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异体糖尿病大鼠来源脂肪干细胞移植治疗糖尿病大鼠创面的初步评价及其机制探讨

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中华烧伤杂志 2019年第9期35卷 645-654页

作者：董叫云弓家弘嵇晓芸田鸣刘英开青春陆树良宋菲上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心 200025 上海和睦家医院骨科 200336

目的探讨异体糖尿病大鼠来源脂肪干细胞(ASC)是否对糖尿病大鼠创面有促愈作用及其机制。方法(1)取56只12~16周龄雄性Wistar大鼠,按随机数字表法(分组方法下同)分为糖尿病组和健康组,每组28只。健康组大鼠不进行任何处理;糖尿病组大鼠于... 详细信息

目的探讨异体糖尿病大鼠来源脂肪干细胞(ASC)是否对糖尿病大鼠创面有促愈作用及其机制。方法(1)取56只12~16周龄雄性Wistar大鼠,按随机数字表法(分组方法下同)分为糖尿病组和健康组,每组28只。健康组大鼠不进行任何处理;糖尿病组大鼠于腹腔一次性注射10 g/L链脲佐菌素60 mg/kg,建立糖尿病模型。按随机数字表法取健康组和糖尿病组大鼠各4只,取腹股沟处脂肪组织,培养纯化ASC以获得健康大鼠来源ASC(下称nASC)和糖尿病大鼠来源ASC(下称dASC)。取第3代nASC和dASC(样本数均为3),流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD105、CD31、CD34及CD44的阳性表达率,确定纯度。(2)取健康组和糖尿病组剩余大鼠各24只,每只大鼠背部制作3个直径12 mm的圆形全层皮肤缺损创面。伤后即刻,分别于每只大鼠3个创面及其创缘皮下注射磷酸盐缓冲液(PBS)、2×10^7个/mL的nASC、2×10^7个/mL的dASC各0.5 mL。伤后1、3、7、12 d,按随机数字表法每组各取6只大鼠计算创面面积;取创面组织行苏木精-伊红染色,观察创面组织学形态。(3)对人ASC(hASC)进行传代培养,采用第4~7代细胞进行后续实验。将hASC分为7组,每组12个样本。空白对照组细胞用间充质干细胞培养液培养,单纯晚期糖基化终末产物(AGE)组、单纯蛋白组、单纯高糖组、单纯高渗透压组、AGE高糖联合组、蛋白高渗透压联合组细胞分别用加入终质量浓度100 mg/L AGE、100 mg/L牛血清白蛋白(BSA)、28 mmol/L D-葡萄糖、28 mmol/L甘露醇、100 mg/L AGE+28 mmol/L D-葡萄糖、100 mg/L BSA+28 mmol/L甘露醇的间充质干细胞培养液培养。培养2 h及2、4、6 d,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖情况。(4)取hASC,分为空白对照组、单纯AGE组、单纯高糖组、AGE高糖联合组,每组12个样本,同实验(3)相应组处理。培养0、2、4、6 d,流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD105、CD44、CD45阳性表达率以确定其稳态。(5)取hASC,分为AGE高糖联合组和蛋白高渗透压联合组,每组9个样本,同实验(3)相应组处理。培养2、4、6 d,采用花青素3-链霉亲和素双抗体夹心技术检测细胞内蛋白表达水平。对数据进行析因设计方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。结果(1)nASC、dASC的CD44阳性表达率均>96%,CD31、CD34阳性表达率低,CD105阳性表达率为40%左右,基本符合纯度要求。(2)2组大鼠组内3种方式处理创面伤后1 d面积均相近(P>0.05)。与组内PBS处理创面的(0.682 1±0.078 9)、(0.314 3±0.113 7)、(0.064 3±0.002 1)cm^2比较,健康组大鼠nASC处理创面面积于伤后3、7、12 d显著缩小[(0.464 1±0.092 6)、(0.223 9±0.072 7)、(0.034 3±0.012 5)cm^2,P0.05]。与组内dASC处理创面比较,健康组大鼠nASC处理创面面积于伤后3、7 d显著缩小(P0.05)。与组内PBS处理创面的(0.853 5±0.204 8)、(0.670 5±0.164 8)、(0.131 4±0.074 4)cm2比较,糖尿病组大鼠nASC处理创面面积于伤后3、7、12 d显著缩小[(0.633 4±0.132 5)、(0.331 8±0.023 5)、(0.074 2±0.003 8)cm^2,P0.05]。与组内dASC处理创面比较,糖尿病组大鼠nASC处理创面面积伤后3、7 d无明显改变(P>0.05),伤后12 d显著缩小(P<0.05)。伤后1 d各组大鼠组内3种方式处理创面组织学形态无明显差异。伤后3 d,2组大鼠nASC、dASC处理创面都有少量微血管形成,PBS处理创面几乎未见微血管形成。伤后7 d,2组大鼠nASC、dASC处理创面内可见较多小血管及成纤维细胞(Fb),PBS处理创面小血管及Fb略少。伤后12 d,2组大鼠nASC、dASC处理创面已基本被上皮组织覆盖;健康组大鼠PBS处理创面内肉芽组织不明显,糖

