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大肠杆菌黏附素EtpA酵母工程菌对肠道菌群和黏膜免疫的影响

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大肠杆菌黏附素EtpA酵母工程菌对肠道菌群和黏膜免疫的影响

作者：卢晓冉中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)属于致病性大肠杆菌的一种,常因食物及水源的污染而引发人和动物的感染,特别是在初生动物中有很高的发病率、死亡率,制约了养殖行业的发展,同时威胁了人类的健康。研究发现,... 详细信息

产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)属于致病性大肠杆菌的一种,常因食物及水源的污染而引发人和动物的感染,特别是在初生动物中有很高的发病率、死亡率,制约了养殖行业的发展,同时威胁了人类的健康。研究发现,其主要致病因子是肠毒素和黏附素。Etp A属于黏附素中的一种,分子量较大,能与肠上皮细胞上的特异性受体结合,在细菌和肠壁之间形成分子桥,介导ETEC的黏附。EtpA在不同血清型的ETEC中表达高度保守,同源性很高。另有实验证实,Etp A具有良好的免疫原性,能够有效阻止ETEC对肠道上皮细胞的黏附。这一发现为预防ETEC引起的动物腹泻,开拓了新的思路。为了降低由ETEC造成的经济损失,减弱ETEC对动物健康的损害,在寻找有效的预防办法的同时,提高动物的免疫功能也至关重要。动物肠道面积巨大,其中聚居着数量庞大的微生物菌群称为肠道菌群;肠道黏膜还拥有丰富的免疫细胞及免疫分子,参与构成机体抵御病原微生物侵入的肠道黏膜免疫系统。其中有益菌群的增加能调节肠道菌群结构的稳定性,丰富菌群多态性,促进肠道黏膜生长,刺激肠黏膜分泌免疫分子,提高肠道黏膜免疫功能,帮助机体抵御病原微生物的侵袭。酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是酵母菌科(Saccharomycetaceae),酵母菌属(Saccharomycodes)的成员,属于益生菌的一种。在研究其益生作用时发现,它含有丰富的营养物质和未知生长因子,能提高动物的生产性能,促进肠道黏膜发育,增加有益菌群的数量,增强肠道黏膜免疫功能。本课题组通过基因克隆、同源重组等技术,使大肠杆菌黏附素Etp A在酿酒酵母菌中高效表达,成功构建出Etp A酵母工程菌。并在细胞实验中发现,Etp A酵母工程菌能有效阻止ETEC对肠上皮细胞的黏附,具有保护上皮细胞的作用。本研究在此基础上进行了以下实验:1.本研究选取断奶日龄21d的SPF级健康SD大鼠120只,雌雄各半。随机分为3组:空白对照组、酿酒酵母菌组(以下简称为酿酒酵母组)、Etp A酵母工程菌组(以下简称为Etp A组),每组40只,雌雄各半。实验期间分别给3组大鼠灌服生理盐水、107 CFU/mL酿酒酵母菌菌液、107 CFU/mL Etp A酵母工程菌菌液,每天1次,每次2mL/只,共持续28d;然后连续3d灌服108 CFU/mL大肠杆菌(H10407)菌液,每天1次,每次5mL/只。分别于实验第7、14、21、28d和结束灌服大肠杆菌菌液3d后,取各组大鼠粪便。通过末端限制性片段长度多态性(t-rflp)、实时荧光定量pcr、ph值检测技术,研究了etpa酵母工程菌对肠道菌群otu(微生物可操作单元)和ph值的影响,以及对肠道重要菌群:类杆菌(bacteriodes)、梭菌(clostridium)、肠球菌(enterococcus)、双歧杆菌(bifidobacterium)、乳杆菌(lactobacillaceae)数量的影响。2.本研究分别于实验第7、14、21、28d和结束灌服大肠杆菌菌液3d后,采集大鼠十二指肠、空肠、回肠组织。通过组织切片观察、酶联免疫吸附实验(elisa)、实时荧光定量pcr技术研究了etpa酵母工程菌对十二指肠、空肠、回肠绒毛长度、宽度、肠隐窝深度、绒毛长度/隐窝深度(v/c)的影响;对肠道黏膜中重要免疫分子:分泌型免疫球蛋白a(siga)、白介素-2(il-2)、白介素-4(il-4)及干扰素-γ(ifn-γ)分泌量的影响。实验结果如下:***酵母工程菌对肠道菌群的影响:(1)etpa酵母工程菌对肠道菌群多态性的影响:酿酒酵母组和etpa组的otu值在7、14、21、28d均高于空白对照组,并在第14d达到最大值,均与空白对照组差异极显著(p0.05)。灌服etec后,etpa组与灌服前无明显差异(p>0.05),且显著高于酿酒酵母组(p0.05)。灌服etec后,etpa组与灌服前无明显差异(p>0.05),且极显著高于酿酒酵母组和空白对照组(p0.05)。灌服etec后,仅有空白对照组显著高于灌服前(p<0.

