细胞增殖和上皮细胞间质化影响及其分子机制。方法:体外培养SKVO-3细胞,以未加药作为对照组,30、60μmol/L SI-4650处理48 h细胞为实验组,每组设3个复孔,检测SI-4650对SKVO-3细胞内SMO的酶活性及多胺含量、酶促反应产物活性氧水平的影响,对细胞增殖、周期、线粒体膜电位的作用,以及对细胞凋亡、侵袭和迁移能力的影响,同时检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3以及上皮细胞间质化(EMT)相关蛋白E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2、MMP-9表达。结果:与对照组相比,实验组SKVO-3细胞中SI-4650浓度增加,明显抑制SKVO-3细胞内SMO酶活性(P<0.01)、减少SMO酶促反应产物活性氧水平(P<0.01)、降低细胞内总多胺含量(P<0.01)。SI-4650高效抑制SKVO-3细胞生长(P<0.01),实验组细胞生长抑制率分别为32.27%、47.31%;将SKVO-3细胞阻滞在S期(P<0.01),实验组细胞Bax表达和Caspase3活化剪切增加,Bcl-2表达减少,线粒体膜电位下降,凋亡细胞比率增加至31.41%、43.51%;同时,实验组E-cad表达显著增加,N-cad、Vimentin表达均明显减少,合成分泌MMP-2、MMP-9减少,干扰了SKVO3细胞EMT进程,降低肿瘤细胞侵袭、迁移能力(P<0.01)。结论:SI-4650对人卵巢癌SKVO-3细胞具有杀伤和抑制肿瘤细胞侵袭、迁移的抗肿瘤活性,其机制可能与干扰多胺代谢、诱导细胞S周期阻滞和线粒体途径细胞凋亡以及干扰细胞EMT进程相关。

关键词：精胺氧化酶抑制剂人卵巢癌细胞细胞培养细胞增殖凋亡侵袭迁移

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腺相关病毒衣壳蛋白修饰的研究进展

解放军医学院学报 2022年第1期43卷 101-105页

作者：陈倩影马萃娇吕亚丰曹春雨三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室湖北宜昌443002

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的基因治疗在单基因遗传性疾病的临床治疗中取得了突破性进展。通过衣壳蛋白修饰来优化AAV载体,获得具有细胞靶向性、高转导能力和低或无免疫原性的AAV载体成为当前基因治疗研究的重点之一... 详细信息

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的基因治疗在单基因遗传性疾病的临床治疗中取得了突破性进展。通过衣壳蛋白修饰来优化AAV载体,获得具有细胞靶向性、高转导能力和低或无免疫原性的AAV载体成为当前基因治疗研究的重点之一。目前,研究者主要通过合理设计、定向进化和化学修饰方法对AAV衣壳进行修饰、改造。本文综述了AAV的生物学特性和有关AAV衣壳修饰的新近研究进展,并讨论了该领域所面临的挑战。

关键词：基因治疗基因递送腺相关病毒工程腺相关病毒衣壳修饰细胞靶向性

BMI-1抑制剂PTC-596对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期和凋亡的影响

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实用医学杂志 2023年第18期39卷 2317-2322,2329页

作者：李玉玲杨建林崔芝王静吕亚丰曹春雨三峡大学基础医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室湖北宜昌443002

目的分析BMI-1抑制剂PTC-596对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法以人乳腺癌MCF-7细胞为肿瘤细胞模型,正常培养为阴性对照组,25、50 nmol/L PTC-596处理SGC-7901细胞48 h为低、高药物浓度实验组。利用CCK8法分析细胞增殖... 详细信息

目的分析BMI-1抑制剂PTC-596对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法以人乳腺癌MCF-7细胞为肿瘤细胞模型,正常培养为阴性对照组,25、50 nmol/L PTC-596处理SGC-7901细胞48 h为低、高药物浓度实验组。利用CCK8法分析细胞增殖能力;流式细胞术分别结合PI单染、DCFHDA探针、JC-1探针以及PI/FITC-Annexin V双染分析细胞周期、活性氧(reactive oxygen species, ROS)累积、线粒体膜电位和凋亡细胞比例;Western blot法检测细胞BIM-1蛋白和周期相关蛋白CyclinD1、CyclinB1、P21以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、c-PARP蛋白相对表达水平。结果与对照组相比,PTC-596高效抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,处理48 h后IC_(50)为(49.33±7.02)nmol/L。低、高药物浓度实验组细胞中BMI-1表达显著减少(P <0.01)。实验组细胞中CyclinB1和P21相对表达增加,CyclinD1表达减少,细胞有丝分裂被抑制,出现G_2/M期周期阻滞;同时活性氧累积增多,线粒体膜电位下降,Bax表达上调,Bcl-2表达下调,c-PARP增加,凋亡细胞比例从2.04%显著上升为10.56%、26.74%。与对照组相比较,以上结果差异均有统计学意义(P <0.05)。结论 PTC-596高效杀伤人乳腺癌MCF-7细胞,其机制可能与抑制BMI-1、诱导细胞周期阻滞和内源性线粒体途径细胞凋亡密切相关。

