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大鼠骨髓基质干细胞的改良培养方法及Hoechst体外标记研究

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第1期27卷 61-63页

作者：袁斌马樱闫铭叶正旭罗卓荆第四军医大学西京医院全军骨科研究所第四军医大学基础部免疫学教研室陕西西安710032

目的:改良大鼠骨髓基质干细胞全骨髓贴壁培养法,并进行Hoechst体外标记初步研究。方法:采用改良全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,以MTT比色实验观察细胞生长状态并绘制生长曲线,行体外诱导向成骨细胞及脂肪细胞分化,以流式细胞... 详细信息

目的:改良大鼠骨髓基质干细胞全骨髓贴壁培养法,并进行Hoechst体外标记初步研究。方法:采用改良全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,以MTT比色实验观察细胞生长状态并绘制生长曲线,行体外诱导向成骨细胞及脂肪细胞分化,以流式细胞术检测细胞表面抗原。以Hoechst体外标记大鼠骨髓基质干细胞,荧光显微镜下计数并观察Hoechest对细胞生长状态的影响。结果:改良全骨髓贴壁培养法能够在较短时间内获得纯化并具备高活性的骨髓基质干细胞,并成功诱导其分化为成骨细胞及脂肪细胞。流式细胞术检测显示细胞表面CD29、CD90、CD44均为阳性,CD45、CD34均为阴性。荧光显微镜观察Hoechst能够在体外成功标记骨髓基质干细胞,并对细胞的生长无明显影响。结论:经改良后的全骨髓贴壁培养法是获得纯化骨髓基质干细胞的一种更为简捷、高效、经济的途径,Hoechst可作为体外标记大鼠骨髓基质干细胞的标记物。

关键词：骨髓基质干细胞全骨髓贴壁培养法诱导分化 Hoechst体外标记

Hsp70-NP融合蛋白增强诱导HTNVNP特异性CTL的实验研究

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中国病毒学 2006年第4期21卷 339-342页

作者：李静叶正旭杨守京李铠男高娟刘彦仿第四军医大学病理学教研室第四军医大学西京医院骨科第四军医大学西京医院消化内科陕西西安710032

本文采用纯化蛋白Hsp70-NP,NP,Hsp70分别免疫C57/BL6小鼠,取各组小鼠脾淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验和细胞毒试验。此外,为了获得细胞毒实验的靶细胞,本文还采用脂质体介导质粒pcDNA3.1/S转染黑色素瘤细胞B16,通过G418筛选稳定克隆,并... 详细信息

本文采用纯化蛋白Hsp70-NP,NP,Hsp70分别免疫C57/BL6小鼠,取各组小鼠脾淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验和细胞毒试验。此外,为了获得细胞毒实验的靶细胞,本文还采用脂质体介导质粒pcDNA3.1/S转染黑色素瘤细胞B16,通过G418筛选稳定克隆,并用RT-PCR,Westernblots以及免疫荧光染色证实N蛋白在胞浆中表达。淋巴细胞增殖实验表明,Hsp70-NP,NP组小鼠脾淋巴细胞均能够对体外抗原刺激产生增殖反应,而Hsp70-NP组的增殖指数明显高于NP免疫组。细胞毒实验结果表明,LDH的释放具有效应细胞依赖性,Hsp70-NP,NP免疫组脾淋巴细胞均可以特异性杀伤靶细胞B16-N,而Hsp70-NP免疫组的杀伤率显著高于NP免疫组。实验结果显示,Hsp70可以增强NP诱导产生特异性CTL的能力。本研究结果为进一步设计基于NP的合成肽疫苗或基因疫苗提供了重要实验依据。

关键词：热休克蛋白(HSP) 汉滩病毒核蛋白转染细胞毒性T淋巴细胞

原子力显微镜下观察急性压力损伤后脊髓背根神经节神经元的结构变化

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中国脊柱脊髓杂志 2012年第2期22卷 165-170页

