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牛磺熊去氧胆酸通过抑制内质网应激诱导的凋亡促进类鼻疽菌的清除

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陆军军医大学学报 2024年第3期46卷 225-231页

作者：赵光强南栋琪袁思琪饶承龙邢贞泉王彬方瑶毛旭虎李倩三亚市人民医院(四川大学华西三亚医院)呼吸内科海南三亚572022 陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038 解放军中部战区总医院呼吸与危重症医学科武汉430070 陆军军医大学(第三军医大学)创伤与化学中毒全国重点实验室重庆400038

目的拟通过类鼻疽菌感染RAW264.7巨噬细胞模型,探讨牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)促进类鼻疽菌胞内清除的作用机制。方法类鼻疽菌感染RAW264.7细胞后8 h,设置未感染组和类鼻疽菌感染组,在不同浓度TUDCA处理条件下... 详细信息

目的拟通过类鼻疽菌感染RAW264.7巨噬细胞模型,探讨牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)促进类鼻疽菌胞内清除的作用机制。方法类鼻疽菌感染RAW264.7细胞后8 h,设置未感染组和类鼻疽菌感染组,在不同浓度TUDCA处理条件下,采用流式细胞仪检测类鼻疽菌诱导细胞凋亡的情况;同时使用另外一种内质网应激抑制剂4-PBA,通过Annexin-V/PI双染法和MTT细胞增殖实验分别检测类鼻疽菌感染对宿主细胞凋亡和增殖的影响;进一步使用siRNA干扰内质网应激关键基因CHOP,设置siC对照组和siCHOP干扰组,通过Western blot和流式细胞仪检测类鼻疽菌感染后Caspase-3、Caspase-12等细胞凋亡相关蛋白的表达水平及细胞凋亡情况;通过细菌胞内生存实验分析TUDCA通过抑制内质网应激减少其诱导的细胞凋亡、增强巨噬细胞对类鼻疽菌胞内清除作用的机制。结果在不同浓度TUDCA处理下,100μmol/L或200μmol/L TUDCA可明显减少类鼻疽菌感染诱导的RAW264.7细胞凋亡数量(P<0.05)。分别使用两种内质网应激抑制剂TUDCA和4-PBA均可降低类鼻疽菌感染诱导的细胞凋亡(P<0.05)。在siC对照组,相较于未感染时类鼻疽菌感染后Caspase-3和Caspase-12表达明显增加。在siCHOP干扰组,细胞凋亡相关蛋白的表达显著低于siC对照组,TUDCA处理后细胞凋亡相关蛋白表达水平与未加TUDCA药物相比无明显差异。流式细胞仪检测结果也显示,TUDCA能够减少类鼻疽菌感染后诱导的细胞凋亡(P<0.05),但在siCHOP干扰组中,TUDCA对类鼻疽菌感染诱导的凋亡无明显改变。细菌胞内生存计数结果显示,在siC对照组加入TUDCA能够增加宿主细胞对类鼻疽菌的清除(P<0.05),而在siCHOP干扰组中TUDCA的处理对类鼻疽菌胞内增殖无明显影响。结论在类鼻疽菌感染RAW264.7细胞模型中,TUDCA能够通过抑制巨噬细胞内质网应激诱导的凋亡,促进巨噬细胞对类鼻疽菌的胞内清除。

关键词：类鼻疽菌牛磺熊去氧胆酸内质网应激细胞凋亡

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病原微生物核调控机制研究进展

中国病原生物学杂志 2022年第12期17卷 1484-1488页

作者：吴潘南栋琪饶承龙李倩毛旭虎陆军军医大学药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038

近年来核调控作为病原微生物感染宿主细胞的调控机制研究备受关注。病原体分泌“核调素”与宿主细胞核相关靶点相互作用,通过调节细胞核内与基因表达相关的特定生命活动实现感染和致病。其过程包括染色质动力学改变、组蛋白修饰、DNA甲... 详细信息

近年来核调控作为病原微生物感染宿主细胞的调控机制研究备受关注。病原体分泌“核调素”与宿主细胞核相关靶点相互作用,通过调节细胞核内与基因表达相关的特定生命活动实现感染和致病。其过程包括染色质动力学改变、组蛋白修饰、DNA甲基化、mRNA剪切、细胞周期和信号通路转导等。本文综述了病毒、细菌及寄生虫等病原微生物对宿主细胞核调控的主要策略及研究进展,特别是调控染色质可及性、改变宿主DNA的一级结构和甲基化水平、调控宿主hnRNA的生成和剪切等机制,以期为深入研究病原微生物感染免疫机制提供新思路。

关键词：核调控机制核调素病原微生物细胞微生物学综述

荧光标记类鼻疽菌的构建及其与宿主细胞相互作用的应用研究

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陆军军医大学学报 2022年第20期44卷 2105-2112页