关键词：糖尿病伤口愈合脂肪干细胞晚期糖基化终末产物高糖

变性Ⅰ型胶原在人成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中的作用

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中华烧伤杂志 2018年第2期34卷 96-101页

作者：王志勇王西樵刘英开原博董叫云宋菲姜育智陆树良上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤整形科 200025

目的探讨变性Ⅰ型胶原在人成纤维细胞（Fb）向肌Fb分化中的作用。方法取烧伤瘢痕手术患者捐献的少量正常皮肤，组织块培养法获得人Fb，并进行传代培养，取第4代细胞进行以下实验。（1）取Fb，按随机数字表法分为正常胶原组和变性胶原组... 详细信息

目的探讨变性Ⅰ型胶原在人成纤维细胞（Fb）向肌Fb分化中的作用。方法取烧伤瘢痕手术患者捐献的少量正常皮肤，组织块培养法获得人Fb，并进行传代培养，取第4代细胞进行以下实验。（1）取Fb，按随机数字表法分为正常胶原组和变性胶原组，每组10孔。正常胶原组Fb接种于正常Ⅰ型胶原包被的盖玻片，变性胶原组Fb接种于变性Ⅰ型胶原包被的盖玻片。免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原（PCNA）表达，计算PCNA表达阳性细胞百分比。（2）另取Fb，同（1）进行分组处理，每组12孔，噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性。（3）另取Fb，同（1）进行分组处理，罗丹明－鬼笔环肽染色观察细胞微丝形态。（4）另取Fb，同（1）进行分组处理，免疫组织化学法检测细胞中α平滑肌肌动蛋白（α－SMA）表达，免疫荧光法检测细胞中OB钙黏蛋白表达。（5）另取Fb，按随机数字表法分为正常胶原组、变性胶原组和普通玻片组，每组6孔。正常胶原组和变性胶原组Fb处理同（1），普通玻片组Fb接种于无胶原包被的盖玻片。蛋白质印迹法检测细胞中α－SMA和OB钙黏蛋白表达。（6）另取Fb，同（5）进行分组处理，实时荧光定量反转录－聚合酶链反应法检测细胞中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原及α－SMA的mRNA表达。对数据行t检验、单因素方差分析、LSD检验。结果（1）变性胶原组PCNA表达阳性细胞百分比为（83±9）%，明显高于正常胶原组的（29±9）%（t＝13.53，P〈0.01）。（2）变性胶原组Fb的增殖活性为0.32±0.06，明显高于正常胶原组的0.25±0.05（t＝3.06，P〈0.01）。（3）正常胶原组Fb微丝均纵向平行排列，贯穿细胞长轴。变性胶原组Fb微丝更为密集、粗大。（4）正常胶原组Fb基本呈典型的长梭形；变性胶原组Fb形态发生变化，细胞明显铺展。变性胶原组Fb的α－SMA、OB钙黏蛋白表达较正常胶原组强。（5）变性胶原组、正常胶原组、普通玻片组Fb的α－SMA表达量分别为1.69±0.41、0.89±0.27、1.46±0.42，变性胶原组Fb的α－SMA表达量明显高于正常胶原组（P〈0.01）。变性胶原组、正常胶原组、普通玻片组Fb的OB钙黏蛋白表达量分别为5.17±0.28、2.21±0.10、4.01±0.56，变性胶原组Fb的OB钙黏蛋白表达量明显高于正常胶原组（P〈0.01）。（6）正常胶原组、变性胶原组与普通玻片组Fb中Ⅰ型胶原的mRNA表达量相近（F＝2.71，P〉0.05）。正常胶原组Fb中Ⅲ型胶原及α－SMA的mRNA表达量明显低于变性胶原组（P〈0.01）。结论变性Ⅰ型胶原影响Fb活性，诱导Fb向肌Fb分化。