作者：权鑫叶正旭王宇清罗卓荆第四军医大学西京医院全军骨科研究所陕西省西安市710032

目的:利用脊髓背根神经节神经元细胞体外机械压力损伤模型,探计单纯机械压力因素对背根神经节神经元细胞的损伤效应,尤其是细胞膜骨架蛋白的变化情况。方法:新生SD大鼠脊髓背根神经节神经元体外原代培养,利用多功能全自动细胞压力仪(国... 详细信息

目的:利用脊髓背根神经节神经元细胞体外机械压力损伤模型,探计单纯机械压力因素对背根神经节神经元细胞的损伤效应,尤其是细胞膜骨架蛋白的变化情况。方法:新生SD大鼠脊髓背根神经节神经元体外原代培养,利用多功能全自动细胞压力仪(国家实用新型专利ZL 200820030390.7),将培养细胞分为A、B、C、D四组,其中A组为未施加机械压力损伤的对照组,B、C、D组分别给予0.3mPa、0.5mPa.、0.7mPa的压力损伤10min,每组观察细胞爬片6个,于加压后培养8h取细胞爬片固定,送原子力显微镜检测,观察神经元细胞的细胞膜骨架蛋白纳米级变化情况,获取并分析胞膜表面颗粒高度分布数据及原子力显微镜图片。结果:对照组细胞膜表面平滑,无明显粗糙颗粒;0.3mPa组细胞膜表面颗粒突起较对照组增多,膜颗粒总体高度增加,局部变粗糙,胞膜上蛋白高度分布直方图峰值右移;0.5mPa组较0.3mPa组胞膜粗糙度更加明显;0.7mPa组膜表面蛋白颗粒总体高度较0.3mPa及0.5mPa组降低,粗糙颗粒减少,但出现胞膜骨架蛋白解聚与构像变化,胞膜出现孔道样改变。胞膜颗粒高度分布峰值、分布宽度及最高颗粒值的单因素方差分析显示,压力损伤各组间及损伤组与对照组均有统计学差异(P<0.01)。结论:机械压力损伤因素可引起细胞膜骨架蛋白变化和表面颗粒高度变化,为压力损伤的细胞保护研究提供了实验数据。

关键词：脊髓损伤原子力显微镜神经元细胞细胞培养机械压力

坐高与站高的比率和青少年特发性脊柱侧弯关系的分析

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中华小儿外科杂志 2006年第11期27卷 581-584页

作者：张勇赵黎王瑞叶正旭颉强第四军医大学西京医院骨科西安710032 卫生统计学教研室

目的探讨青少年特发性脊柱侧弯患儿坐高与站高的比率是否和侧弯角度大小之间存在相关关系,并依据这一关系建立预测侧弯角度大小的数学方程。方法对46例轻、中度青少年特发性脊柱侧弯患儿进行观察分析,男8例,女38例;年龄10-20岁,平均13．... 详细信息

目的探讨青少年特发性脊柱侧弯患儿坐高与站高的比率是否和侧弯角度大小之间存在相关关系,并依据这一关系建立预测侧弯角度大小的数学方程。方法对46例轻、中度青少年特发性脊柱侧弯患儿进行观察分析,男8例,女38例;年龄10-20岁,平均13．8岁;单弯。测量记录患儿初次就诊时的实足年龄、站高、坐高以及Cobb角的大小,并根据对患儿站高、坐高测量记录的数据,分别计算每位患儿坐高与站高的比率。结果46例患儿的坐高66．00-88．80 cm(x±s,80．54 cm±5．75 cm);站高126．00-174．80 cm(x±s,153．67 cm±10.72 cm);坐高与站高的比例0．50-0．55(x±s,0．52±0．01);Cobb角10°-45°(x±s,25．70°±9．66°)。患儿的实足年龄、坐高、站高和Cobb角之间均没有相关关系(r分别为0．147,0．015,-0．106;P>0．05);而患儿的坐高与站高的比率和Cobb角之间存在明显的正相关关系(r=0．675;P<0．05);并根据这一关系建立了预测轻、中度青少年特发性脊柱侧弯侧弯角度大小的数学方程。结论青少年特发性脊柱侧弯患儿坐高与站高的比率和侧弯角度大小之间存在明显的正相关关系,可以依据坐高与站高的比率预测轻、中度青少年特发性脊柱侧弯患儿侧弯角度的大小。

