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大鼠胰岛素瘤实验模型的建立及其应用

中国医药生物技术 2013年第3期8卷 178-183页

作者：彭亮刘虹麟成兰云房青许世清门秀丽娄晋宁张文健中日友好医院临床医学研究所北京100029

目的通过移植大鼠胰岛素瘤INS-1细胞至糖尿病小鼠肾包膜下使之形成胰岛素瘤,并诱导其发生凋亡,建立可用于研究胰岛β细胞凋亡机制的动物模型。方法将5×106INS-1细胞接种于链脲霉素(STZ)造模的糖尿病小鼠左肾包膜下,监测动物空腹血糖和... 详细信息

目的通过移植大鼠胰岛素瘤INS-1细胞至糖尿病小鼠肾包膜下使之形成胰岛素瘤,并诱导其发生凋亡,建立可用于研究胰岛β细胞凋亡机制的动物模型。方法将5×106INS-1细胞接种于链脲霉素(STZ)造模的糖尿病小鼠左肾包膜下,监测动物空腹血糖和血清胰岛素水平的变化,当血糖趋近正常后摘取动物左侧肾脏并检测其血糖和血清胰岛素水平的变化;固定包埋摘取的肾脏,进行HE染色以及胰岛素的免疫组化染色,确定胰岛素瘤模型的建立。在胰岛素瘤动物模型中,腹腔给予毒胡萝卜素(TG)或软脂酸钠(PA),监测给药后动物空腹血糖的变化,当血糖浓度出现逆转时,摘取动物左侧肾脏,通过TUNEL原位染色法检测移植瘤细胞的凋亡。结果将INS-1细胞移植到糖尿病小鼠肾包膜下后,从第9天开始,动物空腹血糖进行性降低,血清胰岛素水平逐渐升高,当动物血糖接近至正常时,摘取动物左肾导致动物血糖显著升高,在摘取的左肾可见明显的移植瘤,免疫组织化学染色显示移植瘤细胞为胰岛素阳性。在胰岛素瘤动物模型给予TG或PA刺激后,动物空腹血糖出现逆转,显著升高,血清中胰岛素含量明显降低,摘取动物左侧肾脏后,TUNEL原位染色发现移植瘤内有明显的细胞凋亡。结论大鼠胰岛素瘤INS-1细胞肾包膜下移植可以建立胰岛素瘤动物模型,应用此动物模型可以在体内研究胰岛β细胞凋亡的机制。

关键词：胰岛素瘤模型,动物肾包膜下测定胰岛素分泌细胞 INS-1细胞系

糖尿病患者血清对人视网膜内皮细胞凝血纤溶活性和氧化应激的影响

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中日友好医院学报 2011年第1期25卷 32-36,F0004页

作者：许世清刘虹麟李宓叶丽亚徐亚平张文健中日友好医院临床医学研究所北京100029 中山大学附属第五医院肾内科珠海519000

目的:研究糖尿病患者血清对培养的人视网膜内皮细胞凝血纤溶活性和氧化应激的影响。方法:分离人胚胎视网膜组织内皮细胞(HREC),用糖尿病患者血清或正常人血清分别培养48h,应用ELISA法检测HREC释放的凝血纤溶因子;应用试剂盒检测细胞内... 详细信息

目的:研究糖尿病患者血清对培养的人视网膜内皮细胞凝血纤溶活性和氧化应激的影响。方法:分离人胚胎视网膜组织内皮细胞(HREC),用糖尿病患者血清或正常人血清分别培养48h,应用ELISA法检测HREC释放的凝血纤溶因子;应用试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)水平;应用化学显色法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、黄嘌呤氧化酶(XOD)的水平及蛋白激酶C(PKC)激动剂和抑制剂对其影响。结果:糖尿病患者血清使HREC组织因子增多、尿激酶型纤溶酶原激活物降低和纤溶酶原激活物抑制物增加,与正常血清组相比具有显著差异。与正常人血清组相比,糖尿病患者血清使HREC内ROS生成增多,XOD水平升高,并且这种作用可被PKC激动剂促进,被PKC抑制剂降低。结论:糖尿病患者血清诱导视网膜内皮细胞出现高凝血、低纤溶和氧化应激的功能改变,并且PKC的激活在氧化应激反应中发挥重要作用。

