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Effect of human hepatocyte growth factor on promoting wound healing and preventing scar formation by adenovirus-mediated gene transfer

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Chinese Medical Journal 2003年第7期116卷 1029-1033页

作者：哈小琴李元敏劳妙芬苑宾吴祖泽 Department of Experimental Hematology Beijing Institute of Radiation Medicine Beijing 100850 China Department

Objective To evaluate the effects of hepatocyte growth factor (HGF) on the prevention of scar formation and the promotion of wound healing by gene transfer Methods A total of 12 female New Zealand rabbits were used in this study Rabbits were anesthetized with an intravenous injection of sodium pentobarbital, and identical wounds were made over the ventral surface of each ear Five circular wounds, 7 mm in diameter, were created in each ear by excision through the skin to the underlying cartilage using sterile technique After the surgical procedures, 10 of the rabbits were randomly allocated to five groups, with 2 rabbits in each group: Ad HGF group 1, Ad HGF group 2, Ad HGF group 3, Ad GFP (a reporter gene) group and the solvent group Immediately after surgery, 6×10 7 pfu Ad HGF, 6×10 8 pfu Ad HGF, 6×10 9 pfu of Ad HGF, 6×10 9 pfu of Ad GFP, or same volume of solvent (PBS, pH 7.2) was applied once to each wound in groups 1 to 5, respectively One additional rabbit was used to evaluate the transfer efficiency of the adenovirus vector by transferring Ad GFP (6×10 9 pfu) into its wounds Ice slides of wounds from this animal were observed under fluorescence microscopy Another additional rabbit was used to evaluate the expression of HGF and TGFβ1 after transferring Ad HGF (6×10 9 pfu) into each of its wound Immunohistochemistry was used for detection Results The effect of HGF on reducing excessive dermal scarring was observed by adenovirus mediated gene transfer Transfection of the human HGF cDNA into skin wounds through an adenoviral vector suppressed the over expression of TGFβ1, which plays an essential role in the progression of dermal fibrogenesis Application of HGF to the wounds significantly enhanced wound healing and inhibited over scarring Conclusion HGF gene therapy could be a new approach for preventing excessive dermal scarring in wound healing

关键词： scar · wound healing · hepatocyte growth factor · gene transfer · adenoviral vector

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贮存温度对携带HGF基因的重组腺病毒Ad-HGF稳定性的影响

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军事医学科学院院刊 2004年第1期28卷 16-18,49页

作者：哈小琴王澜劳妙芬吴祖泽军事医学科学院放射医学研究所北京100850

目的 :探讨不同温度对重组腺病毒Ad_HGF保存时间的影响。方法 :以含 10 %甘油的Hanks液保存Ad_HGF(携带人肝细胞生长因子基因 )、Ad_GFP(携带绿色荧光蛋白基因 ) ,用快速细胞病变 (CPE)法、ELISA方法、流式细胞仪分别检测在不同贮存温度... 详细信息

目的 :探讨不同温度对重组腺病毒Ad_HGF保存时间的影响。方法 :以含 10 %甘油的Hanks液保存Ad_HGF(携带人肝细胞生长因子基因 )、Ad_GFP(携带绿色荧光蛋白基因 ) ,用快速细胞病变 (CPE)法、ELISA方法、流式细胞仪分别检测在不同贮存温度 (- 6 0℃ ,- 2 0℃ ,4℃ ,2 5℃和 37℃ )、不同保存时间的重组腺病毒对其感染滴度、目的基因表达和转染细胞效率的影响。结果 :- 6 0℃保存最长时间 4 4个月 ,其转染效率、HGF蛋白表达、病毒滴度未见明显下降 ;- 2 0℃保存 12个月各指标未见明显变化 ;4℃冰箱保存 2个月 ,其各项指标已有所下降 ,但不是很明显 ,而保存 7个月时 ,其转染效率、HGF蛋白表达量及病毒滴度均明显下降 ;2 5℃和 37℃保存 ,除病毒滴度外 ,其余指标呈逐日下降趋势。结论 :该病毒保存于 - 2 0℃以下性能是稳定的 ,可以满足临床贮存和应用条件。

关键词：重组腺病毒温度基因表达肝细胞生长因子保存稳定性

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共表达人p53、GM-CSF和B7-1基因的重组腺病毒的构建

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中国生物化学与分子生物学报 2001年第3期17卷 329-334页

