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ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响

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黑龙江畜牧兽医 2017年第10期 46-51,56,290页

作者：沙洲李诗语卢晓冉王莉卜昭阳王兴龙吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122

为了研究ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响,试验将90只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、工程菌组及酵母菌组,分别灌服生理盐水、工程菌菌液、酿酒酵母菌菌液,持续21 d后连续3 d灌服大肠杆菌H10407菌液,分别收集灌胃7,14,21天... 详细信息

为了研究ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响,试验将90只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、工程菌组及酵母菌组,分别灌服生理盐水、工程菌菌液、酿酒酵母菌菌液,持续21 d后连续3 d灌服大肠杆菌H10407菌液,分别收集灌胃7,14,21天及攻毒后的各组大鼠粪便,提取粪便细菌DNA,利用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)、实时荧光定量PCR检测了ST酿酒酵母基因工程菌对肠道菌群微生物可操作单元(OTU)和肠道5种重要细菌(类杆菌、梭菌、肠球菌、双歧杆菌和乳杆菌)数量的变化,并测定了肠道菌群pH值。结果表明:在灌胃期间,工程菌组及酵母菌组的OTU值和双歧杆菌、梭菌数量极显著高于空白对照组(P<0.01),其他细菌数量均不同程度升高。各组pH值均呈现下降趋势,第21天时,工程菌组及酵母菌组pH值极显著低于空白对照组(P<0.01)。攻毒产肠毒素大肠杆菌后,工程菌OTU值和类杆菌、乳杆菌、双歧杆菌数量均极显著高于其他两组(P<0.01),pH值极显著高于空白对照组(P<0.01)。与灌服前相比,工程菌组的OTU值、细菌数量及pH值均变化幅度最小。说明ST酿酒酵母基因工程菌能够改善肠道菌群结构,丰富肠道菌群多态性,降低pH值,增加有益菌群的数量。当动物机体受到产肠毒素大肠杆菌感染时,ST酿酒酵母基因工程菌能够有效降低产肠毒素大肠杆菌对肠道菌群的破坏,发挥预防保护作用,维持肠道内菌群稳定。

关键词： ST酿酒酵母基因工程菌末端限制性片段长度多态性实时荧光定量PCR pH值肠道菌群

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犬布鲁氏菌菌壳疫苗的制备

中国畜牧兽医 2014年第1期41卷 38-43页

作者：钱晶尹秋丹卜昭阳陈思王兴龙王秀然郎需龙王晓旭吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

菌壳技术是一种新型的灭活疫苗制备方法,通过非变性的灭活方式保存细菌表面多个抗原表位,所制备的菌壳可作为预防细菌病的理想疫苗。本试验从噬菌体PhiX174DNA钓取裂解E基因,连接至温控原核表达载体pBV220,通过PCR在所构建的pBV220+E上... 详细信息

菌壳技术是一种新型的灭活疫苗制备方法,通过非变性的灭活方式保存细菌表面多个抗原表位,所制备的菌壳可作为预防细菌病的理想疫苗。本试验从噬菌体PhiX174DNA钓取裂解E基因,连接至温控原核表达载体pBV220,通过PCR在所构建的pBV220+E上扩增出蛋白裂解部件(protein lysis component,PLC),该部件包含阻遏蛋白cI857、溶菌E基因及终止序列rrnbT1T2,然后将其克隆至广宿主表达载体pBBR1MCS-2中,最终将构建的广宿主裂解质粒pBBR+PLC电转入犬布鲁氏菌RM6/66中。试验结果表明,经42℃诱导后,广宿主裂解质粒对犬布鲁氏菌RM6/66的裂解率达100%,成功制备了犬布鲁氏菌RM6/66菌壳疫苗。本试验通过菌壳技术制备的犬布鲁氏菌疫苗对预防宠物犬布鲁氏菌病起到重要作用,同时也对人兽布鲁氏菌疫苗的研制提供新策略。

关键词：犬布鲁氏菌菌壳疫苗

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羊布氏菌外膜蛋白10基因的原核表达

中国生物制品学杂志 2012年第1期25卷 39-42页

作者：李晓艳王景龙卜昭阳张瑞王兴龙军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122

目的原核表达并纯化羊布氏菌外膜蛋白10(Outer membrane protein,Omp10)。方法利用PCR技术扩增羊布氏菌16M株Omp10基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组原核表达质粒pET-28a-Omp10,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组O... 详细信息

