检索结果-南通市图书馆

采用罗丹明123分离肝癌细胞系HepG2异质性亚群的鉴定

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

采用罗丹明123分离肝癌细胞系HepG2异质性亚群的鉴定

作者：千年松第四军医大学

学位级别：硕士

多种肿瘤均起源于已恶性转化的单个细胞,这种转化是由于基因突变的累积所致。肿瘤干细胞定义为:能分化出不同表型的,并能自我克隆产生子代致瘤性细胞的肿瘤细胞。它既可诱导肿瘤的发生,也可用于防治肿瘤。肿瘤干细胞与正常干细胞在许多... 详细信息

多种肿瘤均起源于已恶性转化的单个细胞,这种转化是由于基因突变的累积所致。肿瘤干细胞定义为:能分化出不同表型的,并能自我克隆产生子代致瘤性细胞的肿瘤细胞。它既可诱导肿瘤的发生,也可用于防治肿瘤。肿瘤干细胞与正常干细胞在许多方面具有相似之处,有研究发现急性髓细胞样白血病细胞中能分离出与骨髓造血干细胞具有相同干细胞表面标志的癌细胞,这些细胞能在免疫缺陷小鼠中诱导急性髓细胞样白血病的发生等等。肿瘤干细胞( cancer stem cells,CSC )是肿瘤的起始细胞这一观点已被广泛接受,目前已在多种恶性实体瘤中发现有肿瘤干细胞的存在,例如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌和脑肿瘤等中已发现了肿瘤干细胞。肝细胞癌是世界上男性最常见的恶性肿瘤之一,起病隐匿、发展迅速、恶性程度高。卵圆细胞起源于汇管区的胆管上皮,是肝脏干细胞的子代细胞,在经致癌剂或癌基因诱导分化后可形成肝细胞癌、胆管上皮细胞癌和未分化癌,卵圆细胞是宿主受致癌剂作用后发生肝癌的始动细胞。临床观察发现,肝癌细胞之间在耐药性上也有巨大的差异,这提示肝癌组织中可能存在有具有表型和功能特殊的肝癌细胞。分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机理、揭示肝癌复发和转移的机制具有重要的意义,并为治疗肝癌提供一个新的策略。罗丹名123(Rho123)结合流式细胞分选术(FCM)富集干细胞的基本原理是利用了干细胞对染料具有排斥性这一特异性功能标志,干细胞是通过细胞表面的P糖蛋白(P-gp)载体将进入胞内的荧光染料Rho123主动外泵至胞外,这些染色后的干细胞表现在流式细胞仪分析图上表现为低荧光的特征,将这些低荧光群分选即可达到富集和分离干细胞的目的,该方法首先在分离骨髓造血干细胞上获得了成功。目的: 建立分离肝癌细胞系HepG2中对罗丹明123染料具有不同排斥能力细胞亚群的方法,并探讨其在肝癌异质性研究中的意义。方法: 1、HepG2细胞Rho123染色的分选 HepG2细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×1010/ L。等分细胞悬液,两组均加入荧光染料Rho123,根据我们对MHCC97细胞系Rho123染色浓度选择终浓度为0.05mg/L,其中1组再加入维拉帕米,终浓度50mmol/L,37℃避光水浴30 min,冰上5 min终止染色,冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬。激发光源480 nm FCM分选,对数模式采集信号做一维散点图,将低Rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为Rho亚群的“门”,计算百分比,分选出Rho及Rho亚群。 2、Rho及Rho亚群生长曲线测定将Rho及Rho亚群消化后,调整至3×107/L的细胞密度,以1mL/孔分别接种于3cm的培养皿中,2天换液,连续培养7天,每日各取3个计数,取平均值作为结果。设3个平行孔,实验重复3次,计算平均值。 3、Rho及Rho亚群软琼脂克隆形成实验将Rho及Rho亚群密度调整至1×107/L,按1∶1混合12g/L琼脂糖和2×DMEM(含200mL/L小牛血清),备底层琼脂1∶1混合7g/L琼脂糖和2×DMEM,加入细胞悬液40μL,制备上层琼脂。培养3周,计数克隆形成数。 4、Rho及Rho亚群甲胎蛋白(AFP)免疫细胞化学 AFP免疫细胞化学分析,4%多聚甲醛常规固定。免疫细胞化学采用SP法,操作步骤参照试剂盒说明书。一抗AFP mAb,工作浓度1:100,DAB显色,苏木精复染。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。胞质出现棕黄色颗粒定为阳性。应用Pro-Plus软件分析染色细胞平均光密度(IOD)比较两组细胞中AFP表达量。 5、Rho及Rho亚群裸鼠成瘤实验将分选得到Rho及Rho亚群用无菌技术接种至裸鼠右侧背部皮下,每组肝癌细胞的接种细胞总数均为2×104个,每隔3天观察皮下肿瘤的生长情况。结果: 1、HepG2细胞Rho123染色的分选流式细胞仪的分析结果显示有Rho亚群存在,该群细胞占整个肝癌细胞总数的1.6%左右,加入钙通道拮抗剂后该群细胞明显减少,位于Rho亚群的大部分肝癌细胞因低荧光的特征消失而进入到了Rho亚群中。 2、Rho及Rho亚群生长曲线测定 Rho123low细胞比Rho123high细胞具有更旺盛的增殖能力,前者倍增时间16.9 h,后者24.7 h;前者最大增生倍数15.2,后者最大增生倍数为12.3。 3、Rho及Rho亚群软琼脂克隆形成实验 Rho亚群在软琼脂中有较高的克隆形成率,而Rho亚群在同样的生长条件下则生长迟缓,软琼脂培养中未见有明显的细胞克隆形成,说明Rho亚群具有非常高的增殖潜能,Rho亚群具有更强的增值特征。 4、Rho及Rho亚群AFP免疫细胞化学两组细胞内均有AFP的阳性表达,阳性反应为显示位于细胞质的棕黄色颗粒,且阳性细胞主