关键词： EtpA酵母工程菌肠道菌群肠道黏膜免疫

狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及多克隆抗体的制备

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病毒学报 2016年第4期32卷 472-477页

作者：郑光来卢晓冉张静远陈腾王东方严妍张守峰扈荣良军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体。本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT-PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac I中,获取的重组质粒pFastbac I-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac ***... 详细信息

为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体。本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT-PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac I中,获取的重组质粒pFastbac I-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac ***感受态中,以获取重组穿梭质粒Bacmid-M。用lipofectamine2000介导Bacmid-M转染Sf9细胞获取重组杆状病毒AcMNPV-M。用抗His标签的单体、犬抗RV阳性血清及兔抗RV阳性血清通过Western-Blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,用Western-Blot和FAVN试验鉴定多克隆抗体的反应原性及其病毒中和效价。结果表明:(1)利用杆状病毒表达系统成功的表达了大小约为25kD的重组M蛋白;(2)重组M蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;(3)制备的多克隆抗体与狂犬病病毒BD06、SRV 9、CVS-24、ERA、PV 2061及aG株的M蛋白均能发生特异性反应,但其无病毒中和能力。本研究完成了重组M蛋白的表达、纯化并制备了其多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了物质基础。

关键词：狂犬病病毒基质蛋白杆状病毒表达纯化多克隆抗体

水合物法分离气体的促进剂及促进机理研究进展

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工程科学学报 2021年第1期43卷 33-46页

作者：王兰云谢辉龙卢晓冉徐永亮王燕李瑶魏建平河南理工大学安全科学与工程学院焦作454003 河南省瓦斯地质与瓦斯治理重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地焦作454003 煤炭安全生产与清洁高效利用省部共建协同创新中心焦作454003

目前添加促进剂后水合物形成机理并无统一定论,本文详细阐述了气体水合物形成的降低表面张力理论、临界胶束理论、毛细效应理论、模板效应理论和表面疏水效应理论等促进机理,综述了传统促进剂(THF、CP、SDS)、生物环保型促进剂(氨基酸... 详细信息

目前添加促进剂后水合物形成机理并无统一定论,本文详细阐述了气体水合物形成的降低表面张力理论、临界胶束理论、毛细效应理论、模板效应理论和表面疏水效应理论等促进机理,综述了传统促进剂(THF、CP、SDS)、生物环保型促进剂(氨基酸、淀粉),尤其是离子液体在气体水合物形成相平衡实验、动力学规律和促进机理方面的应用研究进展,阐述了离子液体半笼型水合促进剂在混合气体分离方面的研究现状,指出应从促进剂结构性质及其在水相中的聚集形态入手,研究促进剂−气体−水之间的分子间作用力,建立各类气体水合物促进剂的筛选体系.

关键词：水合物气体分离离子液体促进机理促进剂

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济南园区经济总体保持平稳 002

猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

济南日报

作者：王爽卢晓冉

本报5月15日讯(记者王爽实习生卢晓冉)全市工业园区经济发展现场会今天在高新区和章丘市召开。从会上获悉，今年以来，我市各省级以上园区积极应对金融危机冲击造成的严峻经济形势和各种复杂局面，园区经济总体保持平稳。　　截至3...