目的原核表达并纯化羊布氏菌外膜蛋白10(Outer membrane protein,Omp10)。方法利用PCR技术扩增羊布氏菌16M株Omp10基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组原核表达质粒pET-28a-Omp10,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组Omp10经HisTrapTMFF纯化后,Western blot分析表达产物的反应原性。结果重组原核表达质粒pET-28a-Omp10经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组Omp10相对分子质量约15 000,能被羊布氏菌阳性血清所识别。结论已成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌Omp10,为羊布氏菌病血清学诊断方法的建立提供了材料。

关键词：羊布氏菌细菌外膜蛋白质类原核细胞基因表达诊断鉴别

ST融合蛋白的酵母表面展示及其对大鼠小肠黏膜结构的影响

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中国兽医学报 2018年第2期38卷 316-325页

作者：沙洲李诗语卢晓冉王莉卜昭阳王兴龙吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

本试验旨在获得能够将大肠杆菌ST融合蛋白展示在酿酒酵母表面的重组酿酒酵母基因工程菌并探究其对大鼠小肠黏膜结构的影响。将estA和estB基因克隆至pYD1质粒中，构建重组质粒pYD1-e5tA-estB，应用酵母表面展示技术获得EBY-100／pYD1-est... 详细信息

本试验旨在获得能够将大肠杆菌ST融合蛋白展示在酿酒酵母表面的重组酿酒酵母基因工程菌并探究其对大鼠小肠黏膜结构的影响。将estA和estB基因克隆至pYD1质粒中，构建重组质粒pYD1-e5tA-estB，应用酵母表面展示技术获得EBY-100／pYD1-estA-estB重组酵母基因工程菌。选取36只SPF级SD大鼠，随机分为空白对照组、工程菌组、酵母菌组，分别灌胃生理盐水、工程菌菌液、酿酒酵母菌菌液，持续灌胃21d后连续3d灌胃大肠杆菌H10407菌液，取各组大鼠的十二指肠、空肠、回肠制作切片，观察各段小肠绒毛的长度、宽度、隐窝深度及绒毛长度／隐窝深度（V／c）进行统计分析。利用EKISA、real—timePCR技术观察肠道黏膜中的SIgA、IL2、IL-4和IFN7含量变化。结果显示，通过免疫荧光试验证明大肠杆菌ST融合蛋白成功在酿酒酵母表面展示；灌胃21d时，与空白对照组相比，工程菌组及酵母菌组的十二指肠绒毛长度、v／c值显著升高（P〈0．01），工程菌组绒毛宽度显著升高（P〈0．05）；空肠绒毛长度、v／c值显著升高（P〈0．01），隐窝深度显著下降（P〈0．05）；工程菌组和酵母菌组的回肠绒毛长度及V／c值显著升高（P〈0．01）。灌胃大肠杆菌后，各组与灌胃前相比，空白对照组及酵母菌组的十二指肠与空肠绒毛长度、V／c值显著下降（P〈0．01），空肠隐窝深度显著升高（P〈0．01），回肠V／c值显著下降（P〈0．01）；工程菌组无明显变化。灌胃21d，工程菌组与酵母菌组的SIgA、IL-2、IL-4和IFN-7含量均显著高于空白对照组（P〈0．01）；攻毒大肠杆菌后，空白对照组及酵母菌组的SIgA、IL-2和IL-4含量均显著下降（P〈0．01），各组的IFN-γ含量显著升高（P〈0．01）。结果表明，EBY-100／pYD1-estA-estB重组酵母基因．72程菌不仅具有酵母菌的益生作用，能促进小肠黏膜发育，而且对产肠毒素大肠杆菌引起的肠道黏膜损伤有一定的保护作用。本试验为新型微生态制剂的研发提供依据。

关键词： ST 产肠毒素大肠杆菌酿酒酵母表面展示大鼠小肠黏膜

2型猪链球菌强毒株与无毒株胞外蛋白的双向电泳图谱比较分析

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中国预防兽医学报 2008年第4期30卷 250-254页

作者：张爱玲王兴龙李吉平冯书章张辉卜昭阳吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 军事兽医研究所吉林长春130062

