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来源于Pseudomonas ***1001的聚己内酯解聚酶的分离纯化和酶学性质研究

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来源于Pseudomonas ***1001的聚己内酯解聚酶的分离纯化和酶学性...

作者：包剑锋东北师范大学

学位级别：硕士

聚己内酯(PCL)是由ε-己内酯聚合而成的高分子聚酯材料,能够在自然界中被微生物分泌的解聚酶完全降解。本实验室在前期研究中筛选了一株对PCL具有高效降解作用的菌株Pseudomonas ***1001,该菌株能够产生多种对PCL具有降解作用的解聚酶... 详细信息

聚己内酯(PCL)是由ε-己内酯聚合而成的高分子聚酯材料,能够在自然界中被微生物分泌的解聚酶完全降解。本实验室在前期研究中筛选了一株对PCL具有高效降解作用的菌株Pseudomonas ***1001,该菌株能够产生多种对PCL具有降解作用的解聚酶。实验室前期已获得一种分子量为28.4kDa的PCL解聚酶I。本研究通过重新对该菌的发酵液进行分离纯化,优化了PCL解聚酶I的纯化流程,并获得了与PCL解聚酶I具有明显差别的PCL解聚酶Ⅱ,对其酶学性质进行了检测,对该酶的基因进行了克隆和序列分析,同时探讨了该酶对PCL的降解过程,为更好地阐述PCL的降解机制奠定了基础,具体研究内容及结果如下。(1)通过离子交换柱层析和分子筛层析纯化得到了PCL解聚酶I和PCL解聚酶Ⅱ,其中,PCL解聚酶I的纯化倍数为5.02,回收率为18.69%,PCL解聚酶Ⅱ的纯化倍数为4.01,回收率为12.93%。对PCL解聚酶Ⅱ的SDS-PAGE检测显示其分子量大小约为32.79kDa。(2)对PCL解聚酶Ⅱ的酶学性质进行了研究,结果显示该酶的最适反应温度为40℃,在20℃-60℃的范围内温度稳定性良好;该酶的最适反应pH为10.0,在pH6.0-12.0的范围内具有较好的稳定性;金属离子对酶活性具有不同程度的影响,在金属离子浓度为1mM时,Zn2+离子能够抑制酶活性,Mg2+、Na+、Ca2+以及Co2+等离子能够不同程度的提高酶活性;EDTA和PMSF对酶活性具有明显的抑制作用;Triton X-100和Tween-80强烈抑制酶活性;该酶对甲醇、乙醇和甘油等有机溶剂的耐受性良好。(3)对PCL解聚酶Ⅱ的底物特异性进行了研究,结果表明该酶对脂肪族聚酯PBS、PHB及三丁酸甘油酯和不同碳链长度的pNP酯均具有降解活性;但对PLA和苹果皮粗角质无降解活性;分别以三丁酸甘油酯和pNPC6为底物,能够检测到PCL解聚酶Ⅱ的脂肪酶“界面激活”效应。(4)对PCL解聚酶Ⅱ的基因进行了克隆,并在*** BL21中实现了异源表达。利用预测软件对重组酶Pclase Ⅱ的理化性质和结构进行了分析,结果显示,Pclase Ⅱ由317个氨基酸构成,理论分子量为33.1994kDa,理论等电点为6.59;其N端可能含有一个由25个氨基酸残基组成的信号肽序列,30-316位氨基酸具有α/β水解酶家族的保守序列;与其氨基酸序列相似性较高的蛋白多来源于Pseudomonas sp.的脂肪酶;二级结构中,无规则卷曲占53.94%,α-螺旋和β-折叠分别占36.90%和9.14%;以Pseudomonas aeruginosa PAO1的脂肪酶的PAL(1ex9.1.A)为模板进行了三维模建,推测Pclase Ⅱ三维结构中存在一个与其“界面激活”效应相关的可移动的α-螺旋“盖子结构”。(5)对PCL解聚酶Ⅱ的降解PCL的机制进行研究,实验结果表明,其对PCL乳化底物的降解终产物为羟基己内酯单体、二聚体、三聚体和四聚体,在不完全降解阶段,还存在五聚体和六聚体。PCL膜片降解速率呈现先慢后快的趋势;SEM结果显示,随着酶解作用的进行,PCL的非结晶区优先降解,之后为球状结晶区,球晶的降解从中心开始,并逐渐向外周扩展。

关键词：聚己内酯(PCL) PCL解聚酶异源表达生物降解

肝纤维化大鼠转化生长因子β1／Smad蛋白的动态表达及意义

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中华实验和临床病毒学杂志 2011年第5期25卷 334-337页

作者：包剑锋施军平徐珊杭州市第六人民医院 310014

目的探讨转化生长因子TGF—β1／Smad信号通路在实验性肝纤维化发生中的作用。方法50只健康雄性SD大鼠分为2组：正常组和模型组，模型组大鼠利用40％CCl4油剂诱导形成肝纤维化模型，于6周及9周观测肝标本的病理，免疫组化法检测肝组织TG... 详细信息

