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利用9R-GFP-PHD检测细胞膜上PIP2的动态变化

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重庆医学 2014年第18期43卷 2308-2311页

作者：韩小建万玉英危永芳杨章坚张剑锋南昌大学转化医学研究院南昌330031 南昌大学第二附属医院感染管理科南昌330006

目的通过原核细胞表达和纯化9R-GFP-PHD重组蛋白,并利用纯化后的9R-GFP-PHD蛋白来检测与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)和IP3的结合能力以及细胞膜上PIP2的动态变化。方法通过分子克隆技术将磷脂酶C-δ1的普列克同源域(PHD)、荧光蛋白GFP... 详细信息

目的通过原核细胞表达和纯化9R-GFP-PHD重组蛋白,并利用纯化后的9R-GFP-PHD蛋白来检测与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)和IP3的结合能力以及细胞膜上PIP2的动态变化。方法通过分子克隆技术将磷脂酶C-δ1的普列克同源域(PHD)、荧光蛋白GFP及细胞穿膜多肽9R融合以构建相应蛋白表达载体。利用原核表达体系BL21大肠埃希菌和镍柱进行重组蛋白的表达和纯化,其中GFP和9R-GFP为9R-GFP-PHD的对照蛋白。获取重组蛋白后,通过同位素实验和液体闪烁计数器,分别检测和比较GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD与[3H]标记的PIP2和IP3的结合能力以及之间的竞争性抑制。另外,利用MDCK细胞检测和比较孵育的GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD后,3种重组蛋白在细胞内的分布情况。通过图片相减处理和荧光实时定量分析MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD在ATP刺激后分布的动态变化,从而间接反映细胞膜上PIP2的水解变化。结果通过原核表达和镍柱纯化体系顺利获得了GFP、9R-GFP和9R-GFP-PHD重组蛋白。体外结合实验证实9R-GFP-PHD与PIP2和IP3均有很强的结合能力,而且IP3能竞争性抑制9R-GFP-PHD与PIP2的结合。在孵育了3种荧光融合蛋白后,荧光共聚焦显微镜观察发现9R-GFP主要分布在细胞质中,而9R-GFP-PHD特异性分布于细胞膜上。荧光实时定量分析显示,ATP刺激通过P2y受体激活磷脂酶C以水解PIP2,从而使MDCK细胞膜上的9R-GFP-PHD减少20%左右。结论本研究中构建的9R-GFP-PHD利用了细胞穿膜多肽、PHD与PIP2和IP3结合特性及GFP的荧光可视和定量分析特性,有效地检测细胞膜上PIP2的动态变化,将为今后进一步研究细胞内钙动员提供新的工具蛋白。

关键词： C型磷脂酶类穿膜多肽普列克同源域磷脂酰肌醇4,5-二磷酸肌醇1,4,5-三磷酸

六味地黄汤对2型糖尿病胰岛素抵抗模型大鼠肝脏GSK-3β信号因子的影响

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保健文汇 2019年第10期 230-232页

作者：吴沁璇王曼黄叶周意危永芳戴冰长沙医学院湖南中医药大学第一附属医院

目的:观察六味地黄汤对2型糖尿病(T2DM)模型大鼠肝脏组织中GSK3-β蛋白的影响。方法:采用高糖、高脂饲料喂养再行腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)且空腹血糖(FBG)≥16.7mmol/L的大鼠建立2型糖尿病动物模型,将其随机分为空白组、模型组、... 详细信息

目的:观察六味地黄汤对2型糖尿病(T2DM)模型大鼠肝脏组织中GSK3-β蛋白的影响。方法:采用高糖、高脂饲料喂养再行腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)且空腹血糖(FBG)≥16.7mmol/L的大鼠建立2型糖尿病动物模型,将其随机分为空白组、模型组、罗格列酮组、六味地黄汤组,模型组和空白组给予等量蒸馏水,4周后,测各组大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS),采用免疫蛋白印迹法(WesternBlot)测定各组大鼠肝脏中GSK3β总蛋白的表达情况。结果:六味地黄汤降低2型糖尿病大鼠FBG值及FINS水平,降低了GSK3β总蛋白的表达(P<0.05)。结论:六味地黄汤改善T2DM模型大鼠的胰岛素抵抗的作用机制可能与降低肝脏中GSK-3β蛋白的表达,促进糖原合成有关。