关键词：肝细胞癌异质性罗丹明123 肿瘤干细胞

大鼠肝硬化模型中小肝细胞分离培养方法的建立及其表型分析

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

细胞与分子免疫学杂志 2007年第12期23卷 1203-1204页

作者：于恒超李韧千年松窦科峰第四军医大学西京医院肝胆外科陕西西安710032

目的:探讨体外分离培养大鼠小肝细胞(SHC)的方法,并对其进行表型鉴定。方法:利用二乙基亚硝胺饲喂法,建立SD大鼠肝硬化模型。采用改进后两步胶原酶灌注消化法分离细胞。光镜下观察细胞形态。电镜下观察细胞形态及超微结构。采用计数法... 详细信息

目的:探讨体外分离培养大鼠小肝细胞(SHC)的方法,并对其进行表型鉴定。方法:利用二乙基亚硝胺饲喂法,建立SD大鼠肝硬化模型。采用改进后两步胶原酶灌注消化法分离细胞。光镜下观察细胞形态。电镜下观察细胞形态及超微结构。采用计数法测定细胞生长曲线,流式细胞术(FCM)测定细胞周期。通过免疫细胞化学染色法进行表型鉴定。结果:原代培养的大鼠SHC,24h内即可见贴壁伸展,48h左右克隆形成。光镜下可观察SHC核仁小而清晰,胞质少,细胞体积较小;电镜下可见SHC表面少量短而小的微绒毛突起,细胞体积小,核浆比例高,呈现未分化细胞的形态。免疫细胞化学染色显示SHC胞质AFP、CK-7、CK-8及CK-19呈棕黄色阳性信号。结论:改进后的两步胶原酶灌注消化方法能较容易地获得大量纯度较高的SHC。

关键词：大鼠小肝细胞分离培养免疫细胞化学

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

肝移植治疗原发性肝细胞癌的临床研究进展

第四军医大学学报 2007年第6期28卷 567-569页

作者：千年松窦科峰第四军医大学西京医院肝胆外科陕西西安710033

肝细胞肝癌行肝脏移植的指征、效果及相关问题一直存在争论.本文我们收集并分析近年国内外文献,对肝癌肝移植的受体选择、影响预后/复发的因素、过渡性治疗以及术后注意的问题等相关问题进行探讨.笔者认为在肝癌患者拟行肝移植治疗之前... 详细信息

