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液相色谱-串联质谱法检测血清中15种甾体激素的动态变化

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色谱 2017年第4期35卷 421-426页

作者：童鸿斌童海江卢德赵浙江中医药大学浙江杭州310053 绍兴第二医院检验科浙江绍兴312000

建立了用液相色谱-串联质谱检测血清中15种甾体激素的方法。在血清样品中加入含内标的乙腈沉淀蛋白质后,用100 mmol/L盐酸羟胺衍生,经Agilent-C18柱(50 mm×3.0 mm,2.7μm)分离,内标法定量。质谱分析采用电喷雾电离(ESI)正离子扫描,多... 详细信息

建立了用液相色谱-串联质谱检测血清中15种甾体激素的方法。在血清样品中加入含内标的乙腈沉淀蛋白质后,用100 mmol/L盐酸羟胺衍生,经Agilent-C18柱(50 mm×3.0 mm,2.7μm)分离,内标法定量。质谱分析采用电喷雾电离(ESI)正离子扫描,多反应监测(MRM)模式检测。数据显示,13种激素在0.05~20 ng/mL范围内线性关系良好(相关系数(R2)不小于0.995 6),检出限不大于1 ng/mL;皮质醇及脱氢表雄酮硫酸酯在50~2 000ng/mL范围内线性关系良好(R2不小于0.997 9),检出限不大于0.5 ng/mL。将该方法应用于女性月经周期激素变化规律的研究,结果表明,15种甾体激素在一个完整的月经周期内有不同特征的动态变化,其中雄激素在滤泡期的后期达到最高值,孕(雌)激素在黄体期达到最高值,而皮质激素则波动不明显。该方法灵敏度高、重复性好,为临床诊疗提供了参考。

关键词：液相色谱-串联质谱激素月经周期

水稻BADH和SAMDC基因的遗传转化及其耐盐性研究

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水稻BADH和SAMDC基因的遗传转化及其耐盐性研究

作者：卢德赵浙江大学

学位级别：硕士

土地盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题，是导致占世界三分之一灌溉区的广大盐碱地水稻减产的重要原因。我国受盐侵害的稻田约占栽培面积的五分之一，并且有日益扩大和加剧的趋势，造成的产量损失已难以估算。另外耕地面积的减... 详细信息

土地盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题，是导致占世界三分之一灌溉区的广大盐碱地水稻减产的重要原因。我国受盐侵害的稻田约占栽培面积的五分之一，并且有日益扩大和加剧的趋势，造成的产量损失已难以估算。另外耕地面积的减少和淡水资源的不足将迫使人们开发和利用大面积的盐碱地和沿海的滩涂地带。因此植物耐盐的机理的研究和耐盐植物的培育将成为相关学科研究的热点。为了缓减盐对植物细胞的损伤，许多植物细胞都积累一些称为渗透调节剂的小分子有机物如甜菜碱，多胺，甘露碱。如果将编码有关这些渗透调节剂的基因转入水稻，能够提高转基因水稻的耐盐性。本文拟通过农杆菌介导法和基因枪法将BADH基因、SAMDC基因导入水稻常规品种中，得到转基因水稻植株，以提高水稻的耐盐性，主要结果如下： 1．本实验对5个水稻品种进行了基因转化，受体材料为来源于幼胚和成熟胚的胚性愈伤组织，共得到3个品种、计263株转基因植株。不同基因型间转化效率存在较大差异，尤其是较易转化品种台北309与较难转化品种752的转化效率相差达18倍;对基因枪法而言，随着质粒DNA长度增加，其转化效率呈现下降的趋势。此外，本文还对基因枪法和农杆菌介导法两种转化方法进行了比较。 2．对Kan和G418的筛选效果进行了比较，Kan对于水稻的愈伤组织的生长抑制作用并不明显，而100mg／L的G418基本能抑制水稻愈伤的生长。所以对于水稻转基因来说，如果用NptⅡ作为标记基因，应该采用G418作为筛选剂。除G418外，50mg/L的潮霉素也能完全抑制水稻愈伤生长。 3．应用PCR扩增方法可以初步获得目的基因整合到转基因植株基因组中的分子证据。转BADH基因植株的Southern-blot分析说明：BADH基因已经整合到大部分转基因的水稻植株基因组中。不论是用基因枪法还是农杆菌介导法获得的转基因植株，均表现为多位点插入，拷贝数一般在5个以上。对来源于同一克隆的几棵转基因植株的Southern分析表明，其整合方式完全一致。 4．BADH酶活性分析表明：转BADH基因水稻植株都检测到了BADH酶活性，而对照没有检测到，但不同转基因个体间BADH酶活性差异很大。经盐胁迫的转基因水稻BADH 酶活性显著提高，其活性值在250U—300U之间，株系间差异很小。 5．转基因植株在0．5％的盐池中能正常生长，而对照的生长受到抑制，两周后整株都发黄并在三周后死亡。不同转BADH基因水稻株系的耐盐能力相近，可能原因是盐胁迫后水稻 BADH酶活性相近，这也说明BADH酶活性与耐盐能力正相关。转基因水稻植株所结种子的耐盐能力也显著提高。在0．5％NaCI或08％NaCI胁迫下，转基因种子的根系和茎叶生长情况大大优于未转基因的对照。 6．对几个转基因株系的遗传分析表明，转BADH基因植株L群体中BADH基因能够按孟德尔法则在转基因后代中分离，尽管外源基囚以多拷贝的形式整合到水稻植株基因组中。