关键词：六味地黄汤 2型糖尿病胰岛素抵抗 GSK-3β

利用蛋白导入法沉默线粒体分裂调节蛋白Drp1的表达

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重庆医科大学学报 2014年第5期39卷 597-600页

作者：韩小建万玉英杨章坚张剑锋危永芳赖启南南昌大学转化医学研究院心血管实验室南昌330031 南昌大学第二附属医院院内感染科南昌330006

目的:表达和纯化3转录反式激活因子-RNA结合结构域(3 Trans-Activator of Transcription-RNA binding domain,3TATRBD)重组蛋白,并利用蛋白导入法将siRNA运输到细胞中进行基因沉默实验。方法:将双链RNA激活蛋白激酶PKR的RNA结合域(Moti... 详细信息

目的:表达和纯化3转录反式激活因子-RNA结合结构域(3 Trans-Activator of Transcription-RNA binding domain,3TATRBD)重组蛋白,并利用蛋白导入法将siRNA运输到细胞中进行基因沉默实验。方法:将双链RNA激活蛋白激酶PKR的RNA结合域(Motif1)与细胞穿膜多肽TAT融合构建3TAT-RBD,并通过原核表达体系进行目的蛋白的表达和纯化。获取重组3TATRBD蛋白后,利用非变性胶电泳检测3TAT-RBD与荧光标示Cy3-dsRNA的结合能力。利用蛋白导入法和荧光显微镜观察3TAT-RBD将Cy3-dsRNA导入胶质瘤细胞的效率。在细胞水平检测和比较3TAT-RBD和Lipofectimine 2000将Cy3-dsRNA导入细胞的效率以及对沉默线粒体分裂蛋白动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)的效果。结果:通过原核表达体系获得3TAT-RBD重组蛋白,体外结合实验证实3TAT-RBD与双链dsRNA具有良好的结合能力。荧光显微镜观察也发现3TAT-RBD与Lipofectimine 2000均能将Cy3-dsRNA导入gli36胶质细胞。在RNA干扰实验中发现,3TAT-RBD和Lipofectimine2000均能有效地抑制Drp1的表达,Lipo+siRNA和3TAT-RBD+siRNA组Drp1的表达水平分别为对照组的36%和42%。结论:本研究中构建的3TAT-RBD利用了细胞穿膜多肽和RBD与dsRNA结合特性,有效地将siRNA导入细胞进行基因沉默实验,这将为今后RNA干扰实验提供新的工具。

关键词：穿膜多肽双链RNA激活蛋白激酶蛋白运输法 RNA干扰基因沉默

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重楼皂苷凝胶剂制备工艺研究

黑龙江科学 2024年第20期15卷 87-90页

作者：王志禹孙晴赵杰扬危永芳长沙医学院药学院、新型药物制剂研发湖南省重点实验室、湖南省“双一流”应用特色学科-药学长沙410219 长沙医学院口腔医学院长沙410219

通过体外透皮实验和处方优化等手段制备一种以重楼为主要成分的凝胶剂,对其载药量、质量控制、透皮吸收等进行全面考察。以卡波姆-940、丙二醇、PEG-400、薄荷脑、樟脑为辅料,采用冷溶法制备凝胶剂;通过载药量考察及质量考察对其配比进... 详细信息

通过体外透皮实验和处方优化等手段制备一种以重楼为主要成分的凝胶剂,对其载药量、质量控制、透皮吸收等进行全面考察。以卡波姆-940、丙二醇、PEG-400、薄荷脑、樟脑为辅料,采用冷溶法制备凝胶剂;通过载药量考察及质量考察对其配比进行优化。结果表明,最优处方配比为卡波姆-940∶丙二醇:PEG-400∶薄荷脑∶樟脑=1∶2∶4∶1.44∶2.34(质量比),按此配比所得凝胶剂质地均匀,黏稠度高,通过该工艺制备的重楼皂苷凝胶剂具有良好的成形性、可涂抹性,相对药理作用明显,胶粒分散均匀。

关键词：重楼皂苷凝胶剂载药量考察质量考察

姜黄素对毒胡萝卜素诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制

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中国药师 2019年第9期22卷 1606-1610页

作者：周碧兰危永芳李晴晴周意朱艳妮马宁长沙医学院药学院长沙410219

目的:研究姜黄素对毒胡萝卜素(TG)诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的保护作用,并探讨其机制是否与改善内质网应激有关。方法:复苏并传代培养SH-SY5Y细胞,将其分为5组:正常对照组、模型组(TG,0.05μmol·L-1)、姜黄素低(1μmol·L... 详细信息

