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基于全基因合成技术的南极假丝酵母脂肪酶B基因的密码子优化研究

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基于全基因合成技术的南极假丝酵母脂肪酶B基因的密码子优化研究

作者：刘立营华中科技大学

学位级别：硕士

南极假丝酵母脂肪酶B (Candida antarctica lipase B, CALB)具有广谱底物接受性和对映体选择性,广泛应用于食品、化工、前体药物的合成和生物能源等领域。利用基因工程技术实现其异源高效表达,对该酶的工业化生产具有重要意义。本研究... 详细信息

南极假丝酵母脂肪酶B (Candida antarctica lipase B, CALB)具有广谱底物接受性和对映体选择性,广泛应用于食品、化工、前体药物的合成和生物能源等领域。利用基因工程技术实现其异源高效表达,对该酶的工业化生产具有重要意义。本研究以C. antarctica LF058菌株lipB基因(GenBank: Z30645.1)为出发基因,为提高CalB在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达量,在利用生物信息学技术对CalB进行了密码子优化和改造的基础上,采用PCR-based accurate synthesis全基因合成方法(PAS)分别合成了原始基因CalB与优化后基因CalBM;以CalB和CalBM基因为基础,构建了一系列适于在P. pastoris中表达的组成型和诱导型载体,并分别转至P. pastoris GS115、SMD1168和X-33中,实现了该基因在各宿主菌中的功能性表达,获得了高效表达的基因工程菌,并初步分析了重组CALB的酶学性质。本文主要工作如下: 1.为提高CalB在P. pastoris中的表达量,在DNA2.0软件的辅助下,以P. pastoris密码子使用频率为基准,在不改变氨基酸顺序的前提下,将Leu、Thr、Gly、Val、Ala、Arg、Ser、Pro、Lys、Ile、Gln、Tyr、Asn、Phe、Cys和Asp等在P. pastoris中使用频率低的密码子进行了改造。共计172个位点的低频密码子替换为使用频率最高、次高频和第三高频密码子;优化了CalB基因的G+C含量,优化基因G+C含量为53.99%(优化前为61.89%);在碱基编排过程中去除了富含GC和AT的区域,降低了RNA二级结构的复杂性。 2.基于PAS全基因合成技术合成了CalBSP,CalBP,CalB和CalB His-tag四种不同一级结构形式的基因。 3.本研究以原始基因(CalB)和优化基因(CalBM)为外源基因,以pPIC9K、pPIC9KM和pPICZα为诱导型表达载体,以pGAPZα为组成型表达载体,构建了pPIC9K-CalB、pPIC9KM-CalB、pGAPZα-CalB、pPICZα-CalB、pPIC9K-CalBM、pPIC9KM-CalBM、pGAPZα-CalBM、pPICZα-CalBM、pPIC9K-CalB-His和pPIC9K-CalBM-His 10个重组表达质粒,并分别转至P. pastoris GS115、SMD1168和X-33,实现了各基因在宿主菌中的功能性表达,获得了高效表达的基因工程菌。结果表明,密码子优化明显提高了CalB在P. pastoris中的水解酶活与蛋白表达量,较原始基因提高40%了左右。以pPICZα为表达载体,X-33为宿主菌株筛选到的转化子表达水平最高,最高辛酸乙酯水解活力和最高总蛋白表达量分别为246.3 U/mL和179.1 mg/L。 4.对经Ni-NTA亲和层析和超滤浓缩纯化的CALB进行SDS-PAGE分析,发现在CalB基因在P. pastoris中表达产物的大小为35 kDa(含糖基化侧链)。经Endo H糖苷内切酶酶切的CALB约为33 kDa,与实际CALB大小一致,证实了CALB在P. pastoris的异源表达蛋白加工过程中进行了糖基化修饰。 5.对重组CALB进行了初步的酶学性质分析。结果表明,CALB的最适底物为C8,最适反应温度和pH分别为40℃和pH 8.0;Ca、Mg、K+和吐温80对其水解有激活作用;Cu、TrionX-100与SDS对其水解具有抑制作用。