目的探讨转化生长因子TGF—β1／Smad信号通路在实验性肝纤维化发生中的作用。方法50只健康雄性SD大鼠分为2组：正常组和模型组，模型组大鼠利用40％CCl4油剂诱导形成肝纤维化模型，于6周及9周观测肝标本的病理，免疫组化法检测肝组织TGF—β1／Smad蛋白表达。结果①肝组织病理：与正常组比较，模型组大鼠肝组织都有不同程度的炎症和纤维化产生。模型组纤维化程度较正常对照组明显，差异有统计学意义（P〈0．05）；②TGF—β1／Smad基因蛋白：免疫组织化学检测显示，与正常对照组相比，模型组大鼠肝脏中TGF—β1、转化生长因子βI型受体（TβR—I）、Smad2、3、Smad，蛋白表达均显著增强（P〈0．01），模型组大鼠肝脏TGF—β1、TβR-I、Smad。和Smad，之间存在正相关关系（P〈0．05或0．01）；模型组大鼠肝脏纤维化分级与TGF—β1、TβR—I、Smad2/3和Smad，之间存在正相关关系（P〈0．05或0．01）。结论肝组织TGF—β1／Smad蛋白表达水平与肝纤维化程度相关，TGF-β1／Smad信号的增强可能促进了肝纤维化的进展。

关键词：肝硬化受体/转化生长因子β 蛋白质Smad 免疫组织化学

肝纤维化不同证型与基质金属蛋白酶及其抑制因子表达的关系

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中医杂志 2009年第4期50卷 343-346页

作者：徐珊周敏包剑锋张永生浙江中医药大学科研处杭州市310053 浙江中医药大学

目的观察肝纤维化不同证型与基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制因子的关系。方法清洁级雄性SD大鼠140只,依随机数字表法分为4组:正常对照组20只、单纯肝纤维化组30只、肝纤维化肝郁脾虚证组、肝纤维化气虚血瘀证组各45只。各模型组先用四氯... 详细信息

目的观察肝纤维化不同证型与基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制因子的关系。方法清洁级雄性SD大鼠140只,依随机数字表法分为4组:正常对照组20只、单纯肝纤维化组30只、肝纤维化肝郁脾虚证组、肝纤维化气虚血瘀证组各45只。各模型组先用四氯化碳注射法复制肝硬化疾病模型,然后肝郁脾虚证组附加夹尾和大黄灌胃法、气虚血瘀证组附加游泳疲劳法,并以相应药物干预。采用免疫组化法测定肝组织基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)水平。结果各模型组肝组织中MMP-2、MMP-9和TIMP-2均较正常组明显升高(P<0.01或P<0.05),以气虚血瘀组最为明显。结论基质金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化密切相关,在不同中医证型中表达有差异,可作为肝纤维化中医辨证分型及疗效评价的指标之一。

关键词：肝纤维化组织金属蛋白酶基质金属蛋白酶抑制剂肝郁脾虚气虚血瘀

合并非酒精性脂肪性肝病对慢性乙型肝炎的影响

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中华传染病杂志 2024年第1期42卷 51-55页

作者：孟莉扬刘芳包剑锋黄劲松浙江中医药大学第四临床医学院杭州310053 浙江中医药大学附属杭州市西溪医院肝病科杭州310023

目前,慢性乙型肝炎(CHB)仍然是重要的全球公共卫生疾病,是肝癌发生最主要的原因,全球大约50%的肝细胞癌新发病例和死亡病例来自中国。近年来,非酒精性脂肪性肝病这一代谢紊乱相关疾病的发生率急剧上升,CHB合并非酒精性脂肪性肝病在临床... 详细信息

目前,慢性乙型肝炎(CHB)仍然是重要的全球公共卫生疾病,是肝癌发生最主要的原因,全球大约50%的肝细胞癌新发病例和死亡病例来自中国。近年来,非酒精性脂肪性肝病这一代谢紊乱相关疾病的发生率急剧上升,CHB合并非酒精性脂肪性肝病在临床上越来越常见。两者之间的相互作用受到关注,肝脂肪变性的存在可能与纤维化进展有关,加速CHB患者罹患肝细胞癌。但脂肪变性也可能提高血清乙型肝炎表面抗原清除率,使实现功能性治愈的机会更高。本综述就CHB患者合并非酒精性脂肪性肝病的机制及其预后等方面进行归纳总结。

关键词：乙型肝炎,慢性肝肿瘤非酒精性脂肪性肝病分子机制综述

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非酒精性脂肪肝与肝癌关系的研究进展

中华实验和临床病毒学杂志 2014年第2期28卷 159-160,F0003页

作者：周语媚包剑锋浙江中医药大学 310053 杭州市西溪医院

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），是一种无过量饮酒史，患者饮用乙醇量介于少量（男性〈140g／周，女性〈70g／周）和过量（男性〉280g／周，女性〉140g／周）之间，主要以肝实质脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合症。根据其发展进... 详细信息