关键词：水稻 BADH基因 SAMDC基因遗传转化耐盐性

非小细胞肺癌顺铂耐药相关基因生物信息学研究

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中国肿瘤生物治疗杂志 2020年第11期27卷 1278-1283页

作者：朱立戴五敏卢德赵浙江中医药大学生命科学学院浙江杭州310053 中国科学院大学附属肿瘤医院(浙江省肿瘤医院) 中国科学院基础医学与肿瘤研究所医学工程部浙江杭州310022 中国科学院大学附属肿瘤医院(浙江省肿瘤医院) 中国科学院基础医学与肿瘤研究所实验研究中心浙江杭州310022

目的:通过分析非小细胞肺癌顺铂敏感株及耐药株的基因芯片表达数据,筛选差异基因及关键通路,构建蛋白相互作用网络,探讨关键集群功能。方法:从GEO数据库获得基因芯片表达数据,利用GEO2R工具筛选差异基因,通过STRING数据库和Cytoscape软... 详细信息

目的:通过分析非小细胞肺癌顺铂敏感株及耐药株的基因芯片表达数据,筛选差异基因及关键通路,构建蛋白相互作用网络,探讨关键集群功能。方法:从GEO数据库获得基因芯片表达数据,利用GEO2R工具筛选差异基因,通过STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白相互作用网络,经DAVID富集得到相关特征基因与信号通路信息。结果:通过芯片分析共获得481个差异表达基因,相比于敏感细胞株,顺铂获得性耐药细胞株中有418个上调基因和63个下调基因。差异基因功能主要富集在piRNA代谢、DNA甲基化修饰、细胞有丝分裂及细胞周期进程等信号通路。蛋白复合物预测得到主要功能集群6个,分别与细胞趋化性、细胞角化性、piRNA代谢过程、细胞因子受体相互作用、细胞因子分泌调节及染色质沉默相关生物进程相关。结论:本研究利用生物信息学方法,发现顺铂耐药细胞株特征基因及信号通路,其中SAA1、KRT5、TDRD9、BCL2A1、CSF1R和HIST1H1A等显著上调基因及其功能集团可能是非小细胞肺癌顺铂耐药的潜在分子机制,为临床精准治疗提供新的理论依据。