目的:研究姜黄素对毒胡萝卜素(TG)诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的保护作用,并探讨其机制是否与改善内质网应激有关。方法:复苏并传代培养SH-SY5Y细胞,将其分为5组:正常对照组、模型组(TG,0.05μmol·L-1)、姜黄素低(1μmol·L-1)、中(10μmol·L-1)和高(50μmol·L-1)剂量组。采用MTT比色法检测SH-SY5Y细胞的存活率,Western blot法检测内质网应激反应中标志性分子伴侣蛋白GRP78和相关凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达水平,检测内质网应激反应中蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和肌醇依赖酶(IRE1)通路相关蛋白的表达水平。结果:与正常对照组相比,模型组SH-SY5Y细胞存活率显著降低(P<0.01),GRP78和CHOP蛋白均有增加的趋势,其中CHOP蛋白差异有统计学意义(P<0.05),p-PERK、磷酸化真核翻译起始因子2α(p-eIF2α)、IRE1α和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)蛋白均显著增加(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,姜黄素各剂量组的SH-SY5Y细胞存活率显著升高,GRP78、CHOP、p-eIF2α和IRE1α蛋白显著降低(P<0.05或P<0.01),姜黄素中剂量组的p-PERK和p-JNK蛋白显著降低(P<0.05)。结论:姜黄素通过调控内质网应激反应中蛋白表达进而改善TG诱导的SH-SY5Y细胞损伤,发挥神经保护作用。

关键词：姜黄素毒胡萝卜素人神经母细胞瘤细胞内质网应激

Drp1介导的线粒体分裂在低氧诱导胶质母细胞瘤U251细胞迁移中的作用机制

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Drp1介导的线粒体分裂在低氧诱导胶质母细胞瘤U251细胞迁移中的作...

Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞活性氧产生及凋亡的影响

江西省第十三次中西医结合中医眼科学术交流会暨赣州市医学会眼科学会第八次学术会议

作者：廖明芳杨章坚危永芳尚蕾师胜兰胡扬扬李业如韩小建南昌大学附属眼科医院

目的:探讨Drp1介导的线粒体分裂在低氧诱导胶质母细胞瘤细胞迁移中的作用及其机制。方法:本实验选用了人胶质母细胞瘤细胞系(U251),实验采用三气培养箱(37℃,1%O2,5%CO,和94%N)来模拟肿瘤细胞所处的低氧微环境。为改变细胞内Drp1活性分...

目的:探讨Drp1介导的线粒体分裂在低氧诱导胶质母细胞瘤细胞迁移中的作用及其机制。方法:本实验选用了人胶质母细胞瘤细胞系(U251),实验采用三气培养箱(37℃,1%O2,5%CO,和94%N)来模拟肿瘤细胞所处的低氧微环境。为改变细胞内Drp1活性分别进行了siRNA干扰敲低U251细胞Drp1的表达、Drp1抑制剂Mdivi-1预处理、过表达GFP-Drp1或显

关键词：

来源： cnki会议评论

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生物化工 2020年第1期6卷 46-48页

作者：危永芳董佳瑶吴沁璇周碧兰吴昭全长沙医学院药学院

采用流式Annexin V-FITC/PI双染法检测对照组、DDP(顺铂)处理组、Mdivi-1+DDP处理组三组L1210细胞凋亡情况,用荧光探针DCFH-DA检测各组细胞内ROS水平,探讨Mdivi-1对顺铂诱导L1210细胞活性氧产生及细胞凋亡的影响。结果表明与对照组相比,... 详细信息

采用流式Annexin V-FITC/PI双染法检测对照组、DDP(顺铂)处理组、Mdivi-1+DDP处理组三组L1210细胞凋亡情况,用荧光探针DCFH-DA检测各组细胞内ROS水平,探讨Mdivi-1对顺铂诱导L1210细胞活性氧产生及细胞凋亡的影响。结果表明与对照组相比,DDP处理组L1210细胞凋亡数量明显增加,且细胞内ROS水平明显升高;Mdivi-1+DDP处理组细胞凋亡数量及ROS产生较DDP处理组均明显减少。Mdivi-1可抑制顺铂诱导的L1210细胞ROS产生及细胞凋亡。

关键词： Mdivi-1 顺铂细胞凋亡活性氧