肝细胞肝癌行肝脏移植的指征、效果及相关问题一直存在争论.本文我们收集并分析近年国内外文献,对肝癌肝移植的受体选择、影响预后/复发的因素、过渡性治疗以及术后注意的问题等相关问题进行探讨.笔者认为在肝癌患者拟行肝移植治疗之前,严格、合理选择病例,结合围手术期辅助治疗,肝癌肝移植可以获得满意的疗效和较高的生活质量.

关键词：肝移植肝肿瘤适应症预后复发肿瘤辅助疗法

高氧液预处理对大鼠肝内胆管缺血再灌注损伤的保护作用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

细胞与分子免疫学杂志 2008年第1期24卷 89-91页

作者：廖永晖千年松赵青川窦科峰第四军医大学西京医院肝胆外科陕西西安710032

目的:观察高氧液预防大鼠肝内胆管缺血再灌注损伤的效果,探讨高氧液对缺血再灌注损伤的作用机制。方法:大鼠70%缺血再灌注动物模型,缺血90 min,再灌注后8 h、24 h取材。40只SD大鼠随机分成实验组与对照组,每组再分8 h和24 h两组,每组10... 详细信息

目的:观察高氧液预防大鼠肝内胆管缺血再灌注损伤的效果,探讨高氧液对缺血再灌注损伤的作用机制。方法:大鼠70%缺血再灌注动物模型,缺血90 min,再灌注后8 h、24 h取材。40只SD大鼠随机分成实验组与对照组,每组再分8 h和24 h两组,每组10只。在缺血再灌注前10 min经门静脉注射高氧液(20 mL/kg);对照组为生理盐水对照。在对应时间点取材,观察血清ALT、AST、GGT变化,酶组织化学检测过氧化氢酶表达变化,光镜观察肝组织病理改变,电镜观察肝内胆管上皮细胞的超微结构变化。结果:对照组GGT、ALT、AST活性均明显高于实验组(P<0.01);过氧化氢酶活性则明显低于实验组(P<0.05);实验组光镜下病理改变及电镜超微结构检查相比对照组明显减轻。结论:高氧液预处理对大鼠肝内胆管缺血再灌注损伤具有保护作用。

关键词：高氧液缺血再灌注胆管

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

创伤应激与肝细胞凋亡

世界华人消化杂志 2010年第15期18卷 1569-1576页

作者：廖永晖千年松张毅窦科峰中国人民解放军第四军医大学西京医院肝胆外科陕西省西安市710032

创伤会使机体产生应激,在多种因素作用下,可能促使细胞凋亡导致病理损伤,创伤应激致细胞凋亡的机制复杂,仍有很多存在争议的问题,尤其是对那些非神经系统器官而言.临床上很多肝脏疾病均受应激因素的影响,导致肝细胞凋亡而产生肝损伤.目... 详细信息

创伤会使机体产生应激,在多种因素作用下,可能促使细胞凋亡导致病理损伤,创伤应激致细胞凋亡的机制复杂,仍有很多存在争议的问题,尤其是对那些非神经系统器官而言.临床上很多肝脏疾病均受应激因素的影响,导致肝细胞凋亡而产生肝损伤.目前应激损害研究主要集中在应激对心理造成的损害,而对肝、脑、肺、肾等实质脏器的损害研究不多,机制尚不明确.肝脏是人体新陈代谢的总枢纽,是严重应激损伤的核心靶器官,受创伤应激后的应激性高血糖、钙超载、氧化应激、缺血再灌注、炎性损伤和免疫抑制等因素影响,可发生肝细胞凋亡等病理性损害,故研究创伤应激与肝细胞凋亡的内在联系具有重要意义.