利用双向电泳技术可以对体外培养的2型猪链球菌强毒株和无毒株进行胞外蛋白质组比较,寻找与毒力相关的蛋白质。2型猪链球菌强毒株和无毒株在无蛋白细菌培养液中37℃摇床培养16h,从培养物上清中获得胞外蛋白。第一向电泳用pH4-7线性IPG... 详细信息

利用双向电泳技术可以对体外培养的2型猪链球菌强毒株和无毒株进行胞外蛋白质组比较,寻找与毒力相关的蛋白质。2型猪链球菌强毒株和无毒株在无蛋白细菌培养液中37℃摇床培养16h,从培养物上清中获得胞外蛋白。第一向电泳用pH4-7线性IPG胶条进行等电聚焦,第二向电泳用SDS-PAGE凝胶再分离蛋白,经过考马斯亮蓝R350染色,图像扫描后,利用软件分析处理图像。在2型猪链球菌强毒株和无毒株的胞外蛋白质图谱中都分别检测出180±10个蛋白质斑点,它们的蛋白质分子质量分布基本相似;在所检测到的差异蛋白质斑点中,其中有50个蛋白斑点只存在于无毒株中而强毒株中不存在,有52个蛋白斑点只存在于强毒株中而无毒株中不存在,有7个蛋白斑点的表达量相差达5倍以上。这为研究2型猪链球菌的致病机理提供了蛋白质组学方面的信息。

关键词： 2型猪链球菌双向电泳蛋白质组胞外蛋白

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羊布氏菌vjbR基因的克隆及原核表达

中国生物制品学杂志 2013年第2期26卷 188-190,195页

作者：卜昭阳王景龙李晓艳万丽娜郎需龙万忠海孟柯音王兴龙军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林省人兽共患病控制与预防中心吉林长春130122 长春金赛药业有限责任公司吉林长春130000

目的克隆并原核表达羊布氏菌强毒株16M vjbR基因。方法 PCR扩增羊布氏杆菌16M株vjbR基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-vjbR,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF纯... 详细信息

目的克隆并原核表达羊布氏菌强毒株16M vjbR基因。方法 PCR扩增羊布氏杆菌16M株vjbR基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-vjbR,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF纯化后,进行Western blot分析。结果扩增的vjbR基因大小为708 bp,与预期一致;重组原核表达质粒pET-28a-vjbR经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,诱导4 h表达量可达6.84 mg/ml;纯化的重组蛋白纯度为65.7%,能被羊布氏杆菌阳性血清所识别。结论成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌VJBR蛋白,为其功能的研究、羊布病诊断试剂盒的研制及亚单位疫苗的研发奠定了基础。

关键词：羊布氏菌 vjbR基因密度感应系统克隆原核细胞基因表达

酿酒酵母及EtpA酿酒酵母基因工程菌对大鼠小肠黏膜结构的影响

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畜牧与兽医 2016年第2期48卷 1-6页

作者：卢晓冉王晓旭郑光来李诗语沙洲李争卜昭阳程慧敏王兴龙军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

为了调查酿酒酵母及Etp A酿酒酵母基因工程菌对大鼠小肠黏膜生长发育状况的影响,120只健康断奶SD大鼠,随机分为空白对照组、酿酒酵母菌组、Etp A酿酒酵母基因工程菌组,分别灌胃生理盐水、酿酒酵母菌液、Etp A酿酒酵母基因工程菌液2 m L/... 详细信息

为了调查酿酒酵母及Etp A酿酒酵母基因工程菌对大鼠小肠黏膜生长发育状况的影响,120只健康断奶SD大鼠,随机分为空白对照组、酿酒酵母菌组、Etp A酿酒酵母基因工程菌组,分别灌胃生理盐水、酿酒酵母菌液、Etp A酿酒酵母基因工程菌液2 m L/只,持续28 d后连续3 d灌胃大肠杆菌菌液。分别取7、14、21和28 d及灌胃大肠杆菌后大鼠的十二指肠、空肠、回肠制作石蜡切片,HE染色,显微镜下观察,记录各段小肠绒毛的宽度、长度、隐窝深度及绒毛长度/隐窝深度比值(V/C)。结果显示:1)与空白对照组相比,酿酒酵母菌组及Etp A酿酒酵母基因工程菌组的十二指肠绒毛长度、V/C在第21和28天时均显著升高(P0.05)。2)灌胃大肠杆菌后,与Etp A酿酒酵母基因工程菌组相比,空白对照组及酿酒酵母菌组的空肠绒毛长度、V/C均极显著下降(P<0.01);回肠V/C均显著下降(P<0.05)。结果表明:酿酒酵母和Etp A酿酒酵母基因工程菌均可以促进肠道黏膜发育,提高消化吸收能力;Etp A酿酒酵母基因工程菌对肠道黏膜的保护作用更显著。

