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赤红球菌二鸟苷酸环化酶基因的克隆、信息学分析和转录变化研究

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基因组学与应用生物学 2020年第3期39卷 1128-1136页

作者：匡素芳彭仁江西师范大学生命科学学院南昌330022

本研究通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶(DGC)基因,并对该酶进行生物信息学分析,研究其在甲苯和苯酚胁迫下的转录水平变化,为进一步研究该酶和赤红球菌SD3有机溶剂耐受性之间的关系奠定基础。综合使用煮沸法和冻融法提取赤红球菌SD... 详细信息

本研究通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶(DGC)基因,并对该酶进行生物信息学分析,研究其在甲苯和苯酚胁迫下的转录水平变化,为进一步研究该酶和赤红球菌SD3有机溶剂耐受性之间的关系奠定基础。综合使用煮沸法和冻融法提取赤红球菌SD3的总DNA,利用PCR扩增和T载体克隆获得DGC基因序列;利用生物信息学手段对DGC的理化性质和结构特征进行分析;利用邻位相连法构建进化树;采用Discovery studio 3.5将DGC与底物GTP进行分子对接;采用qPCR方法分析DGC基因在甲苯和苯酚胁迫下的转录变化情况。克隆获得了赤红球菌SD3的DGC基因序列,在GenBank中的序列登录号为MH482549。该基因的开放阅读框长为1 332 bp,编码443个氨基酸,预测蛋白分子量为46.95 kD,是疏水性蛋白。无信号肽和二硫键,含有6段跨膜区,第181~316位氨基酸之间存在一个GGDEF保守结构域和c-di-GMP结合抑制位点(Ⅰ位点)。亚细胞定位分析表明,DGC属于质膜蛋白。DGC中超过50%的氨基酸参与形成α螺旋结构。进化树分析表明Rhodococcus ruber SD3和Rhodococcus aetherivorans的DGC聚为一簇,推测赤红球菌SD3的DGC也属于ClassⅢnucleotidyl cyclases家族,具有类似的分子功能。分子对接表明DGC和GTP分子通过疏水作用和氢键产生相互作用。qPCR结果表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中DGC基因的转录分别上调了1.57倍和8.71倍。研究表明,赤红球菌SD3中的DGC催化GTP产生c-di-GMP,并且DGC基因的转录在有机溶剂胁迫下发生显著上调,这暗示c-di-GMP与赤红球菌SD3的有机溶剂耐受性可能相关。

关键词：二鸟苷酸环化酶赤红球菌基因克隆生物信息学分析荧光定量PCR

赤红球菌定量蛋白质组学及其二鸟苷酸环化酶的融合表达和催化特性研究

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赤红球菌定量蛋白质组学及其二鸟苷酸环化酶的融合表达和催化特性...

作者：匡素芳江西师范大学

学位级别：硕士

红球菌作为一类耐有机溶剂的极端微生物,在生物转化和生物修复等领域具有潜在作用。挖掘赤红球菌SD3菌株有机溶剂响应相关蛋白并进行功能表征,有利于加深对微生物有机溶剂耐受性机制的理解,也能促进微生物在有机相催化反应中的应用。本... 详细信息