关键词：创伤应激凋亡应激性肝损害

肿瘤免疫治疗相关炎性副反应及其治疗策略综述

维普期刊数据库评论

在线全文

维普期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

解放军医学院学报 2023年第3期44卷 300-306页

作者：陈东亚陈昭光杨凡千年松解放军总医院海南医院肿瘤内科海南三亚572013 解放军总医院第五医学中心肿瘤医学部肿瘤内科北京100071 解放军总医院第八医学中心呼吸学部肿瘤内科北京100089

近年来,免疫治疗已经在临床得到了广泛应用,在不同瘤种治疗中都取得了显著效果。然而,我们也不应忽略免疫治疗作为双刃剑,亦能诱导各种炎性副反应,不仅减弱了免疫治疗疗效,导致免疫治疗的中止,也限制了免疫治疗与传统放化疗联合的开展... 详细信息

近年来,免疫治疗已经在临床得到了广泛应用,在不同瘤种治疗中都取得了显著效果。然而,我们也不应忽略免疫治疗作为双刃剑,亦能诱导各种炎性副反应,不仅减弱了免疫治疗疗效,导致免疫治疗的中止,也限制了免疫治疗与传统放化疗联合的开展。基于炎症在肿瘤发生、发展和治疗所有阶段的重要作用,炎症靶向治疗联合免疫治疗将不仅能减轻免疫治疗炎性副反应,且有可能提高新一代免疫疗法的疗效,为长期、多层次的肿瘤治疗提供新的可能性。本文主要介绍免疫治疗相关炎性副反应和相应机制的研究进展,探讨减轻炎性副反应的最新抗炎策略,从而为规避免疫治疗缺陷,最大程度发挥免疫治疗作用提供依据。

关键词：免疫治疗炎症毒性免疫检查点抑制剂嵌合抗原受体T细胞细胞因子释放综合征

流式细胞分选术和Rho123在分离MHCC97肿瘤干细胞中的应用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国组织工程研究与临床康复 2007年第46期11卷 9272-9275页

作者：曹云新千年松杨安钢胡金涛解放军第四军医大学免疫学教研室陕西省西安市710032 解放军第四军医大学肝胆外科陕西省西安市710032

目的:肝癌组织中可能存在具有表型和功能特殊的肝癌细胞,分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机制、揭示肝癌复发和转移具有重要的意义。寻求分离MHCC97肿瘤干细胞的有效方法,探讨角蛋白(CK-19)在不同肝癌细胞亚群中的... 详细信息

目的:肝癌组织中可能存在具有表型和功能特殊的肝癌细胞,分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机制、揭示肝癌复发和转移具有重要的意义。寻求分离MHCC97肿瘤干细胞的有效方法,探讨角蛋白(CK-19)在不同肝癌细胞亚群中的表达差异。方法:实验于2006-11/2007-05在解放军第四军医大学免疫实验室和肝胆外科实验室完成。细胞来源:MHCC97肝癌细胞(人高转移肝癌细胞系)由上海复旦大学中山医院肝癌研究所提供。实验方法:MHCC97细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×109L-1。每份取1×106个细胞,参考Rho123对线粒体膜电位测定的0.1mg/L质量浓度,分别做0.1mg/L和0.05mg/L两个质量浓度细胞梯度染色,对照组加入维拉帕米(终浓度50mmol/L),以未加Rho123作为阴性对照。实验评估:采用免疫细胞化学方法观察细胞角蛋白19在0.05mg/LRho123细胞及0.1mg/LRho123两组中的表达和含量。结果:单纯加入Rho123组有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组无此区域,即0.05mg/LRho123细胞占总数的2.1%,其余为0.1mg/LRho123组细胞。两组细胞内均有细胞角蛋白19阳性表达,阳性反应为显示位于细胞质的棕黄色颗粒,两组比较有统计学差异(P<0.05)结论:细胞角蛋白19在肝癌细胞亚群中表达有差异,强阳性多数分布在0.05mg/LRho123组中,Rho123结合流式细胞分选术可以有效地分选出癌细胞中的肿瘤干细胞。