关键词：酿酒酵母 EtpA酿酒酵母基因工程菌小肠黏膜结构

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正压防护头罩消毒效果评价方法研究

医疗卫生装备 2023年第9期44卷 33-37页

作者：孟轲音张珊珊骆万博卜昭阳姚腾万忠海杜鹏刘军军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所长春130118

目的:通过1%卫可消毒剂对正压防护头罩上犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的消毒效果试验,确立正压防护头罩的消毒效果评价方法。方法:依照《消毒技术规范》(2002版),结合1%卫可消毒剂特性选定中和剂,通过测定不同样品接种犬肾... 详细信息

目的:通过1%卫可消毒剂对正压防护头罩上犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的消毒效果试验,确立正压防护头罩的消毒效果评价方法。方法:依照《消毒技术规范》(2002版),结合1%卫可消毒剂特性选定中和剂,通过测定不同样品接种犬肾细胞后的半数组织培养感染剂量(TCID50)验证中和剂的有效性;在同一环境下,通过测定CIV在正压防护头罩上作用不同时间的TCID50验证病毒载体及环境对病毒活性的影响;通过建立病毒载体模型及病毒浸染与采样方法,结合病毒回收率测定结果(实时定量聚合酶链式反应法和酶联免疫吸附测定法)及病毒滴度测定结果[TCID50及鸡胚半数感染量(EID50)]确定最佳消毒时间。结果:0.1%卵磷脂+2%吐温80+0.5%硫代硫酸钠磷酸缓冲盐溶液可作为1%卫可消毒剂的中和剂;在不同时间节点,实验载体及环境均对CIV活性无影响;接种犬肾细胞样本及鸡胚样本平均回收率分别为96.12%和95.98%,1%卫可消毒剂灭活正压防护头罩上CIV的最佳作用时间为4 min。结论:该研究提出的正压防护头罩消毒效果评价方法有效,可为正压防护头罩确立最佳消毒条件。

关键词：正压防护头罩消毒效果评价犬流感病毒卫可消毒剂

羊布鲁菌强毒株16M与疫苗株M5外膜蛋白蛋白质组学研究

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中国兽医学报 2010年第10期30卷 1334-1342页

作者：杨艳玲盛雪玲唐婕郎需龙王景龙卜昭阳王兴龙吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062 吉林市丰满区畜牧兽医总站吉林吉林132108

通过比较蛋白质组学分析M5生存表型的改变所引起的蛋白图谱与强毒株的差异之处,根据这些差异表达蛋白的LC/MS-MS鉴定结果来分析疫苗株的致弱机制进而为寻找新的毒力相关分子、鉴别诊断分子以及揭示布鲁菌胞内寄生机制提供帮助。本研究... 详细信息

通过比较蛋白质组学分析M5生存表型的改变所引起的蛋白图谱与强毒株的差异之处,根据这些差异表达蛋白的LC/MS-MS鉴定结果来分析疫苗株的致弱机制进而为寻找新的毒力相关分子、鉴别诊断分子以及揭示布鲁菌胞内寄生机制提供帮助。本研究利用比较蛋白质组学技术,对布鲁菌强毒株16 M和弱毒株M5的外膜蛋白进行了差异比较分析,结果共发现33个差异蛋白点,代表了26个开放阅读框,这些蛋白涉及了蛋白质的生物合成(5/26)、氨基酸合成(3/26),脂肪酸代谢(2/26)、能量代谢(5/26),以及细胞被膜生物合成(4/26)和一些调节系统(4/26)等多个生物过程。这些发现为研究外膜蛋白在布鲁菌毒力,胞内寄生等过程中发挥的重要作用提供了新依据。

关键词：羊布鲁菌外膜蛋白比较蛋白质组学双向电泳液相色谱串联质谱