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），是一种无过量饮酒史，患者饮用乙醇量介于少量（男性〈140g／周，女性〈70g／周）和过量（男性〉280g／周，女性〉140g／周）之间，主要以肝实质脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合症。根据其发展进程不同，其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相关肝硬化和肝细胞癌（HCC）[1]。HCC是世界上第五大最常见的恶性肿瘤，在癌症相关死亡中居第二位[2]。

关键词：非酒精性脂肪肝非酒精性单纯性脂肪肝非酒精性脂肪性肝病非酒精性脂肪性肝炎临床病理综合症肝癌脂肪贮积脂肪变性

肝纤维化不同证型与血清透明质酸、转化生长因子-β_1关系的实验研究

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中华中医药杂志 2009年第2期24卷 199-201页

作者：徐珊包剑锋周敏张永生浙江中医药大学杭州310053

目的:观察不同证型的肝纤维化与血清透明质酸、转化生长因子-β1的关系。方法:分别设立正常对照组、单纯肝纤维化组、肝纤维化肝郁脾虚证组和气虚血瘀证组,采用CCl4注射法复制单纯肝硬化模型,肝郁脾虚证组附加夹尾和大黄灌胃法、气虚血... 详细信息

目的:观察不同证型的肝纤维化与血清透明质酸、转化生长因子-β1的关系。方法:分别设立正常对照组、单纯肝纤维化组、肝纤维化肝郁脾虚证组和气虚血瘀证组,采用CCl4注射法复制单纯肝硬化模型,肝郁脾虚证组附加夹尾和大黄灌胃法、气虚血瘀证组附加游泳疲劳法复制不同证型的肝纤维化模型,分别予相应药物干预。然后取血检测血清透明质酸和转化生长因子-β1水平。结果:各模型组透明质酸、转化生长因子-β1含量均升高较正常对照组有显著差异(P<0.05或P<0.01),且均以气虚血瘀组最为明显;药物治疗后有不同程度缓解。结论:透明质酸、转化生长因子-β1和肝纤维化程度密切相关,可作为中医辨证分型、判断病情和指导治疗的客观指标之一。

关键词：肝纤维化透明质酸转化生长因子-β1

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床单元消毒法预防医院感染的效果评价

中华医院感染学杂志 2014年第1期24卷 242-244页

作者：范丽娟张曼李超丹包剑锋葛小玲杭州市西溪医院院感科浙江杭州310023 杭州市西溪医院检验科浙江杭州310023 杭州市西溪医院院科教科浙江杭州310023 杭州市西溪医院院感科ICU 浙江杭州310023

目的探讨医院ICU疑似或发生耐药鲍氏不动杆菌暴发流行时应用床单元区域消毒法进行消毒的效果。方法疑似泛耐药鲍氏不动杆菌暴发流行时,立即对ICU常态环境下进行第1次采样检测目标菌;腾空病房按常规方法终末消毒后进行第2次采样检测;改... 详细信息

目的探讨医院ICU疑似或发生耐药鲍氏不动杆菌暴发流行时应用床单元区域消毒法进行消毒的效果。方法疑似泛耐药鲍氏不动杆菌暴发流行时,立即对ICU常态环境下进行第1次采样检测目标菌;腾空病房按常规方法终末消毒后进行第2次采样检测;改进方法采用床单元区域消毒法重新消毒,并第3次采样检测目标菌。结果 ICU环境鲍氏不动杆菌第1次常态下总检出率45.5%,其中床单元组70.0%;第2次常规方法终末消毒后总检出率25.0%,床单元组62.5%;第3次采取床单元区域消毒法消毒后检出率0。结论采取床单元区域消毒法可使环境消毒更为彻底有效,在疑似或发生鲍氏不动杆菌医院感染暴发时,对切断传播途径有着积极的意义,是加强干预措施的重要组成部分。

关键词：床单元区域消毒法鲍氏不动杆菌暴发流行消毒效果

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多媒体技术在高中地理课堂教学中的作用

中国教育技术装备 2012年第4期 131-132页

作者：包剑锋河北省唐山市丰润区七树庄中学

随着现代教育教学技术的发展,多媒体技术已成为课堂教学中的重要教学手段。传统的教育模式已不能适应培养全面发展和具有高素质人才的需要。高中地理作为一门领域广、内容多、学科思维综合能力水平要求高的学科,如何在教学中运用多媒体... 详细信息

随着现代教育教学技术的发展,多媒体技术已成为课堂教学中的重要教学手段。传统的教育模式已不能适应培养全面发展和具有高素质人才的需要。高中地理作为一门领域广、内容多、学科思维综合能力水平要求高的学科,如何在教学中运用多媒体教学是每个教师应该研究的课题。

关键词：多媒体技术高中地理教学自主学习

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重视原发性肝癌的早期识别

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