关键词：非小细胞肺癌顺铂耐药差异基因生物信息学分析

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寒凉药对热证大鼠肝线粒体蛋白质组的影响

中国中药杂志 2013年第23期38卷 4144-4147页

作者：李毅卢德赵唐利华沃兴德杨贞浙江中医药大学生命科学学院浙江杭州310053

自20世纪60年代起,现代科学开始对热证的本质进行研究,但有关热证的病理机制和寒凉药物的作用机制等尚未深入系统研究。该研究以具有代表性的热性中药喂饲动物造成热证模型,后用寒凉药进行实验性治疗,拟采用双向电泳及质谱分析技术对热... 详细信息

自20世纪60年代起,现代科学开始对热证的本质进行研究,但有关热证的病理机制和寒凉药物的作用机制等尚未深入系统研究。该研究以具有代表性的热性中药喂饲动物造成热证模型,后用寒凉药进行实验性治疗,拟采用双向电泳及质谱分析技术对热证模型大鼠及寒凉药治疗后的大鼠肝线粒体蛋白组进行比较,从中发现热证及寒凉药治疗后的特异性相关蛋白质。

关键词：寒凉药热证线粒体蛋白质组

温热中药对寒症模型大鼠肝线粒体蛋白质组的影响

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中草药 2014年第3期45卷 373-379页

作者：李毅杨贞许健唐利华沃兴德卢德赵浙江中医药大学生命科学学院浙江杭州310053

目的应用双向电泳和质谱技术研究温热中药对寒证模型大鼠肝线粒体蛋白质组的影响,阐述寒证与能量代谢的关系及温热中药的作用。方法提取正常大鼠、寒证模型大鼠和温热中药治疗后大鼠的肝线粒体蛋白质,经双向电泳分离后获得蛋白质组图谱,... 详细信息

目的应用双向电泳和质谱技术研究温热中药对寒证模型大鼠肝线粒体蛋白质组的影响,阐述寒证与能量代谢的关系及温热中药的作用。方法提取正常大鼠、寒证模型大鼠和温热中药治疗后大鼠的肝线粒体蛋白质,经双向电泳分离后获得蛋白质组图谱,用Image Master 2D 6.0软件进行差异蛋白质分析,筛选出差异蛋白,进行质谱鉴定,用Western blotting法验证差异蛋白的表达。结果寒证大鼠肝线粒体中H+转运ATP合酶、电压依从性阴离子选择性通道蛋白1(VDAC)表达量增加,伴侣素groEL、丝氨酸蛋白酶抑制剂、Tu转运延伸因子、乙醛脱氢酶、二甲基甘氨酸脱氢酶、脂酰辅酶A脱氢酶、热休克蛋白60、酰基辅酶A脱氢酶、丝氨酸蛋白酶、电子传递黄素蛋白、腺苷酸激酶、DJ-1蛋白、羧酸酯水解酶、氨甲酰磷酸合成酶1表达量降低;应用温热中药治疗后F1-ATP合酶、H+转运ATP合酶表达量降低,丙酰辅酶A羧化酶、二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、Tu转运延伸因子、乙酰辅酶A酰基转移酶、脂酰辅酶A脱氢酶、丝氨酸蛋白酶、丙酮酸脱氢酶、3-巯基丙酮酸硫基转移酶、40 S核糖体蛋白、热休克蛋白1、烯酰辅酶A水解酶表达量增加。结论寒证模型大鼠线粒体内脂肪酸的β-氧化受阻,蛋白质的合成、折叠及分泌障碍,类固醇激素减少影响糖代谢,导致能量不足。应用温热中药治疗后,糖、脂代谢增强、蛋白质合成增加导致能量代谢活跃。

关键词：寒证温热中药线粒体蛋白质组能量代谢

温补肾阳药对甲状腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响

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中国中药杂志 2009年第10期34卷 1251-1256页