关键词：糖尿病视网膜病变内皮细胞凝血纤溶氧化应激蛋白激酶C

糖基化终末产物上调人胰岛微血管内皮细胞黏附分子的表达和白细胞黏附

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中华糖尿病杂志 2014年第6期6卷 411-416页

作者：刘虹麟许世清王在彭亮房青邓婷婷游嘉娄晋宁张文健中日友好医院临床医学研究所北京100029

目的研究糖基化终末产物（AGEs）对人胰岛微血管内皮细胞（HIMVEC）黏附分子表达和白细胞黏附的影响.方法 HIMVEC细胞在200 mg/L的AGEs刺激后,用细胞基础的酶联免疫吸附法（ELISA）和Western blotting法检测细胞表面黏附分子的表达;并... 详细信息

目的研究糖基化终末产物（AGEs）对人胰岛微血管内皮细胞（HIMVEC）黏附分子表达和白细胞黏附的影响.方法 HIMVEC细胞在200 mg/L的AGEs刺激后,用细胞基础的酶联免疫吸附法（ELISA）和Western blotting法检测细胞表面黏附分子的表达;并与BCECF标记的白细胞共培养检测与白细胞的黏附能力.采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting分别检测HIMVEC细胞上AGEs受体（RAGE）、蛋白激酶Cβ（PKC β）和蛋白激酶A（PKA）的mRNA表达情况.随后给予PKC β抑制剂LY333531或PKA激活剂8-Br-cAMP,观察对HIMVEC黏附分子表达的影响及和白细胞黏附的影响.两组间比较采用t检验进行分析.结果与对照组相比,AGEs处理后HIMVEC表达P选择素、E选择素和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）均上调（分别为1.10 ±0.13比0.64±0.14,0.83 ±0.06比0.47 ±0.05,0.87 ±0.09比0.43±0.07,t =4.93、9.40、7.61,均P＜0.05）,并且与白细胞的黏附较对照组明显增加（54 ±4比23 ±3,t=12.69,P＜0.05）.与AGEs组比较,RAGE抗体组P选择素、E选择素和VCAM-1的表达明显降低,组间差异具有统计学意义（t=5.69、6.89、5.43,均P＜0.05）.RAGE抗体组白细胞黏附明显少于AGEs组（54±4比31 ±4,t=8.22,P＜0.05）.与对照组相比,AGEs处理HIMVEC 4 h和18h,在mRNA水平和蛋白质水平均检测到RAGE和PKCβ的表达上调,但PKA的表达下调（t=10.94、7.76、21.82、5.85、10.96、11.47,均P＜0.05）.与AGEs组相比,在AGEs处理时给予PKCβ抑制剂LY333531或PKA激活剂8-Br-cAMP,均可降低HIMVEC上P选择素、E选择素和VCAM-1的表达水平（=7.60、6.60、6.25、11.58、4.08、3.47,均P＜0.05）,并减少白细胞的黏附（t=7.67、8.89,均P＜0.05）.结论 AGEs通过RAGE受体上调PKCβ和下调PKA增加HIMVEC上黏附分子的表达,促进白细胞的黏附,可能是糖尿病状态下胰岛中白细胞浸润的机制之一.