本报5月15日讯(记者王爽实习生卢晓冉)全市工业园区经济发展现场会今天在高新区和章丘市召开。从会上获悉，今年以来，我市各省级以上园区积极应对金融危机冲击造成的严峻经济形势和各种复杂局面，园区经济总体保持平稳。　　截至3月底，我市8个省以上工业园区和出口加

关键词：

来源： cnki报纸评论

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中国生物制品学杂志 2016年第7期29卷 686-689,695页

作者：郑光来卢晓冉张静远陈腾王东方严妍张守峰扈荣良军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

目的在毕赤酵母中分泌表达猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白。方法将PCV2-Cap蛋白基因(Gen Bank登录号:KC620508.1)按毕赤酵母偏好密码子优化后,插入毕赤酵母分泌型表达载体p PICZαA中,重组质粒p PICZαA-Cap经SacⅠ... 详细信息

目的在毕赤酵母中分泌表达猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白。方法将PCV2-Cap蛋白基因(Gen Bank登录号:KC620508.1)按毕赤酵母偏好密码子优化后,插入毕赤酵母分泌型表达载体p PICZαA中,重组质粒p PICZαA-Cap经SacⅠ线性化,通过电击转化整合至毕赤酵母GS115菌株的基因组中,构建p PICZαA-CapGS115重组酵母菌。经甲醇诱导表达重组Cap蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA法进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-Cap经双酶切和测序证明构建正确;重组酵母菌p PICZαA-Cap-GS115经菌落PCR鉴定,可扩增出1 001 bp的目的基因片段;表达的重组Cap蛋白相对分子质量约49 000,可与猪圆环2型阳性血清和小鼠抗His单克隆抗体发生特异性反应。结论成功利用毕赤酵母表达系统分泌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原性,为PCV2亚单位疫苗和ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白毕赤酵母分泌表达

貂圆环病毒Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

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中国兽医科学 2015年第12期45卷 1266-1269页

作者：郑光来卢晓冉连海张守峰刘晔扈荣良军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

为研制水貂圆环病毒(MiCV)亚单位疫苗或建立相关诊断技术,利用常规PCR扩增出优化后的貂圆环病毒Cap蛋白基因序列,并插入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中。获得的重组表达载体pPICZαA-Cap以SacⅠ进行线性化后,经电击转化整合入毕赤酵... 详细信息

为研制水貂圆环病毒(MiCV)亚单位疫苗或建立相关诊断技术,利用常规PCR扩增出优化后的貂圆环病毒Cap蛋白基因序列,并插入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中。获得的重组表达载体pPICZαA-Cap以SacⅠ进行线性化后,经电击转化整合入毕赤酵母GS115菌株中,用含Zeocin的YPD平板筛选出重组子pPICZαA-Cap-GS115。PCR、SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定的结果显示,貂圆环病毒Cap蛋白成功在毕赤酵母中分泌表达。

关键词：貂圆环病毒毕赤酵母分泌表达

布鲁氏菌新型多重PCR方法的建立与初步应用

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黑龙江畜牧兽医 2016年第4期 176-180,288页

作者：李争李诗语卢晓冉沙洲程慧敏卜昭阳郎需龙吴大成王兴龙吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130062 广东省农业科学院动物卫生研究所广州510640

布鲁氏菌病是一种分布于世界各地,由革兰氏阴性布鲁氏菌引起的人兽共患病[1]。现已发现10个种,其中流行广泛、影响较大的是羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、猪布鲁氏菌,对人兽危害最为严重,传统检测布鲁氏菌病的方法是通过病原分离、血清学诊断... 详细信息

布鲁氏菌病是一种分布于世界各地,由革兰氏阴性布鲁氏菌引起的人兽共患病[1]。现已发现10个种,其中流行广泛、影响较大的是羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、猪布鲁氏菌,对人兽危害最为严重,传统检测布鲁氏菌病的方法是通过病原分离、血清学诊断等[2],这些方法的病原分离周期长、阳性率低甚至致使兽医相关人员感染。

关键词：血清学诊断试管凝集试验补体结合临床样本鲍氏不动杆菌人兽共患病病原分离金黄色葡萄球菌传统检测周期长

ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响

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黑龙江畜牧兽医 2017年第10期 46-51,56,290页

作者：沙洲李诗语卢晓冉王莉卜昭阳王兴龙吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122

为了研究ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响,试验将90只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、工程菌组及酵母菌组,分别灌服生理盐水、工程菌菌液、酿酒酵母菌菌液,持续21 d后连续3 d灌服大肠杆菌H10407菌液,分别收集灌胃7,14,21天... 详细信息