作者：邱兆华劳妙芬吴祖泽军事医学科学院放射医学研究所北京100850

为开展肿瘤的复合基因治疗 ,构建以串联方式携带人野生型p53、GM CSF和B7 1基因的重组腺病毒穿梭质粒pBB 1 0 2 .将pBB 1 0 2与腺病毒包装质粒GT40 50共转染 2 93细胞 ,通过细胞内同源重组获得重组腺病毒BB 1 0 2 .在 2 93细胞中扩增病... 详细信息

为开展肿瘤的复合基因治疗 ,构建以串联方式携带人野生型p53、GM CSF和B7 1基因的重组腺病毒穿梭质粒pBB 1 0 2 .将pBB 1 0 2与腺病毒包装质粒GT40 50共转染 2 93细胞 ,通过细胞内同源重组获得重组腺病毒BB 1 0 2 .在 2 93细胞中扩增病毒 ,并通过氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒 ,获得高滴度和高纯度的病毒 .分别经免疫组织化学分析、ELISA和流式细胞分析 ,检测BB 1 0 2介导的人野生型p53、GM CSF和B7 1基因在喉癌细胞Hep 2中的表达 .结果表明 ,BB 1 0 2能够有效地将其所携带的目的基因导入Hep 2细胞并使其在细胞中高效表达 ,表达高峰期为转染后 2～ 4d ,此后随时间递减 ,可持续 1 0d以上 .

关键词：腺病毒抑癌基因p53 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子肿瘤免疫共刺激分子B7-1 基因治疗

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人胎肝基质细胞培养上清液中造血生长因子的分析

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中国应用生理学杂志 1990年第3期6卷 214-218页

作者：赵士富劳妙芬吴祖泽北京放射医学研究所

采用人胎肝造血基质细胞的体外液体培养技术,结合造血干细胞和祖细胞的体外测试方法,研究了造血基质细胞所释放的造血生长因子与造血干细胞和祖细胞之间的相互作用。结果表明,在适宜的条件下,人胎肝造血基质细胞可在体外传代培养达100d... 详细信息

采用人胎肝造血基质细胞的体外液体培养技术,结合造血干细胞和祖细胞的体外测试方法,研究了造血基质细胞所释放的造血生长因子与造血干细胞和祖细胞之间的相互作用。结果表明,在适宜的条件下,人胎肝造血基质细胞可在体外传代培养达100d之久。培养过程中,对不同时间收集的培养上清液进行测试的结果表明,这些贴壁细胞可以不断地释放多种造血活性物质。在100d培养过程中,上清液中始终都可以检出CFU-S增殖刺激物活性。培养第24天的上清液中还可检出BPF和GM-CSF活性。这些造血活性物质对CFU-S的生理状态和祖细胞的增殖与分化有着深刻的影响。但是在培养上清液中未检出IL-3样活性物质。

关键词：胎肝基质细胞上清液造血生长因子

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重组腺病毒介导人肝细胞生长因子在病理性瘢痕基因治疗研究中的应用

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中国科学（C辑） 2003年第1期33卷 65-70,T002页

作者：哈小琴苑宾李元敏劳妙芬吴祖泽军事医学科学院放射医学研究所北京l00850

采用细胞内质粒DNA同源重组方法,将人肝细胞生长因子基因构建于E1,E3区缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体上,获得携带人肝细胞生长因子基因(HGF)的重组腺病毒Ad—HGF.在293细胞中扩增后用氯化铯密度梯度离心法扩增制备Ad—HGF和Ad—GFP(携... 详细信息