关键词： CalB 密码子优化全基因合成毕赤酵母异源表达

光子晶体用二氧化硅胶体球的改性制备及其自组装

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功能材料 2008年第12期39卷 1953-1955,1958页

作者：刘立营王秀峰章春香程冰陕西科技大学材料科学与工程学院陕西西安710021

采用一步法制备了表面接枝甲基丙烯酰氧基三甲氧基硅烷(MPS)的单分散SiO2胶体球,并通过垂直沉积法在40℃、60%相对湿度下组装出有序性较好的密排结构的SiO2光子晶体。傅立叶红外光谱(FT-IR)和X射线光电子能谱(XPS)结果证明SiO2胶体球表... 详细信息

采用一步法制备了表面接枝甲基丙烯酰氧基三甲氧基硅烷(MPS)的单分散SiO2胶体球,并通过垂直沉积法在40℃、60%相对湿度下组装出有序性较好的密排结构的SiO2光子晶体。傅立叶红外光谱(FT-IR)和X射线光电子能谱(XPS)结果证明SiO2胶体球表面接枝上了MPS;扫描电子显微镜(SEM)结果表明改性后SiO2胶体球平均粒径为284nm,单分散性较高,平均标准偏差<5%;制备出的光子晶体是面心立方(fcc)紧密堆积结构;吸收光谱表明,所制备的光子晶体在(111)方向具有光子晶体的带隙特性,带隙中心波长为646nm。

关键词：光子晶体二氧化硅胶体球改性一步法

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我国学术期刊数字化建设与发展

中国科技期刊研究 2013年第5期24卷 835-837页

作者：李婧刘立营张秀梅北京电影学院图书馆北京市海淀区西土城路4号100088 北京万方数据股份有限公司北京市海淀区复兴路15号100038 中国科学技术信息研究所北京市海淀区复兴路15号100038

该文通过系统阐述数字出版全流程中各阶段与传统出版的区别与转换、衔接与建设、发展与策略,辅助我国学术期刊实现由传统期刊"内容为王"的模式向期刊数字化"内容为基,服务为王"的新型模式的转化,找到适合自身的期刊数字化发展之路。

关键词：期刊数字化经营模式信息服务数字出版全流程

Tb_2O_3对磁光玻璃稳定性和微观结构的影响

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武汉理工大学学报 2010年第5期32卷 27-30页

作者：章春香殷海荣刘立营唐保军陕西科技大学材料科学与工程学院西安710021

用传统熔融法制备不同Tb2O3掺量铝硼硅酸盐(ABS)磁光玻璃,讨论了Tb2O3对玻璃稳定性和微观结构的影响。DSC和FT-IR结果表明:随着Tb2O3掺量的增加,ABS玻璃稳定性先增大后减小,掺入适量Tb2O3有利于增强玻璃网络结构;若Tb2O3掺量过多,导致... 详细信息

用传统熔融法制备不同Tb2O3掺量铝硼硅酸盐(ABS)磁光玻璃,讨论了Tb2O3对玻璃稳定性和微观结构的影响。DSC和FT-IR结果表明:随着Tb2O3掺量的增加,ABS玻璃稳定性先增大后减小,掺入适量Tb2O3有利于增强玻璃网络结构;若Tb2O3掺量过多,导致玻璃结构破坏,稳定性降低。ABS玻璃由硅氧、硼氧、铝氧多面体构成的混合网络结构组成,Tb3+填充在网络结构空隙中;热处理后,玻璃结构发生变化,原来部分被重叠或覆盖的红外吸收峰显露出来,混合网络结构发生分裂。

关键词：磁光玻璃 ABS玻璃稳定性能微观结构 Tb2O3

Tb_2O_3对磁光玻璃形成区及物理化学性质的影响

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中国稀土学报 2009年第1期27卷 57-62页

作者：殷海荣章春香刘立营唐保军陕西科技大学材料科学与工程学院陕西西安710021

以分析纯的氧化铽、氢氧化铝、氧化硅和硼酸等为主要原料,采用传统熔融冷却工艺制备了硼硅酸盐系稀土Tb2O3磁光玻璃,讨论了Tb2O3对玻璃形成区及物理化学性质的影响。采用示差扫描量热仪(DSC)、自制的Verdet常数测试设备和紫外/可见/近... 详细信息