关键词：脊柱侧弯青少年

中线腰椎椎间融合术与微创通道下经椎间孔椎体间融合术单侧入路双侧减压治疗单节段腰椎管狭窄症的对比研究

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中国脊柱脊髓杂志 2023年第6期33卷 513-522页

作者：许奔驰段伟赵昕来康伟常乐孙振叶正旭西安医学院西安市710021 空军军医大学西京医院骨科西安市710032

目的:比较中线腰椎椎体间融合术(midline lumbar interbody fusion,MIDLIF)与微创通道下经椎间孔椎体间融合术(minimally invasive transforaminal lumbar interbody fusion,MIS-TLIF)单侧入路双侧减压治疗单节段腰椎管狭窄症的临床疗效。方法:回顾性分析2017年1月~2020年1月我院骨科采用MIDLIF技术与MISTLIF单侧入路双侧减压技术治疗的44例伴双侧症状的腰椎管狭窄症患者,其中L3-42例;L4-541例;L5-S11例。21例患者接受MIDLIF技术治疗,23例患者接受MIS-TLIF单侧入路双侧减压技术治疗。两组患者随访时间、性别无统计学差异(P>0.05);MIDLIF组年龄较MIS-TLIF组大(P0.05);MIDLIF组手术时间(159.74±30.54min)比MIS-TLIF组(202.46±61.56min)短,有统计学差异(P0.05);两组术后1个月、3个月、6个月、12个月及末次随访腰痛及腿痛VAS评分较术前降低,有统计学差异(P0.05)。两组术后6个月、12个月及末次随访腰椎ODI较术前均降低,有统计学差异(P0.05);两组间术前ICCA、DSCA无统计学差异(P>0.05);两组患者术后ICCA、DSCA较术前均明显增大,有统计学差异(P0.05),术后椎间隙后侧高度有统计学差异(P<0.05)。结论:MIDLIF和MIS-TLIF单侧入路双侧减压治疗双侧症状的腰椎管狭窄症患者临床疗效确切,且MIDLIF技术手术时间相对更少,术后ICCA增大更多。MIDLIF技术减压更广泛、更直接。

关键词：腰椎管狭窄症微创技术椎管减压单侧入路双侧减压

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支具治疗青少年特发性脊柱侧凸的临床随访

中华外科杂志 2007年第8期45卷 529-532页

作者：张勇赵黎王瑞叶正旭颉强孙效棠第四军医大学西京医院骨科西安710032 第四军医大学卫生统计学教研室西安710032

目的评价支具治疗青少年特发性脊柱侧凸的临床疗效,分析影响疗效的相关因素,并探讨支具治疗的适应证。方法对79例接受支具治疗的青少年特发性脊柱侧凸患者进行随访,记录患者的 Cobb 角,侧凸类型,女性患者初潮与否,坐高,站高,Risser 征,... 详细信息

目的评价支具治疗青少年特发性脊柱侧凸的临床疗效,分析影响疗效的相关因素,并探讨支具治疗的适应证。方法对79例接受支具治疗的青少年特发性脊柱侧凸患者进行随访,记录患者的 Cobb 角,侧凸类型,女性患者初潮与否,坐高,站高,Risser 征,顶椎旋转度等。结果随访12～60个月,平均23.9个月。末次随访时21例(26.6%)畸形明显进展,40例(50.6%)畸形维持或稍进展,18例(22.8%)畸形改善。初诊时原发弯 Cobb 角>45°组侧凸进展率较 Cobb 角≤35°组高,侧凸改善率较 Cobb 角≤35。组低(P0.05)。结论矫形支具能够有效控制或改善轻、中度特发性脊柱侧凸畸形。单独借助Risser征预测侧凸畸形变化趋势并不可靠。初始 Cobb 角>45°,顶椎旋转度在Ⅲ°以上的患者,如果支具治疗的效果不佳,应考虑尽早手术矫形。