关键词：流式细胞分选术罗丹明123 肿瘤干细胞 CK-19

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

大鼠小肝细胞移植对急性肝损伤的影响

中华肝胆外科杂志 2009年第2期15卷 129-131页

作者：于恒超李韧千年松窦科峰第四军医大学西京医院肝胆外科西安710032

目的探讨小肝细胞（small heptocytes，SHCs）移植对四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）＋2／3肝切（partial hepatectomy，PH）所致急性肝损伤的影响。方法选择健康SD大鼠20只，饲喂含二乙基亚硝胺（DEN）饲料建立SD大鼠SHCs增殖... 详细信息

目的探讨小肝细胞（small heptocytes，SHCs）移植对四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）＋2／3肝切（partial hepatectomy，PH）所致急性肝损伤的影响。方法选择健康SD大鼠20只，饲喂含二乙基亚硝胺（DEN）饲料建立SD大鼠SHCs增殖模型。分离、培养、鉴定（电镜、免疫细胞化学）原代SHCs。SHCs行PKH26膜荧光染色。将实验用同一近交系SD大鼠30只随机平均分成空白对照组（B）、损伤造模组（M）和SHCs移植组（T）。B组腹腔注射生理盐水，M组、T组腹腔注射CCl4。24h后戊巴比妥腹腔麻醉，消毒开腹，M、T组行2／3肝切，B、M组门静脉注人生理盐水，T组门静脉注入经膜荧光标记SHCs悬液。4周后，采血测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST），并取病理标本做冰冻切片荧光显微镜下观察及HE染色普通光镜下观察。结果电镜下观察可见SHCs表面少量短而小的微绒毛突起，核浆比例高，呈现未分化细胞的形态。免疫细胞化学观察SHCs胞质AFP、CK-19染色呈棕黄色阳性信号。SHCs移植可以显著降低CCl4＋2／3PH致肝损伤血清ALT、AST水平，可以明显改善CCl4＋2／3PH致肝损伤肝脏病理改变。T组冰冻切片荧光显微镜下可以观察到由SHCs分化的肝细胞形成的肝板结构。结论SHCs移植对CCl4＋2／3PH所致急性肝损伤有一定治疗作用。

关键词：细胞移植肝干细胞免疫细胞化学移植肝损伤

小鼠中央杏仁核中GluR1的表达变化参与骨癌痛形成

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

神经解剖学杂志 2012年第5期28卷 501-506页

作者：徐飞张蕾李建军赵力千年松解放军第302医院肿瘤放射治疗中心北京100039 空军总医院妇产科北京100142 解放军第306医院全军口腔疾病诊疗中心北京100101 海军总医院心内科北京100048 解放军总医院肝胆外科北京100853

目的:观察GluR1在骨癌痛(bone cancer pain,BCP)模型小鼠中央杏仁核中的表达变化。方法:健康C57小鼠分为假手术对照组(n=100)和骨癌痛组(n=100),每组均在术前和术后7、14、21、28 d先进行行为学检测,检测完毕后取材,进行免疫组化染色和W... 详细信息

目的:观察GluR1在骨癌痛(bone cancer pain,BCP)模型小鼠中央杏仁核中的表达变化。方法:健康C57小鼠分为假手术对照组(n=100)和骨癌痛组(n=100),每组均在术前和术后7、14、21、28 d先进行行为学检测,检测完毕后取材,进行免疫组化染色和Western Blot检测,观察GluR1在中央杏仁核中的表达变化。结果:从癌细胞接种后第7 d开始,BCP组出现自发缩足次数增多、PWT值降低,14 d后与Sham组比较开始有明显差异,表明模型建立成功;免疫组织化学染色显示GluR1在正常C57小鼠中央杏仁核中的表达水平较低,但在建模术后小鼠中央杏仁核中GluR1的表达开始逐渐升高,图像分析表明GluR1的光密度与对照组比较,第14 d时差异有统计学意义(P<0.05),BCP组21 d时GluR1的表达达高峰(P<0.01),Western Blot检测结果亦与之相符。结论:骨癌痛小鼠GluR1可能在杏仁核参与神经病理性痛的过程中具有重要作用。

关键词： AMPA受体谷氨酸受体1 中央杏仁核骨癌小鼠