关键词：瘢痕成纤维细胞细胞增殖胶原Ⅰ型胶原Ⅲ型变性胶原

烧伤后瘢痕组织中成纤维细胞ET-1表达及血管新生和胶原分布研究

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上海交通大学学报（医学版） 2010年第7期30卷 839-842页

作者：向军王西樵刘英开青春陆树良上海交通大学医学院瑞金医院灼伤整形科上海市烧伤研究所上海200025

目的研究烧伤后不同时期瘢痕组织中成纤维细胞内皮素1(ET-1)表达以及新生血管形成和胶原纤维分布情况。方法收集烧伤创面愈合后不同时期瘢痕组织标本(发生早期、增生期、消退期、成熟期各8例)和正常皮肤组织标本(正常对照,n=8)作为研究... 详细信息

目的研究烧伤后不同时期瘢痕组织中成纤维细胞内皮素1(ET-1)表达以及新生血管形成和胶原纤维分布情况。方法收集烧伤创面愈合后不同时期瘢痕组织标本(发生早期、增生期、消退期、成熟期各8例)和正常皮肤组织标本(正常对照,n=8)作为研究对象。体外分离培养成纤维细胞,RT-PCR半定量检测成纤维细胞中ET-1mRNA的表达情况;新生血管标志物CD34免疫组织化学染色检测瘢痕组织内新生血管形成(CD34阳性细胞面积百分率);Masson三色染色法观察瘢痕组织胶原纤维分布。结果瘢痕组织的发生早期,成纤维细胞ET-1mRNA的表达水平逐渐升高,并于增生期达到高峰,消退期逐步降低,成熟期下降至最低水平。发生早期、增生期、消退期、成熟期瘢痕组织及正常对照组织中CD34阳性细胞面积百分比分别为(1.961±0.159)%、(3.432±0.237)%、(0.412±0.026)%、(0.354±0.025)%和(0.1917±0.018)%,不同时期瘢痕组织间及其与正常对照比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Masson三色染色观察发现,增生期瘢痕组织胶原纤维显著增加,排列致密。结论烧伤后瘢痕发生和演变过程中,成纤维细胞ET-1表达水平呈现发生早期逐步升高、增生期达到高峰、消退期下降的变化,与不同时期瘢痕组织中新生血管形成及胶原纤维分布变化趋势一致。

关键词：成纤维细胞内皮素-1 新生血管胶原纤维烧伤瘢痕

烧伤患者循环内皮细胞微粒表达变化的临床意义

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中华创伤杂志 2018年第5期34卷 441-448页

作者：唐佳俊吴敏洁刘英开黄丽芳上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心上海200025

目的探讨烧伤休克和烧伤感染患者内皮细胞微粒（EMPs）变化的临床意义.方法采用回顾性病例对照研究分析2009年1月-2015年12月收治的90例烧烫伤患者的临床资料,根据病伤分为休克组（57例）和感染组（33例）;感染组又分为脓毒症组（18... 详细信息