作者：陈建高饶承龙刘文正吴潘王旭冉南栋琪杨文波毛旭虎陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038

目的构建类鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei,***)的荧光示踪载体,获得自发荧光的类鼻疽菌株,并对其与宿主相互作用的感染过程进行初步应用研究。方法采用基因重组技术,将绿色、红色和蓝色荧光蛋白(green/red/blue fluorescent protein... 详细信息

目的构建类鼻疽菌(Burkholderia pseudomallei,***)的荧光示踪载体,获得自发荧光的类鼻疽菌株,并对其与宿主相互作用的感染过程进行初步应用研究。方法采用基因重组技术,将绿色、红色和蓝色荧光蛋白(green/red/blue fluorescent protein,GFP/RFP/BFP)基因分别重组到原核表达载体pUCP28T上,构建类鼻疽菌组成型荧光表达载体,并通过体外细菌培养观察外源性荧光蛋白的表达对细菌生长能力的影响,以及荧光标记细菌遗传稳定性的检测。通过炎症因子IL-8的检测评价荧光标记细菌对宿主细胞感染能力的变化。利用活细胞工作站观察类鼻疽菌被宿主细胞自噬体包裹的动态过程。结果构建了三种荧光标记的类鼻疽菌示踪载体,并且能在体外传代20代内稳定表达,且外源性荧光蛋白的表达不影响类鼻疽菌的生长和对宿主细胞的感染。同时,利用高分辨率活细胞成像系统观察到红色荧光标记的类鼻疽菌与宿主细胞GFP-LC3共定位的动态变化过程。结论本文成功构建了三种荧光标记的类鼻疽菌,以期为类鼻疽菌致病机制的研究、抗菌药物的筛选提供重要实用工具。

关键词：类鼻疽菌基因重组荧光标记自噬

类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白的重组表达及其免疫学特性研究

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陆军军医大学学报 2024年第15期46卷 1713-1720页

作者：南栋琪文远陈建高饶承龙吴潘张子元王施韦闫晶敏李倩毛旭虎陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)创伤与化学中毒全国重点实验室重庆400038

目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(***)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多克... 详细信息

目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(***)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多克隆抗体;分别用兔抗类鼻疽菌血清和类鼻疽菌感染阳性患者血清进行Western blot实验检测rBipD的免疫反应性;通过Western blot及免疫荧光染色检测鉴定rBipD的免疫原性;以rBipD建立间接ELISA检测临床类鼻疽患者血清抗体。结果成功构建pET-28a-BipD重组质粒并转化至*** BL21(DE3)中诱导表达、纯化获得了相对分子质量约为36×10^(3)的rBipD蛋白,纯度约为95.4%。rBipD蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。免疫小鼠可产生特异性抗体,制备鼠抗rBipD多克隆抗体,效价达1∶512000。5.0μg/mL rBipD蛋白可与类鼻疽患者血清发生免疫反应,而不与结核患者血清发生免疫反应,差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功制备了具有免疫学活性的rBipD蛋白及其多克隆抗体,为其用于临床免疫学诊断和类鼻疽菌感染免疫机制研究提供了良好的工具。

关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌 BipD蛋白重组表达抗体制备

类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统的Hcp1蛋白转位介导多核巨细胞形成

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陆军军医大学学报 2024年第15期46卷 1721-1728页

作者：吴潘饶承龙南栋琪陈建高张子元刘文正王民洋闫晶敏李倩毛旭虎陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)创伤与化学中毒全国重点实验室重庆400038

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽... 详细信息

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽菌hcp1基因缺失株(BPC006Δhcp1)和缺失回补株(BPC006Δhcp1::hcp1);分别用类鼻疽菌BPC006野生株、BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1感染RAW264.7细胞,通过激光共聚焦分析Hcp1蛋白的定位情况;在293T细胞中转染Hcp1真核表达载体后进行细胞质膜分离进一步验证定位情况;在细胞感染模型上,通过吉姆萨染色检测抗Hcp1多克隆抗体封闭对MNGC形成的影响,探究Hcp1在类鼻疽菌感染导致的MNGC形成中的作用和生物学意义。结果Western blot检测结果显示BPC006Δhcp1不表达Hcp1蛋白,而BPC006Δhcp1::hcp1能恢复Hcp1蛋白的表达,成功构建类鼻疽菌BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1。细胞免疫荧光共定位实验和质膜分离实验都表明Hcp1可以定位在宿主细胞膜上,且相较于对照组抗Hcp1多克隆抗体能抑制类鼻疽菌感染所诱导的MNGC形成(P<0.01)。结论类鼻疽菌感染RAW264.7细胞时Hcp1可转位至细胞膜,并在MNGC形成中发挥重要作用。

关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌 Hcp1 多核巨细胞基因缺失与回补