红球菌作为一类耐有机溶剂的极端微生物,在生物转化和生物修复等领域具有潜在作用。挖掘赤红球菌SD3菌株有机溶剂响应相关蛋白并进行功能表征,有利于加深对微生物有机溶剂耐受性机制的理解,也能促进微生物在有机相催化反应中的应用。本研究的主要内容和结果如下:1)通过iTRAQ标记技术和液相色谱-串联质谱方法分析了赤红球菌SD3菌株在甲苯和苯酚胁迫下响应情况。与对照组相比,分别鉴定出362和488个差异蛋白。同时挖掘了赤红球菌SD3菌株的有机溶剂耐受性相关的应激蛋白、膜蛋白、调控系统和代谢途径。此外,应用qPCR在转录水平上证明甲苯或苯酚胁迫下,赤红球菌SD3菌株的CspA家族应激蛋白、4-硝基苯酚2-单加氧酶和二鸟苷酸环化酶的表达水平发生了上调。2)通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶基因dgc,利用生物信息学手段对二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)的理化性质和结构特征进行分析,初步判断DGC蛋白是含6段跨膜区的疏水性蛋白,含有50%以上的稳定α螺旋结构,具有典型的GGDEF催化活性结构域。进化树分析表明赤红球菌SD3和食醚红球菌的DGC亲缘关系较近,推测赤红球菌SD3的DGC也属于Class III nucleotidyl cyclases家族,具有类似的分子功能。通过I-TASSER建模工具得到了DGC蛋白的三级结构,利用分子对接技术模拟了底物GTP与DGC蛋白通过疏水作用和氢键产生相互作用,从而形成稳定结合的构象。3)为了进一步研究赤红球菌SD3有机溶剂响应相关蛋白二鸟苷酸环化酶的功能和合成c-di-GMP的活力。对赤红球菌SD3中的dgc基因进行密码子优化,构建了重组表达质粒pPGH-Dgcs,并转入*** BL21(DE3)进行异源表达。通过优化表达条件,在16℃和0.1 mM IPTG诱导条件下,融合GST标签以帮助DGC膜蛋白的正确折叠和异源表达。经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化得到一个新的全长GST-DGC融合蛋白,并由LC-MS/MS分析确定为目的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定GST-DGC蛋白的大小为71.9 kDa,与理论值73.0 kDa大致相符。Blue Native PAGE结果表明GST-DGC融合蛋白形成了八聚体。GST-DGC酶的最适反应pH值和最适反应温度分别为8.0和47°C,并且表现出高热稳定性,在87℃孵育1 h后,依然保留了94%的活性。此外,GST-DGC融合蛋白也表现出pH稳定性。该酶催化GTP底物生成c-di-GMP的反应动力学分析表明,其Km、Vmax和Kcat值分别为9.8μM、0.7μM/min和1.3 S。一些金属离子如Zn、Mn、Fe、Ni和Co对GST-DGC蛋白质有抑制作用,而金属离子Mg、K和Na和螯合剂EDTA则对GST-DGC蛋白质有激活作用。更重要的是,该融合蛋白在甲苯、环己烷和正己烷存在下也显示出相当高的稳定性。进一步应用分子对接方法预测了GST-DGC蛋白可能的金属离子和有机溶剂激活或抑制位点,为酶分子的定点改造以提高c-di-GMP产量提供靶点。总之,本研究通过蛋白质组学和荧光定量PCR初步证明了二鸟苷酸环化酶与微生物有机耐受性的关系。首次异源表达得到红球菌中含有6段跨膜区的完整二鸟苷酸环化酶,与已报道的海栖热袍菌嗜热二鸟苷酸环化酶的Kcat值2.6 min相比,本研究纯化得到GST-DGC融合蛋白催化合成c-di-GMP效率提高了约30倍。本研究为大规模催化合成c-di-GMP提供了可能,为揭示二鸟苷酸环化酶与微生物有机耐受性的关联机制奠定基础。

关键词：赤红球菌SD3 同位素标记相对和绝对定量实时荧光定量PCR 二鸟苷酸环化酶表达与纯化

耐有机溶剂微生物的耐受机制、改造策略和应用

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生物技术 2017年第6期27卷 607-612页

作者：匡素芳彭仁江西师范大学生命科学学院江西南昌330022

耐有机溶剂微生物在生物燃料生产、全细胞催化、酶制剂的开发和生物修复等领域具有非常重要的作用。该文简要介绍了耐有机溶剂微生物及其耐受机制,并从基因过表达、基因敲除和全局转录机制三个方面总结了增强微生物有机溶剂耐受性的方... 详细信息

耐有机溶剂微生物在生物燃料生产、全细胞催化、酶制剂的开发和生物修复等领域具有非常重要的作用。该文简要介绍了耐有机溶剂微生物及其耐受机制,并从基因过表达、基因敲除和全局转录机制三个方面总结了增强微生物有机溶剂耐受性的方法。通过对耐有机溶剂微生物应用的局限性进行分析,认为未来研究中应注重将微生物耐受表型和具体利用相结合,达到有机溶剂耐受和实际产出的最佳平衡状态,为耐有机溶剂工程菌的改造和选育提供参考。

关键词：耐有机溶剂微生物耐受机制菌种改造应用

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国内种子企业电子商务优化策略与可持续发展

分子植物育种 2024年第14期22卷 4823-4828页

作者：余素芳陈靖重庆科创职业学院重庆402160 重庆水利电力职业技术学院重庆402160

随着电子商务在农业领域的普及,国内种子企业面临市场竞争加剧、技术选择多样化以及供应链管理复杂化等挑战。本研究旨在探讨国内种子企业在电子商务环境下遇到的困境,并提出相应的优化策略。通过案例分析和综合研究,本研究总结了市场... 详细信息