采用细胞内质粒DNA同源重组方法,将人肝细胞生长因子基因构建于E1,E3区缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体上,获得携带人肝细胞生长因子基因(HGF)的重组腺病毒Ad—HGF.在293细胞中扩增后用氯化铯密度梯度离心法扩增制备Ad—HGF和Ad—GFP(携带绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒),然后,用Ad—GFP和Ad—HGF体外分别转染原代培养的兔耳瘢痕成纤维细胞,观察体外转染效率及表达,并以新西兰兔耳瘢痕为体内模型,观察局部瘢痕组织中一次性注射Ad—HGF后对已形成瘢痕的治疗作用.结果显示:(i)Ad—GFP感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后,3 d时转染效率为(36.8±14.1)％,并持续表达20 d以上.(ii)用ELISA方法检测Ad—HGF感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后HGF的表达,结果感染后3 d表达量约为76 ng/4.0×105细胞.(iii)用兔耳瘢痕模型观察在瘢痕内注射不同剂量(8.6×109,8.6×108,8.6×107,8.6×106pfu)的Ad—HGF,于注射后第32天肉眼可见Ad—HGF治疗组瘢痕较治疗前明显缩小、变薄,甚至与周围皮肤在同一水平.这一效应呈剂量依赖性:大、中剂量组(8.6×109,8.6×108pfu)治疗前后瘢痕肥大指数的减少有统计学意义(P<0.05),尚可见不同程度再生的丛状新生毛,低剂量组(8.6×107,8.6×106pfu)治疗后瘢痕肥大指数有减小但无统计学意义。

关键词：病理性瘢痕基因治疗创伤修复腺病毒介导人肝细胞生长因子基因重组整形外科

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重组腺病毒和质粒对心肌缺血治疗效果的比较

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军事医学科学院院刊 2003年第1期27卷 16-18页

作者：张友荣吴丹莉劳妙芬毕建进吴祖泽军事医学科学院放射医学研究所北京100850

目的 :研究不同载体对基因治疗效果的影响。方法 :采用本实验室建立的犬心肌缺血动物模型 ,通过冠状动脉造影和TTC染色两种方法比较了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad_HGF和质粒puDKH对心肌缺血的治疗效果 ;并且在体外采用绿色荧... 详细信息

目的 :研究不同载体对基因治疗效果的影响。方法 :采用本实验室建立的犬心肌缺血动物模型 ,通过冠状动脉造影和TTC染色两种方法比较了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad_HGF和质粒puDKH对心肌缺血的治疗效果 ;并且在体外采用绿色荧光蛋白报告基因测定了不同载体对原代心肌细胞的转染率。结果 :重组腺病毒Ad_HGF对心肌细胞的转染率和心肌缺血的治疗效果均好于重组质粒puDKH。结论

关键词：腺病毒科重组质粒基因疗法心肌缺血治疗结果

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新生牛肝脏生长因子的纯化及其理化特性与生物活性

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中国应用生理学杂志 1992年第2期8卷 130-134页

作者：卜凤荣魏启胜劳妙芬吴祖泽军事医学科学院放射医学研究所北京100850

新生牛肝细胞生长因子是一种热稳定、蛋白酶及酸化(pH<1.5)敏感的蛋白质或多肽。研究结果表明,它可促进肝来源的细胞系的DNA合成,但不能刺激非肝来源细胞系的DNA合成。它还可提高某些化合物(CCl_4,D-Gal)引起的急性肝衰竭小鼠的存活率。

关键词：肝生长因子纯化急性肝衰竭

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腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对大鼠心肌缺血的基因治疗

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科学通报 2002年第22期47卷 1726-1729页

作者：吴丹莉劳妙芬邱兆华哈小琴吴祖泽张友荣军事医学科学院放射医学研究所实验血液学实验室北京100850 中国人民解放军总医院北京100853

为研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子对心肌缺血基因治疗的可行性,首先用RT-PCR方法从人胎盘cDNA文库中克隆人肝细胞生长因子(HGF)基因全长编码区cDNA,通过脂质体共转染和细胞内质粒同源重组的方法构建了携带肝细胞生长因子基因的重组... 详细信息

为研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子对心肌缺血基因治疗的可行性,首先用RT-PCR方法从人胎盘cDNA文库中克隆人肝细胞生长因子(HGF)基因全长编码区cDNA,通过脂质体共转染和细胞内质粒同源重组的方法构建了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad-HGF.经过在293细胞系内的扩增和氯化铯密度梯度离心获得大量纯化的重组腺病毒.体外实验中用ELISA方法证明肝细胞生长因子能在原代培养的乳大鼠心肌细胞中表达并分泌到培养上清液中.然后用MTT方法测定了其对内皮细胞的刺激增殖作用.活体实验中用绿色荧光蛋白基因作为报告基因检测了腺病毒在大鼠体内的分布和表达持续时间,通过大鼠冠状动脉结扎后制作的心肌缺血动物模型,证明重组腺病毒Ad-HGF对大鼠心肌缺血的治疗是有效的.以上结果说明Ad-HGF的构建是成功的,在体内外都显示了其生物学活性,为基因治疗缺血性心脏病提供了实验依据.