关键词：糖基化终末产物人胰岛微血管内皮细胞黏附分子白细胞

Tet-on系统对胰岛细胞瘤中TRB3基因的表达调控作用

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肝胆外科杂志 2008年第5期16卷 371-374页

作者：钱波张文健徐亚萍刘虹麟张娜徐世清娄晋宁中国医学科学院中国协和医科大学研究生院北京100730 中国医学科学院中国协和医科大学中日临床研究所

目的构建Tet-on系统可控表达TRB3基因的胰岛细胞瘤细胞株。方法通过Tet-on系统将TRB3质粒转染INS-rβ(r9)细胞中,经潮霉素筛选,克隆扩增得到可诱导表达TRB3基因的细胞系。采用实时定量RT-PCR、细胞免疫化学和Western Blot检测该基因表... 详细信息

目的构建Tet-on系统可控表达TRB3基因的胰岛细胞瘤细胞株。方法通过Tet-on系统将TRB3质粒转染INS-rβ(r9)细胞中,经潮霉素筛选,克隆扩增得到可诱导表达TRB3基因的细胞系。采用实时定量RT-PCR、细胞免疫化学和Western Blot检测该基因表达的可诱导性。结果三种检测方法都显示,500ng/mlDOX诱导48h可使转染的r9细胞中TRB3基因表达达到峰值,mRNA表达可上调60倍。结论通过本研究结果得到可控的TRB3高表达细胞株,为进一步研究该基因在胰腺肿瘤细胞中的功能提供了良好的细胞模型。

关键词： TRB3 胰岛细胞瘤 Tet-on系统

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蛋白激酶的激活保护GK大鼠糖尿病肾病

蛋白激酶的激活保护GK大鼠糖尿病肾病

胰高血糖素样肽-1通过抑制糖原合成酶激酶-3β活性保护内质网应激诱导的β细胞凋亡

中华医学会糖尿病学分会第十六次全国学术会议

作者：张文健王慧姜永玮许世清彭亮刘虹麟房青娄晋宁中日友好医院

目的糖尿病微血管病变具有明显器官特异性,糖尿病肾病发生率高且严重威胁患者生命。糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)激活蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)和氧化应激可能参与其发病。由于蛋白激酶A(Protein kinas...

目的糖尿病微血管病变具有明显器官特异性,糖尿病肾病发生率高且严重威胁患者生命。糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)激活蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)和氧化应激可能参与其发病。由于蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)与PKC在许多细胞功能上起着相反作用,

关键词：

来源： cnki会议评论

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中日友好医院学报 2016年第3期30卷 157-160,I0001页

作者：王猛张文健许世清彭亮王在刘虹麟房青邓婷婷娄晋宁中国医学科学院北京协和医学院研究生院北京100730 中日友好医院临床医学研究所北京100029

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对内质网应激诱导的胰岛β细胞系INS-1细胞凋亡的影响及其机制。方法:培养INS-1细胞,接种后分组:正常对照组、0.1μM毒胡萝卜素(TG)处理组、0.5μM TG处理组、1μM TG处理组、GLP-1(10n M)处理组、TG+G... 详细信息

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对内质网应激诱导的胰岛β细胞系INS-1细胞凋亡的影响及其机制。方法:培养INS-1细胞,接种后分组:正常对照组、0.1μM毒胡萝卜素(TG)处理组、0.5μM TG处理组、1μM TG处理组、GLP-1(10n M)处理组、TG+GLP-1处理组、SB415286(10μM)处理组和TG+SB415286处理组。细胞处理后,TUNEL染色法检测细胞凋亡,Western blot检测蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,TG组INS-1细胞凋亡率均显著升高(P<0.05,P<0.01),随着TG浓度的增加Caspase-3活性逐渐升高。与TG处理组相比,TG和GLP-1共同处理组INS-1细胞凋亡率显著下降(P<0.01),且Caspase-3活性下降;TG和GLP-1共同处理组糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的活性下降。TG和SB415286共同处理组INS-1细胞凋亡率显著下降(P<0.05),且Caspase-3活性下降。结论 :GLP-1可以通过抑制GSK-3β活性减轻内质网应激引起的损伤从而保护β细胞。