为了研究ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响,试验将90只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、工程菌组及酵母菌组,分别灌服生理盐水、工程菌菌液、酿酒酵母菌菌液,持续21 d后连续3 d灌服大肠杆菌H10407菌液,分别收集灌胃7,14,21天及攻毒后的各组大鼠粪便,提取粪便细菌DNA,利用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)、实时荧光定量PCR检测了ST酿酒酵母基因工程菌对肠道菌群微生物可操作单元(OTU)和肠道5种重要细菌(类杆菌、梭菌、肠球菌、双歧杆菌和乳杆菌)数量的变化,并测定了肠道菌群pH值。结果表明:在灌胃期间,工程菌组及酵母菌组的OTU值和双歧杆菌、梭菌数量极显著高于空白对照组(P<0.01),其他细菌数量均不同程度升高。各组pH值均呈现下降趋势,第21天时,工程菌组及酵母菌组pH值极显著低于空白对照组(P<0.01)。攻毒产肠毒素大肠杆菌后,工程菌OTU值和类杆菌、乳杆菌、双歧杆菌数量均极显著高于其他两组(P<0.01),pH值极显著高于空白对照组(P<0.01)。与灌服前相比,工程菌组的OTU值、细菌数量及pH值均变化幅度最小。说明ST酿酒酵母基因工程菌能够改善肠道菌群结构,丰富肠道菌群多态性,降低pH值,增加有益菌群的数量。当动物机体受到产肠毒素大肠杆菌感染时,ST酿酒酵母基因工程菌能够有效降低产肠毒素大肠杆菌对肠道菌群的破坏,发挥预防保护作用,维持肠道内菌群稳定。

关键词： ST酿酒酵母基因工程菌末端限制性片段长度多态性实时荧光定量PCR pH值肠道菌群

TiO_(2)光催化强化[HO_(2)MMim][HSO_(4)]-H_(2)O_(2)脱除煤中有机硫的研究

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工程科学学报 2023年第1期45卷 72-81页

作者：王兰云温兴琳刘泽健张亚娟卢晓冉刘真周华健徐永亮河南理工大学安全科学与工程学院焦作454003 煤炭安全生产与清洁高效利用省部共建协同创新中心焦作454003 河南省瓦斯地质与瓦斯治理重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地焦作454003 南京工业大学安全科学与工程学院南京211806

燃煤中的硫严重影响了煤炭的高效利用,将光催化氧化引入到萃取脱硫体系,可以显著地提高离子液体萃取脱硫效率.为了进一步研究脱硫机理,采用实验结合计算机仿真模拟对其进行了分析.实验结果表明将光催化反应过程与离子液体萃取过程耦合,... 详细信息

燃煤中的硫严重影响了煤炭的高效利用,将光催化氧化引入到萃取脱硫体系,可以显著地提高离子液体萃取脱硫效率.为了进一步研究脱硫机理,采用实验结合计算机仿真模拟对其进行了分析.实验结果表明将光催化反应过程与离子液体萃取过程耦合,可有效脱除煤中的有机硫,[HO_(2)MMim][HSO_(4)]−H_(2)O−H_(2)O_(2)−TiO_(2)(质量比5∶5∶10∶4)光催化处理后的煤的有机硫脱硫率最高可达12.40%.Materials Studio分析得出由光催化产生的羟基自由基(·OH)具有较强的氧化性,·OH的氧原子附近所在区域呈负电性,容易与噻吩中S原子的正电势点产生静电力并形成S=O双键;另外,离子液体的加入使得原本噻吩环上的最低空轨道消失,还降低了最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占分子轨道(LUMO)的能级差,使反应更容易进行.使用COSMO软件分析发现离子液萃取作用体现在[HO_(2)MMim][HSO_(4)]中咪唑的五元杂环结构通过范德华力与噻吩、砜分子之间成键,使硫化物不断被萃取到离子液体相中;外加氧化剂使反应中化学势较高的砜比噻吩更容易进入到化学势低的离子液[HO_(2)MMim][HSO_(4)]中.

关键词：光催化氧化脱硫噻吩砜羟基自由基 Materials Studio COSMO