目的探讨烧伤休克和烧伤感染患者内皮细胞微粒（EMPs）变化的临床意义.方法采用回顾性病例对照研究分析2009年1月-2015年12月收治的90例烧烫伤患者的临床资料,根据病伤分为休克组（57例）和感染组（33例）;感染组又分为脓毒症组（18例）和非脓毒症组（15例）.选取17例正常成人作为对照组.患者器官功能障碍的严重程度采用序贯脏器功能衰竭评分（SOFA）进行评估.采用流式细胞术检测各组血浆中CD31＋、CD51＋、CD144＋、CD54＋、CD62E＋EMPs数量.比较休克组和感染组EMPs数量、血浆总体微粒的比值;比较休克组内16例液体复苏治疗前后EMPs数量、血浆总体微粒的比值;比较感染组内脓毒症组与非脓毒症组EMPs数量、血浆总体微粒的比值.分析EMPs数量和比值与SOFA和烧伤面积的相关性. 结果休克组和感染组CD31＋、CD51＋、CD144＋、CD54＋、CD62E＋ EMPs数量均高于对照组（P＜0.05或＜0.01）;休克组CD31＋、CD51＋、CD54＋占血浆总体微粒的比值高于对照组（P＜0.05或＜0.01）;感染组CD31＋、CD54＋ EMPs占血浆总体微粒的比值高于对照组（P＜0.05或＜0.01）.休克组CD64E＋ EMPs数量、CD44＋、CD62E＋ EMPs占血浆总体微粒的比值高于感染组（P＜0.05或0.01）.CD31＋ EMPs占血浆总体微粒的比值在休克液体复苏治疗前高于复苏后（8.8±1.7：5.2±0.9）（P＜0.05）.脓毒症组CD31＋、CD54＋EMPs比值明显高于非脓毒症组（8.0±1.3：4.5±1.0;18.3±2.2：8.9 ±1.4）（P＜0.05或＜0.01）.EMPs数量与SOFA相关（P＜0.05或＜0.01）.CD54＋ EMPs比值与SOFA相关（P＜0.01）.CD54＋ EMPs数量和比值与烧伤面积相关（P＜0.05）,CD144＋ EMPs比值与烧伤面积相关（P＜0.05）. 结论特异性表达CD31＋、CD51、CD54＋、CD144＋、CD62E＋的EMPs可能在烧伤病理损害过程中发挥一定的作用,可作为烧伤后内皮细胞功能变化的评价指标.表达CD54＋的EMPs在判断烧伤器官功能障碍及其严重程度上有一定意义.

关键词：烧伤休克感染内皮细胞序贯脏器功能衰竭评分

抗有丝分裂药物和放射疗法对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的治疗作用

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中华创伤杂志 2009年第9期25卷 799-802页

作者：王西樵刘英开韦俊王志勇姜育智青春陆树良上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海市烧伤研究所 200025

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是创伤后局部过度修复的结果，以局部皮肤发红、表面充血、组织隆起、质地坚硬、同时伴有痒痛症状为主要特征的病理现象。病理性瘢痕一旦形成，往往经历长短不一的时间才能逐渐成熟。

关键词：增生性瘢痕瘢痕疙瘩抗有丝分裂治疗作用放射疗法病理性瘢痕药物皮肤发红

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增生性瘢痕中血管内皮细胞生物学功能的研究

中华烧伤杂志 2007年第3期23卷 219-221页

作者：王西樵陆树良毛志刚刘英开上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤科 200025

目的探讨增生性瘢痕中血管内皮细胞的生物学功能及其与瘢痕形成的关系方法取人增生性瘢痕组织和正常皮肤组织,进行组织学观察。分离和纯化2种标本中的血管内皮细胞,应用酶联免疫吸附测定法分别检测单个血管内皮细胞中转化生长因子β_1(T... 详细信息

目的探讨增生性瘢痕中血管内皮细胞的生物学功能及其与瘢痕形成的关系方法取人增生性瘢痕组织和正常皮肤组织,进行组织学观察。分离和纯化2种标本中的血管内皮细胞,应用酶联免疫吸附测定法分别检测单个血管内皮细胞中转化生长因子β_1(TGF-β_1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、血小板源性生长因子(PDGF)、内皮素1(ET-1)和血管内皮生长因子(VEGF)的水平。结果光学显微镜下可见正常皮肤微血管数目较少;增生性瘢痕微血管数目增多,血管狭长扭曲甚至闭塞。透射电镜可见增生性瘢痕中毛细血管管腔狭窄,有内皮细胞脱落。增生性瘢痕中血管内皮细胞分泌TGF-β_1、PDGF、ET-1、VEGF、FGF2的水平分别为(60±8)、(30±4)、(0.12±0.03)、(52±5)、(18.1±1.2)μg/个细胞,明显低于正常皮肤(P<0.05)。结论增生性瘢痕中血管内皮细胞生物学功能减退,可能与瘢痕中胶原的大量产生和缺氧有关。

关键词：内皮细胞细胞因子类瘢痕

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兔无细胞真皮基质的研制

上海第二医科大学学报 2003年第3期23卷 223-226页

作者：向军刘英开陆树良青春廖镇江史济湘上海第二医科大学瑞金医院灼伤整形科上海市烧伤研究所上海200025

目的探讨制备兔无细胞真皮基质(ADM)的最佳方法。方法选用三种不同的去表皮处理液,即高渗NaCl溶液、dispase Ⅱ分离酶和嗜热蛋白酶(thermolysin),结合去污剂0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)处理,分别制备兔ADM,并对其进行组织学检测。结果... 详细信息