关键词：胰高血糖素样肽-1 内质网应激 β细胞糖原合成酶激酶-3β

缺氧-复氧增强血小板介导的肿瘤细胞-内皮细胞黏附

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中国癌症杂志 2011年第1期21卷 22-29页

作者：张娜刘虹麟蔡寒青彭亮李成辉叶丽亚许世清杨治华娄晋宁张文健北京协和医学院研究生院肿瘤研究所北京100730 中日友好医院临床医学研究所麻醉科北京100029 吉林大学第二医院内分泌科吉林长春130041

背景与目的:血小板能够与进入血液循环的肿瘤细胞黏附而促进其转移,但其机制是否涉及血小板作为介导物直接促进肿瘤细胞和内皮细胞黏附还不清楚,而且瘤栓在微血管局部造成的缺氧环境是否也具有促进作用尚不明确。本研究分析血小板对肿... 详细信息

背景与目的:血小板能够与进入血液循环的肿瘤细胞黏附而促进其转移,但其机制是否涉及血小板作为介导物直接促进肿瘤细胞和内皮细胞黏附还不清楚,而且瘤栓在微血管局部造成的缺氧环境是否也具有促进作用尚不明确。本研究分析血小板对肿瘤细胞-内皮细胞黏附的影响及其相关黏附分子,以及缺氧-复氧在其中的作用。方法:将血小板和肿瘤细胞用荧光染料标记,通过荧光显微镜、连续光谱荧光仪以及激光共聚焦显微镜检测细胞的黏附情况;通过抗体阻断实验分析相关的细胞黏附分子,并在肠系膜血管上观察体内血小板促进肿瘤细胞在血管壁的黏附情况。结果:血小板与不同肿瘤细胞黏附能力不同,但都被缺氧-复氧所增强,并且不同肿瘤细胞与血小板的黏附被不同的抗血小板黏附分子的抗体阻断。人肝窦内皮细胞系(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)在缺氧-复氧后也明显增强与血小板的黏附,并且可以被抗黏附分子GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa、P-selectin和CD31的抗体阻断。LSEC与血小板预温育可明显增加肿瘤细胞在其上的黏附,并且可以被抗血小板黏附分子的抗体阻断。激光共聚焦显微镜显示,血小板位于肿瘤细胞和LSEC之间,介导了两者的黏附。动物实验证实,与血小板预温育的肿瘤细胞在肠系膜血管上的黏附增多,并可以被缺血-再灌注进一步增强。结论:血小板表面存在与血管内皮细胞和肿瘤细胞同时黏附的分子,血小板通过这些黏附分子介导肿瘤细胞-内皮细胞的黏附,这种黏附作用可以被缺氧-复氧增强。

关键词：血小板肝窦内皮细胞肿瘤细胞黏附缺血-再灌注

C肽对晚期糖基化终末产物诱导的大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

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中华糖尿病杂志 2015年第2期7卷 110-114页

作者：许世清刘虹麟娄晋宁王在彭亮房青游嘉邓婷婷郭彬张文健中日友好医院临床医学研究所北京100029

目的研究C肽对晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导的大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响及其机制。方法将大鼠。肾小球系膜细胞按照下列分组培养：对照组：正常培养基培养；AGEs组：培养基中含有200mg／LAGEs；AGEs＋C肽组：培养基中含有20... 详细信息