关键词：脊柱侧凸青少年矫形支具

Hsp70与汉滩病毒S基因融合蛋白的原核表达及免疫小鼠的初步研究

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中国病毒学 2006年第1期21卷 11-15页

作者：李静叶正旭杨守京高娟刘彦仿第四军医大学西京医院病理科陕西西安710032 第四军医大学西京医院骨科陕西西安710032 第四军医大学西京医院消化内科陕西西安710032

本文构建了hsp70与S基因的原核融合表达载体pGEX-4T-1/hsp70-S,在大肠杆菌中表达,并通过GSTrapFF柱进行了纯化。同时制备了NP和Hsp70两种纯化蛋白。分别用这三种纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,结果表明纯化的NP和Hsp70-NP两种蛋白均可同时诱... 详细信息

本文构建了hsp70与S基因的原核融合表达载体pGEX-4T-1/hsp70-S,在大肠杆菌中表达,并通过GSTrapFF柱进行了纯化。同时制备了NP和Hsp70两种纯化蛋白。分别用这三种纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,结果表明纯化的NP和Hsp70-NP两种蛋白均可同时诱导产生抗汉滩病毒核蛋白(NP)抗体,且后者刺激产生的抗体效价明显高于前者。淋巴细胞增殖实验表明,两组免疫小鼠的脾细胞均能够对体外抗原刺激产生增殖反应,而Hsp70-NP组免疫小鼠脾细胞对NP的增殖指数明显高于NP组免疫组。结果显示,与单独用NP免疫小鼠相比,Hsp70-NP纯化蛋白可以刺激机体产生更强的抗汉滩病毒体液免疫应答和特异性淋巴细胞增殖反应。

关键词：热休克蛋白汉滩病毒S基因原核表达蛋白免疫

硝普钠对脊髓源性神经干细胞增殖抑制及诱导分化作用

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第四军医大学学报 2004年第9期25卷 791-794页

作者：刘艳武罗卓荆曹延林叶正旭第四军医大学西京医院全军骨科研究所陕西西安710033

目的 :探讨硝普钠 (SNP)对脊髓源性神经干细胞增殖的抑制作用及诱导其向神经细胞分化的可能性 .方法 :脊髓源性的神经干细胞在无血清培养液中培养 ,加入不同浓度的硝普钠溶液 ,采用细胞培养技术结合间接免疫细胞化学法 ,观察神经干细胞... 详细信息

目的 :探讨硝普钠 (SNP)对脊髓源性神经干细胞增殖的抑制作用及诱导其向神经细胞分化的可能性 .方法 :脊髓源性的神经干细胞在无血清培养液中培养 ,加入不同浓度的硝普钠溶液 ,采用细胞培养技术结合间接免疫细胞化学法 ,观察神经干细胞的数量、形态变化 .结果 :硝普钠作用后活细胞的数量较对照组明显减少 ,硝普钠可以抑制脊髓源性神经干细胞的增殖 [对照组与实验组的细胞数分别为 (5 .1±1 .3)× 1 0 5/mL ,(3.3± 0 .8)× 1 0 5/mL ,(2 .2± 0 .6 )× 1 0 5/mL和(1 .4± 0 .3)× 1 0 5/mL ,其中组 3与组 4间P <0 .0 5 ,其余各组间P <0 .0 1 ].相差显微镜下大部分神经干细胞伸出多个细长突起 ,且MAP2免疫荧光染色增强 ;部分为有多个短小突起、GFAP阳性表达 ,部分细胞为少数粗大突起 ,MAG染色阳性 .神经元数与 3种细胞总数之比 ,4组神经元的比例分别为 (30 .2± 3.8) % ,(5 0 .9± 2 .8) % ,(5 8.6± 3.3) %和 (6 6 .7± 4 .1 ) % ,硝普钠浓度越高 ,神经元比例越大 (P <0 .0 1 ) .结论 :硝普钠可以抑制脊髓源性神经干细胞的增殖 .硝普钠还可诱导脊髓源性神经干细胞向神经元的分化 ,而抑制其向星型胶质细胞分化 .浓度越大。