随着电子商务在农业领域的普及,国内种子企业面临市场竞争加剧、技术选择多样化以及供应链管理复杂化等挑战。本研究旨在探讨国内种子企业在电子商务环境下遇到的困境,并提出相应的优化策略。通过案例分析和综合研究,本研究总结了市场分析、技术与平台选择以及供应链优化等关键策略,帮助国内种子企业更好地优化电子商务实践。这些策略能够提高企业的市场竞争力、提供高效的电子商务服务、增强供应链效率,从而实现可持续发展。本研究对国内种子企业优化电子商务的未来前景进行了展望,强调了持续创新的重要性。

关键词：种业公司电子商务市场竞争技术选择可持续发展

甲钴胺穴位注射联合单侧高频重复经颅磁刺激在卒中吞咽障碍患者中的应用疗效

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中国医师杂志 2024年第1期26卷 138-141页

作者：吴玉王蓓蓓毛素芳丽水市人民医院神经内科丽水323000 丽水市人民医院风湿免疫科丽水323000

目的探究甲钴胺穴位注射联合单侧高频重复经颅磁刺激(rTMS)在卒中吞咽障碍患者中的应用疗效。方法选取2020年5月至2021年5月丽水市人民医院收治的94例卒中吞咽障碍患者,按随机数字表法分为对照组和观察组,每组各47例。对照组给予常规吞... 详细信息

目的探究甲钴胺穴位注射联合单侧高频重复经颅磁刺激(rTMS)在卒中吞咽障碍患者中的应用疗效。方法选取2020年5月至2021年5月丽水市人民医院收治的94例卒中吞咽障碍患者,按随机数字表法分为对照组和观察组,每组各47例。对照组给予常规吞咽康复训练,观察组在对照组的基础上给予甲钴胺穴位注射联合单侧高频rTMS。治疗前及治疗2个疗程后,比较两组吞咽功能[标准吞咽功能评定(SSA)和功能性吞咽困难量表(FDS)评分]、营养状态[总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)及血红蛋白(HB)]、负性情绪[焦虑自评量表(SAS)和抑郁自量表(SDS)评分]、神经功能[美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)]和生活质量[吞咽障碍特异性生活质量量表(SWAL-QOL)评分]。结果治疗前,两组吞咽功能、营养状态、负性情绪、神经功能、生活质量比较差异无统计学意义(均P>0.05)。治疗后,观察组SSA评分和FDS评分均明显低于对照组(均P<0.05),TP、Alb、HB水平明显高于对照组(均P<0.05),SAS评分和SDS评分均明显低于对照组(均P<0.05),NIHSS评分明显低于对照组(P<0.05),SWAL-QOL评分明显高于对照组(P<0.05)。结论针对卒中吞咽障碍患者,甲钴胺穴位注射联合单侧高频rTMS可改善其吞咽功能和营养状态,缓解负性情绪,促进神经功能恢复,提高生活质量。

关键词：甲钴胺穴位注射经颅磁刺激卒中吞咽障碍

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论高校辅导员的政治定力

高校辅导员 2017年第3期 46-50页

作者：李非匡素芳江西师范大学生命科学学院党委江西师范大学江西师范大学生命科学学院

高校辅导员作为大学生健康成长的引路人,不仅要具备专门的知识和能力,还要具备政治定力。这要求辅导员坚定理想信念,以社会主义核心价值观为引领,着力提高自身思想政治素质。政治定力是辅导员现实工作的必要条件,加强高校辅导员政治定... 详细信息

高校辅导员作为大学生健康成长的引路人,不仅要具备专门的知识和能力,还要具备政治定力。这要求辅导员坚定理想信念,以社会主义核心价值观为引领,着力提高自身思想政治素质。政治定力是辅导员现实工作的必要条件,加强高校辅导员政治定力建构是促进高校思想政治教育发展的一个关键问题。当前辅导员政治定力状况总体上比较乐观,但在理论知识等方面也有一定欠缺。学校、辅导员个体都应重视这些问题,采取有效措施提升辅导员政治定力。

关键词：高校辅导员政治定力思想政治教育师德师风