关键词：原癌基因BMI-1 PTC-596 人乳腺癌MCF-7细胞细胞增殖细胞周期凋亡

PTC-596对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭和迁移抑制作用及机制研究

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中国临床药理学杂志 2022年第21期38卷 2568-2571页

作者：杨建林田家俊陈倩影张浩吕亚丰曹春雨三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室湖北三峡443002

目的研究靶向B细胞特异性小鼠白血病病毒插入位点1(Bmi-1)的小分子抑制剂PTC-596对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移的影响及作用机制。方法体外培养MCF-7细胞,分空白组(正常培养)和低、高浓度实验组(25,50 nmol·L^(-1) PTC-596)均培养48 h... 详细信息

目的研究靶向B细胞特异性小鼠白血病病毒插入位点1(Bmi-1)的小分子抑制剂PTC-596对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移的影响及作用机制。方法体外培养MCF-7细胞,分空白组(正常培养)和低、高浓度实验组(25,50 nmol·L^(-1) PTC-596)均培养48 h。以划痕愈合实验和Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,以克隆形成实验检测单克隆细胞群生长能力,以蛋白质印迹法检测Bmi-1、上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达。结果空白组与低、高浓度实验组24 h划痕愈合能力分别为(76.32±3.64)%,(20.39±2.83)%,(1.32±2.49)%;迁移细胞数分别为407±38,122±35,41±13,侵袭细胞数分别为287±23,82±21,34±9;Bmi-1蛋白相对表达量分别为1.00±0.05,0.49±0.03,0.20±0.01;E-cadherin相对表达量分别为1.00±0.15,3.79±0.13,7.41±0.21;N-cadherin相对表达量分别为1.00±0.00,0.82±0.01,0.29±0.01;Vimentin相对表达量分别为1.00±0.01,0.75±0.01,0.31±0.01;MMP-2相对表达量分别为1.00±0.02,1.17±0.04,0.47±0.04;MMP-9相对表达量分别为1.00±0.02,0.63±0.04,0.32±0.03。低、高浓度实验组与空白组相比,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论Bmi-1抑制剂PTC-596能高效抑制人乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭能力,机制可能与影响MCF-7细胞上皮-间质转化进程相关。

关键词： B细胞特异性小鼠白血病病毒插入位点1抑制剂人乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移

新型精胺氧化酶抑制药对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和自噬的影响

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中国临床药理学杂志 2023年第16期39卷 2343-2347页

作者：李玉玲杨建林崔芝王静吴红艳吕亚丰曹春雨三峡大学基础医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室湖北宜昌443002

目的研究新型精胺氧化酶抑制药SI-4650对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法将SGC-7901细胞分为空白组(正常培养)、低、高剂量实验组(40、80μmol·L^(-1)SI-4650)、自噬抑制药3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(2.5 mmol·L^(-1)3-MA)... 详细信息