目的研究C肽对晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导的大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响及其机制。方法将大鼠。肾小球系膜细胞按照下列分组培养：对照组：正常培养基培养；AGEs组：培养基中含有200mg／LAGEs；AGEs＋C肽组：培养基中含有200mg／LAGEs和5μmol／LC肽；AGEs＋C肽＋H89组：预先用含有H89（终浓度10μmol／L）的培养基培养30min后加入AGEs（终浓度200mg／L）和c肽（终浓度5μmol／L）。采用荧光法检测细胞内活性氧的水平，应用格里斯反应检测细胞一氧化氮（NO）的生成水平，采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）或Western blotting检测晚期糖基化终末产物受体（RAGE）、蛋白激酶A（PKA）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达水平。采用非参数检验（Kruskal—WallisH检验）进行组间比较，采用Mann-WhitnevU检验进行两两比较。结果AGEs组系膜细胞生成ROS和NO较对照组增多（分别为193．7±6．4比136．1±4．9和27．2±4．7比15．5±0．7，均U=0，P〈0．05），C肽可以抑制ROS和NO的产生，AGEs＋C肽组的ROS和NO水平与AGEs组差异有统计学意义（分别为136．9±14．3比193．7±6．4；16．0±2．1比27.2±4．7；均U=0，P〈0．05）。与对照组相比，AGEs上调RAGE的表达，下调PKA的表达，并且AGEs可上调NOX4和iNOS的表达（分别为0．565±0．027比0．148±0．006，0．085±0．035比0．518±0．019，0．912±0．055比0．105±0．012，0．279±0．003比0．126±0．004，均U=0，P〈0．05）；C肽处理组较AGEs组RAGE的表达下调，PKA的表达上调，NOX4和iNOS的表达下调（分别为0．159±0．003比0．565±0．027，0．594±0．079比0．085±0．035，0．085±0．005比0．912±0．055，0．071±0．016比0．279±0．003，均U=0，P〈0．05）。与C肽组比较，H89组阻断PKA激活后，ROS和NO生成增多（分别为195．7±9．3比149．7±11．7，22．2±1．1比16．4±2．1，均U=0，P〈0．05），并且H89逆转C肽下调NOX4和iNOS表达的作用（H89组比c肽组分别为0．455±0．018比0．085±0．005，0．296±0．013比0．071±0．016，均U=0，P〈0．05）。结论C肽通过影响PKA信号通路抑制肾小球系膜细胞氧化应激。

关键词： C肽系膜细胞氧化应激蛋白激酶A 晚期糖基化终末产物

人胚胎主动脉血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

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中国医药生物技术 2012年第2期7卷 85-92页

作者：庄乾淑张文健叶丽亚刘虹麟曹妍婷成兰云丁浩娄晋宁刘鹏李建中苏州大学附属第一医院老年医学科 215006 中日友好医院临床医学研究所北京100029 中日友好医院麻醉科北京100029 河北联合大学基础医学院病理生理系唐山063000 中日友好医院血管外科北京100029

目的研究人胚胎血管内皮祖细胞(EPCs)分离、扩增及鉴定的方法,并评价其分化成血管内皮细胞的能力,为人胚胎血管来源EPCs作为干细胞技术治疗疾病的细胞材料提供依据。方法从14周龄流产人胚胎主动脉中应用胶原酶消化法分离获得EPCs,用含... 详细信息

目的研究人胚胎血管内皮祖细胞(EPCs)分离、扩增及鉴定的方法,并评价其分化成血管内皮细胞的能力,为人胚胎血管来源EPCs作为干细胞技术治疗疾病的细胞材料提供依据。方法从14周龄流产人胚胎主动脉中应用胶原酶消化法分离获得EPCs,用含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的低血清培养基体外扩增培养EPCs。分离培养的EPCs鉴定采用细胞免疫荧光染色、RT-PCR及流式细胞术,检测EPCs细胞的特异标志CD133、CD34和血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)。培养的EPCs应用VEGF进行诱导分化,并评价其分化成为血管内皮细胞的能力。结果分离的人胚胎主动脉EPCs细胞表达EPCs的标志分子CD133、CD34和VEGFR2。EPCs在体外特定低血清培养条件下表现很强的增殖能力。培养的EPCs细胞经过VEGF诱导后,细胞表达CD133明显降低,表达vWF、CD31和ELAM-1增强,并且体外成管能力和摄取Ac-LDL能力增强,表明细胞分化成为血管内皮细胞。结论人胚胎早期主动脉的EPCs具有很好的体外自我更新能力和分化成为血管内皮细胞的潜能,可作为EPCs治疗疾病的细胞材料。

关键词：血管内皮生长因子受体2 主动脉细胞分离细胞分化