关键词：心肌缺血基因治疗重组腺病毒肝细胞生长因子腺病毒载体冠心病

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Gene therapy for pathological scar with hepatocyte growth factor mediated by recombinant adenovirus vector

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Science China(Life Sciences) 2003年第3期46卷 320-327页

作者：哈小琴苑宾李元敏劳妙芬吴祖泽 Institute of Radiation Medicine Academy of Military Medical Sciences Beijing 100850 China

A complementary DNA (cDNA) encoding human hepatocyte growth factor was intro-duced into a replication-defective type 5 adenovirus (lacking E1, E3 domains) vector by homolo-gous recombination of intracellular plasmid DNA, thus a recombinant vector containing HGF (Ad-HGF) was obtained. Ad-HGF and Ad-GFP (adenovirus vector carrying green fluorescence protein gene) were expanded in 293 cells and purified by cesium chloride gradient centrifugation for large-scale preparation, then were infected to the primarily cultured scar fibroblast of rabbit ear to observe the transfer efficiency and expression level of HGF in vitro. To evaluate the effect of Ad-HGF on established scar Ad-HGF solution was injected into excessively formed scar, which bears some clinical and histologic similarities to human hypertrophic scars. The results showed that: (i) the transfer efficiency was 36.8%±14.1% on day 3 in primarily cultured scar fibroblasts treated with Ad-GFP and lasted more than 20 d; (ii) high-level expression of HGF protein was de-tected by means of ELISA in supernatant of scar fibroblasts treated with Ad-HGF, the amount of expression was 76 ng/4.0×105 cells on day 3; (iii) on day 32 after a single intradermal injection of Ad-HGF at different doses (8.6×109 pfu, 8.6×108 pfu, 8.6×107 pfu, 8.6×106 pfu) per scar, most of the scars in the former two dose groups were dramatically flattened, some were even similar to that of the normal skin. The value of HI (hypertrophic index) showed that there was a therapeutic effect of Ad-HGF on scars at the dose of 109 pfu and 108 pfu. Whereas no therapeutic effects were seen at lower dose (107 pfu and 106 pfu of Ad-HGF) groups. In addition, clusters of hair were ob-served to different extent on healed wound treated with Ad-HGF. Histopathologic examination re-vealed that in most healed wounds of Ad-HGF treated group, the dermal layer was thinner, the amount of fibrous tissue was much fewer, and hair follicles growth and sebaceous glands were observ

关键词： scar, hepatocyte growth factor, gene therapy, adenovirus vector.

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携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒对犬心肌缺血的基因治疗

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科学通报 2004年第13期49卷 1278-1282页

作者：吴丹莉张友荣劳妙芬袁丽珍王澜哈小琴吴祖泽军事医学科学院放射医学研究所实验血液学实验室北京100850

为了进一步研究重组腺病毒Ad-HGF对心肌缺血的治疗效果及其安全性,在体外实验和大鼠实验的基础上制作了犬心肌缺血的模型,从3个方面评价Ad-HGF对心肌缺血的治疗效果.首先,通过冠状动脉造影观察侧支循环形成的情况,发现治疗组动物的侧支... 详细信息

为了进一步研究重组腺病毒Ad-HGF对心肌缺血的治疗效果及其安全性,在体外实验和大鼠实验的基础上制作了犬心肌缺血的模型,从3个方面评价Ad-HGF对心肌缺血的治疗效果.首先,通过冠状动脉造影观察侧支循环形成的情况,发现治疗组动物的侧支循环比对照组丰富;然后,对心脏切片进行TTC染色,并通过图像分析确定缺血区面积,结果显示治疗组动物的缺血区明显小于对照组;最后,从心肌中回收彩色微球计算局部心肌血流量,结果显示治疗组动物的局部心肌血流量基本恢复到了结扎前的水平.另外,在长期毒性研究中,用中和方法检测了腺病毒抗体产生的情况,发现腺病毒抗体在第4次注射后产生,达到高峰后缓慢下降,于停药12周后消失.总之,Ad-HGF对心肌缺血的治疗是有效的,同时也会诱导机体产生抗体中和体内的腺病毒,这可能是腺病毒载体的清除机制.

关键词：肝细胞生长因子心肌缺血基因治疗重组腺病毒中和性抗体冠心病

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