目的研究新型精胺氧化酶抑制药SI-4650对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法将SGC-7901细胞分为空白组(正常培养)、低、高剂量实验组(40、80μmol·L^(-1)SI-4650)、自噬抑制药3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(2.5 mmol·L^(-1)3-MA)、3-MA+低、高剂量实验组(2.5 mmol·L^(-1)3-MA+40、80μmol·L^(-1)SI-4650),均处理48 h。用化学发光法检测细胞中精胺氧化酶(SMO)活性,用细胞计数8(CCK8)法和流式细胞术检测细胞增殖和周期,用碘化丙啶(PI)/异硫氰酸荧光素(FITC)-Annexin V双染法检测凋亡细胞情况,用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白微管结合蛋白轻链-3Ⅰ/Ⅱ(LC3-Ⅰ/Ⅱ)表达水平。结果空白组与低、高剂量实验组中人胃癌SGC-7901细胞中相对SMO酶活性分别为(7293±195)、(4506±195)、(989±115)RLU·(mg·s)^(-1),S期细胞比例分别为(28.83±1.17)%、(32.23±1.21)%、(36.50±0.73)%,低、高剂量实验组与空白组相比,差异均有统计学意义(均P<0.01)。空白组与低、高剂量实验组以及3-MA组与3-MA+低剂量实验组、3-MA+高剂量实验组中可见,细胞生长抑制率分别为(0.00±2.09)%、(43.61±2.29)%、(52.16±2.49)%、(1.81±4.43)%、(27.50±1.88)%、(34.22±1.07)%,细胞凋亡率分别为(7.01±2.09)%、(13.16±1.59)%、(25.35±2.32)%、(7.13±2.09)%、(8.61±1.59)%、(11.35±2.32)%,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为0.01±0.03、0.58±0.04、2.73±0.03、0.03±0.01、0.06±0.02、0.23±0.03。低、高剂量实验组与空白组相比,低、高剂量实验组与对应浓度3-MA+低、高剂量实验组相比,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论SI-4650能高效抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,机制可能与干扰多胺代谢、阻滞细胞周期S期和诱导细胞自噬、凋亡相关。

关键词：精胺氧化酶抑制药人胃癌SGC-7901细胞增殖凋亡自噬

萝卜硫素对小鼠乳腺癌4T1细胞上皮-间质转化、增殖和迁移的影响研究

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中国癌症杂志 2021年第7期31卷 605-615页

作者：谢金芳曹春雨任雪田家俊吕亚丰黄晓飞三峡大学医学院生物化学与分子生物学系湖北宜昌443002 三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室湖北宜昌443002

背景与目的:组蛋白去乙酰化酶5(histone deacetylase 5,HDAC5)在乳腺癌组织中异常高表达,其与赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine specific demethylase,LSD1)协同促进乳腺癌细胞增殖和迁移。通过萝卜硫素(sulforaphane,SFN)下调HDAC5表达... 详细信息

背景与目的:组蛋白去乙酰化酶5(histone deacetylase 5,HDAC5)在乳腺癌组织中异常高表达,其与赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine specific demethylase,LSD1)协同促进乳腺癌细胞增殖和迁移。通过萝卜硫素(sulforaphane,SFN)下调HDAC5表达,观察其对小鼠乳腺癌4T1细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、增殖和迁移的影响。方法:采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法分析SFN对4T1细胞增殖的影响。采用乳酸脱氢酶释放实验检测SFN的细胞毒性。采用pcDNA3.1(+)-FLAG-HDAC5质粒转染4T1细胞,通过G418筛选获得单个细胞克隆,再以蛋白质印迹法(Western blot)鉴定HDAC5蛋白稳定高表达的单克隆细胞系。采用划痕实验和transwell法分析过表达HDAC5以及SFN处理对4T1细胞迁移和侵袭的影响。采用Westernblot检测SFN处理对4T1细胞EMT标志物上皮钙黏着蛋白(E-cadherin)、神经钙黏着蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达的影响。以4T1细胞的BALB/c小鼠移植瘤为模型,观察SFN对4T1细胞体内成瘤性、转移的影响及其与HDAC5表达的关系。采用免疫组织化学法检测小鼠原位肿瘤及肺转移瘤组织中Ki-67增殖指数。取荷瘤小鼠心、肝、肾组织,采用H-E染色检测SFN对荷瘤小鼠的毒性作用。结果:SFN能够抑制4T1细胞增殖(P<0.01),并抑制4T1细胞体外迁移和侵袭,而外源性过表达HDAC5可部分拮抗SFN对4T1细胞迁移和侵袭的抑制作用。SFN处理显著下调4T1细胞中HDAC5、MMP-9、N-cadherin和vimentin的表达,同时上调E-cadherin的表达。结论:SFN处理显著抑制4T1细胞在小鼠体内的成瘤性和肺转移,下调小鼠原位肿瘤和肺转移瘤组织中的Ki-67阳性率。过表达HDAC5可拮抗SFN对4T1细胞体内成瘤性和肺转移的抑制作用。SFN的抗乳腺癌作用与其诱导的HDAC5表达下调以及由此介导的EMT抑制作用密切相关。

关键词：萝卜硫素乳腺癌 4T1细胞上皮-间质转化细胞迁移