作者：卢德赵沃兴德沃立科李毅唐利华杨贞浙江中医药大学生命科学学院浙江杭州310053

目的:研究温补肾阳药对肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组的影响。方法:12只SD大鼠,随机分为3组,每组4只。模型组和治疗组切除两侧甲状腺,正常组做相应的假手术,但不切除甲状腺。喂养7 d后模型组和治疗组大鼠出现拱背耸毛、大便稀溏等肾阳虚... 详细信息

目的:研究温补肾阳药对肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组的影响。方法:12只SD大鼠,随机分为3组,每组4只。模型组和治疗组切除两侧甲状腺,正常组做相应的假手术,但不切除甲状腺。喂养7 d后模型组和治疗组大鼠出现拱背耸毛、大便稀溏等肾阳虚的症状。从第8天开始,治疗组每天喂饲温补肾阳药1次,给药剂量6.7 g.kg-1,其他2组喂饲等体积的生理盐水,连续6 d后,断头处死3组大鼠,分离提取其肝线粒体蛋白质,分别用荧光染料Cy3,Cy5标记,每个Cy3及Cy5标记的样品与等量Cy2标记的内标混合后在同一块凝胶中进行电泳分离,经不同光激发后扫描得到不同样品的蛋白质组图谱。经DeCyder 6.5软件进行差异蛋白质组分析,并对差异蛋白质进行质谱鉴定。结果:双向电泳后,平均每块胶检测到997个蛋白质点,其中所有图谱共有的点有687个,并从中筛选到22个差异蛋白,其中热休克蛋白60、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物、氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ,ATP合成酶、乳铁传递蛋白、ATP酶质子通道蛋白、电子传递黄素蛋白和类钙离子激活中性蛋白酶12在肾阳虚状态下表达量均增加,而二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、脂酰辅酶A脱氢酶、鸟氨酸转氨酶和GTP结合调节蛋白在肾阳虚状态下表达量均降低。经温补肾阳药治疗后,热休克蛋白60、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物、ATP合成酶、乳铁传递蛋白、ATP酶质子通道蛋白、电子传递黄素蛋白二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、脂酰辅酶A脱氢酶和GTP结合调节蛋白表达量均增加,而氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ和类钙离子激活中性蛋白酶12表达量减少。结论:温补肾阳药可能通过调节物质代谢、保护线粒体膜稳定性和维护细胞内信号传导而起到治疗肾阳虚的作用。

关键词：蛋白质组肾阳虚温补肾阳药线粒体

隐丹参酮通过调节SIRT3/HIF-1α信号轴和线粒体自噬抑制MDA-MB-231细胞增殖迁移的研究

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中药材 2020年第1期43卷 193-196页

作者：宋晓璐乐翊飞卢德赵浙江中医药大学生命科学学院浙江杭州310053

目的:研究隐丹参酮对MDA-MB-231细胞SIRT3/HIF-1α信号通路和线粒体自噬的影响,探讨隐丹参酮抑制MDA-MB-231细胞增殖和迁移的机制。方法:培养三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231),分为空白对照组及隐丹参酮低(5μmol/L)、中(10μmol/L)、高(20... 详细信息

目的:研究隐丹参酮对MDA-MB-231细胞SIRT3/HIF-1α信号通路和线粒体自噬的影响,探讨隐丹参酮抑制MDA-MB-231细胞增殖和迁移的机制。方法:培养三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231),分为空白对照组及隐丹参酮低(5μmol/L)、中(10μmol/L)、高(20μmol/L)浓度组,Western blot检测各组细胞SIRT3、HIF-1α、VEGF、Parkin、PINK1蛋白表达;划痕实验检测各组细胞迁移率;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果:与空白对照组比较,隐丹参酮处理组SIRT3、Parkin、PINK1表达上调,HIF-1α、VEGF表达下调,MDA-MB-231迁移率显著降低,细胞凋亡率显著升高。结论:隐丹参酮可通过调节SIRT3/HIF-1α信号通路,促进线粒体自噬进而抑制MDA-MB-231细胞的增殖和迁移。