目的探讨制备兔无细胞真皮基质(ADM)的最佳方法。方法选用三种不同的去表皮处理液,即高渗NaCl溶液、dispase Ⅱ分离酶和嗜热蛋白酶(thermolysin),结合去污剂0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)处理,分别制备兔ADM,并对其进行组织学检测。结果高渗NaCl-SDS制备的兔ADM尚有少量表皮残留,乳白色中夹杂浅黄色,组织学观察可见真皮中有较多细胞碎屑;而经dispase Ⅱ-SDS和thermolysin-SDS制备的兔ADM表皮完全去除,呈乳白色,组织学观察发现真皮中已不见任何细胞成分,胶原纤维排列规则。电镜观察,上述三种方法制备的兔ADM基底膜结构均完整。结论由dispase Ⅱ-SDS法和thermolysin-SDS法制备的兔ADM达到了完全去细胞化,符合制备要求。

关键词：无细胞真皮基质基底膜复合物组织形态学 dispaseⅡ-SDS法 thermolysin-SDS法去表皮处理

大鼠大脑中动脉缺血后环氧合酶-2表达的研究

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中风与神经疾病杂志 1999年第5期16卷 275-276页

作者：黄海燕罗毅男刘新华刘今是刘勇刘英开长春白求恩医科大学一院神经外科 130021 长春市中心医院干部病房镇赉县医院长春市自来水公司医院

目的　研究大鼠大脑中动脉缺血后环氧合酶－２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２，ＣＯＸ－２）的表达。方法　采用栓线法制备大脑中动脉缺血模型，利用免疫组化方法检测ＣＯＸ－２表达情况。结果　脑缺血区的周围大脑皮质及远隔的... 详细信息

目的　研究大鼠大脑中动脉缺血后环氧合酶－２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２，ＣＯＸ－２）的表达。方法　采用栓线法制备大脑中动脉缺血模型，利用免疫组化方法检测ＣＯＸ－２表达情况。结果　脑缺血区的周围大脑皮质及远隔的海马回区域有ＣＯＸ－２蛋白质表达。结论　在ＣＯＸ－２

关键词：环氧合酶-2 花生四烯酸局灶性脑缺血大鼠

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组织张力对组织胶原排列结构的影响

中华创伤杂志 2009年第9期25卷 779-782页

作者：刘英开王西樵韦俊青春陆树良上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海市烧伤研究所 200025

目的研究组织张力的变化对胶原排列结构的影响，探讨组织结构和力学性质的关系。方法通过倒置相差显微镜、HE染色及透射电镜观察三种不同张力的胶原凝胶中成纤维细胞（fibroblast，Fb）的细胞形态、走行方向及胶原的排列结构；免疫荧光... 详细信息

目的研究组织张力的变化对胶原排列结构的影响，探讨组织结构和力学性质的关系。方法通过倒置相差显微镜、HE染色及透射电镜观察三种不同张力的胶原凝胶中成纤维细胞（fibroblast，Fb）的细胞形态、走行方向及胶原的排列结构；免疫荧光检测Fb中α平滑肌肌动蛋白（α—smooth muscle actin，α-SMA）的表达及排布。结果倒置相差显微镜、HE染色及透射电镜观察发现，单层培养基质（monolayer gels，MG）及锚着基质（anchored gels，AG）张力高，张力分布各向异性，Fb呈长梭形，极性明显，胶原纤维沿细胞长轴平行排列，尤以MG更为明显；游离基质（floating gels，FG）张力低，张力分布各向同性，Fh为多角形或星形，胶原纤维呈网状排列；免疫荧光检测显示，MG及锚着基质中Fb表达大量沿细胞长轴排列的α—SMA，尤以MG明显，游离基质中Fh少有α—SMA表达。MG及锚着基质中Fh细胞形态、走行方向、α-SMA的表达及胶原的排列结构近似于肉芽组织，游离基质则近似于正常皮肤组织或重塑完成后的创面组织。结论皮组织的组织结构与组织的力学性质是相对应的，组织的排列结构是组织力学性质的体现，两者是不可截然分开的。

关键词：拉伸强度成纤维细胞胶原组织结构