关键词：神经干细胞神经细胞硝普钠增殖抑制分化脊髓

脊髓爆震伤后神经细胞的形态学变化及凋亡细胞的时空分布特点

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中国脊柱脊髓杂志 2009年第10期19卷 758-764页

作者：王宇清叶正旭胡学昱黄景辉罗卓荆第四军医大学西京医院全军骨科研究所陕西省西安市710033

目的:研究脊髓爆震伤后神经细胞的形态学变化及凋亡细胞的时空分布特点。方法:90只家兔随机分为正常组(A组,n=6)、Allen′s撞击组(B组,n=42)和爆震损伤组(C组,n=42)。用改良Allen′s法造成B组不完全性急性脊髓损伤模型;而用0.7g单质金... 详细信息

目的:研究脊髓爆震伤后神经细胞的形态学变化及凋亡细胞的时空分布特点。方法:90只家兔随机分为正常组(A组,n=6)、Allen′s撞击组(B组,n=42)和爆震损伤组(C组,n=42)。用改良Allen′s法造成B组不完全性急性脊髓损伤模型;而用0.7g单质金属炸药黑索金(cyclotrimethylene trinitramine)在垂直距离动物T9～T10节段4cm处引爆造成C组脊髓爆震伤模型,5h后B、C组动物均用诱发电位仪刺激下肢的MEP以筛选造模成功的动物。B、C两组分别于损伤后8h、1d、3d、7d、14d和30d取材(损伤段脊髓2cm),每组每个时间点取材7只,而A组动物不作任何处理,统一于30d取材。通过HE染色、透射电镜检测、DNA电泳分析和凋亡细胞原位末端标记法(TUNEL),观察各组脊髓中神经细胞的形态学变化及凋亡细胞的时空分布。结果:HE染色显示,A组为正常组织学表现;B组损伤后8h即出现大片的出血坏死灶,白质呈严重的脱髓鞘样改变,1、3d时前角运动神经元大量减少,7d时白质中空洞形成,而且空洞逐渐融合,到14、30d时,可见部分巨大空洞;而C组爆震后8h仅出现散在的小型出血点,但病变进展迅速,1d时前角运动神经元即明显减少并伴有大量微型空洞形成,3、7d时整个白质结构松散,可见液化坏死灶及广泛的脱髓鞘样改变,而且透射电镜证实这种髓鞘损伤还具有方向性特征,到14、30d时,脊髓可见巨大空洞及散在的小空洞,但面积明显小于B组。B组的前角运动神经元数目在8h时的降低幅度比C组要大(P<0.05),而到损伤7d后,两组却无明显差异。DNA电泳显示B、C两组损伤后3d均出现明显的DNA梯形条带和Smearing现象,而且这种现象逐渐向邻近节段扩散。TUNEL检测显示,B、C两组于损伤后的灰质和白质中均能检测到阳性细胞,而且分布于灰质内的阳性细胞数均于1d时达到高峰(P<0.001),但是在白质内的阳性细胞数量,B组于3d时达到高峰(P<0.001),C组却于7d时才达到高峰(P<0.001)。结论:与脊髓Allen′s撞击模型相比,脊髓爆震伤后同样存在神经细胞的凋亡现象,而且有其时间和空间分布特点。

关键词：脊髓爆震伤细胞凋亡 TUNEL