关键词：三阴性乳腺癌隐丹参酮线粒体自噬 SIRT3

环境浓度水平的苯并[b]荧蒽对巨噬细胞RAW264.7的作用

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环境科学学报 2017年第3期37卷 1133-1138页

作者：杨金焕宗磊贡晨雪卢德赵许颖龄胡潇王萃浙江中医药大学生命科学学院杭州310053

为了研究环境浓度下多环芳烃苯并[b]荧蒽对巨噬细胞RAW264.7的损伤情况,我们用MTT法检测苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞增殖活力的影响,用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)及炎症因子的释放量、细胞内SOD酶活力、脂质过氧化产物MDA含量及活性氧自... 详细信息

为了研究环境浓度下多环芳烃苯并[b]荧蒽对巨噬细胞RAW264.7的损伤情况,我们用MTT法检测苯并[b]荧蒽对RAW264.7细胞增殖活力的影响,用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)及炎症因子的释放量、细胞内SOD酶活力、脂质过氧化产物MDA含量及活性氧自由基ROS水平,用FITC标记的大肠杆菌(E.coli)检测苯并[b]荧蒽对巨噬细胞吞噬能力的影响.结果显示环境浓度(10~80 nmol·L^(-1))下的苯并[b]荧蒽能够抑制RAW264.7细胞的增殖活力,增加乳酸脱氢酶LDH的释放量.诱导活性氧自由基的形成,提高超氧化物歧化酶(SOD)活力及脂质过氧化产物MDA的含量.增加炎症因子IL-6,IL^(-1)β和TNF-a的分泌,降低吞噬能力.该研究结果表明,苯并[b]荧蒽对巨噬细胞RAW264.7具有一定的毒性作用;能够引起RAW264.7细胞产生氧化应激;激活炎症反应;降低巨噬细胞的吞噬能力.

关键词：苯并[b]荧蒽巨噬细胞细胞损伤细胞毒性

姜黄素及其衍生物对磷酸三苯酯引起HepG_2细胞脂质累积的保护作用

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中药材 2018年第11期41卷 2690-2693页

作者：郝正亮卢德赵杨贞王萃浙江中医药大学浙江杭州310053

目的:探究姜黄素及其衍生物二脱甲氧基姜黄素对磷酸三苯酯引起肝细胞脂质累积的保护作用及潜在机制,并比较二者的效果。方法:用不同浓度的磷酸三苯酯、姜黄素、二脱甲氧基姜黄素作用HepG_2细胞24 h后,MTT检测三者的细胞毒性,选择后续实... 详细信息

目的:探究姜黄素及其衍生物二脱甲氧基姜黄素对磷酸三苯酯引起肝细胞脂质累积的保护作用及潜在机制,并比较二者的效果。方法:用不同浓度的磷酸三苯酯、姜黄素、二脱甲氧基姜黄素作用HepG_2细胞24 h后,MTT检测三者的细胞毒性,选择后续实验浓度。总胆固醇、甘油三酯试剂盒检测细胞中脂质含量;油红O染色观察脂滴累积;实时荧光定量PCR检测脂质代谢相关基因表达。结果:磷酸三苯酯可升高细胞甘油三酯含量,增加细胞中的脂滴累积,该效应可被二脱甲氧基姜黄素及姜黄素逆转。姜黄素可抑制磷酸三苯酯诱导升高的DGAT2 mRNA表达,二脱甲氧基姜黄素可抑制DGAT2、ACC、FAS mRNA的表达。结论:姜黄素及其衍生物二脱甲氧基姜黄素可能通过抑制脂肪酸合成和甘油三酯生成等途径抑制磷酸三苯酯诱导的脂质累积,二脱甲氧基姜黄素的作用效果更为明显。

关键词：姜黄素衍生物磷酸三苯酯 HepG2细胞脂质代谢