以分析纯的氧化铽、氢氧化铝、氧化硅和硼酸等为主要原料,采用传统熔融冷却工艺制备了硼硅酸盐系稀土Tb2O3磁光玻璃,讨论了Tb2O3对玻璃形成区及物理化学性质的影响。采用示差扫描量热仪(DSC)、自制的Verdet常数测试设备和紫外/可见/近红外分光光度计(UV/VIS/NIR)对玻璃的特征温度、Verdet常数和吸收光谱进行表征。结果表明:Tb3+离子的掺入量受玻璃形成区域的限制,在Tb2O3含量为30%(摩尔分数)时,玻璃形成能力较强,热稳性好;玻璃密度和Verdet常数均与Tb3+离子浓度近似成线性关系;稀土玻璃吸收峰位置只与稀土离子种类有关,吸收峰强度随Tb2O3含量的增加而增强。

关键词：氧化铽磁光玻璃玻璃形成区物理化学性质稀土

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柔板显示技术研究进展

材料导报 2009年第15期23卷 1-4页

作者：王秀峰刘立营陕西科技大学材料科学与工程学院西安710021

作为下一代显示技术的代表,模拟普通纸张显示效果的柔板显示技术已经成为世界各国研究的焦点。目前,主要包括4种实现柔板显示的技术,分别为电子墨水显示技术(Electronic ink display technology,EID)、柔性电致发光显示技术(Flexible or... 详细信息

作为下一代显示技术的代表,模拟普通纸张显示效果的柔板显示技术已经成为世界各国研究的焦点。目前,主要包括4种实现柔板显示的技术,分别为电子墨水显示技术(Electronic ink display technology,EID)、柔性电致发光显示技术(Flexible organic light emitting devices display technology,FOLED)、电致变色显示技术(Electro-chromic display technology,ECD)和光子墨水显示技术(Photonic ink display technology,PID)。每种技术都有各自的特点,在器件制备方面各自都发展到了不同的程度。主要评述了这4种显示技术的研究进展,并对其未来的发展进行了简要的市场分析。

关键词：柔板显示电子纸电子墨水电致发光电致变色光子墨水

钠离子改性二氧化硅微球的制备及其光子晶体自组装

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科学通报 2009年第12期54卷 1706-1710页

作者：刘立营王秀峰章春香程冰陕西科技大学材料科学与工程学院西安710021

为提高SiO2微球的表面电荷密度,分别利用氯化钠和金属钠引入Na+,通过正硅酸乙酯的水解,合成SiO2微球,并采用垂直沉积法制备出光子晶体.通过Zeta电位粒度仪、带EDS能谱仪的场发射扫描电子显微镜(SEM)和紫外-可见-近红外光谱仪对其电学性... 详细信息

为提高SiO2微球的表面电荷密度,分别利用氯化钠和金属钠引入Na+,通过正硅酸乙酯的水解,合成SiO2微球,并采用垂直沉积法制备出光子晶体.通过Zeta电位粒度仪、带EDS能谱仪的场发射扫描电子显微镜(SEM)和紫外-可见-近红外光谱仪对其电学性能、显微形貌和光学性能进行测试分析.Zeta电位测试结果显示经引入Na+改性后SiO2微球的Zeta电位有明显提高,其中经电解质氯化钠和金属钠改性后分别平均提高11.39和13.52mV;EDS能谱分析表明微球中含有钠元素;SEM照片表明经氯化钠和金属钠改性后样品平均粒径均有所增加,分别为380和354nm,并且标准偏差均小于5%,所得光子晶体为面心立方密排结构;吸收光谱表明经氯化钠和金属钠改性后所得光子晶体分别在856和798nm处具有光子晶体带隙,吸收峰具有明显红移现象,并且更窄更明显.

关键词：光子晶体二氧化硅微球自组装钠离子改性

热处理对0Cr16Ni5Mo不锈钢焊接接头性能的影响

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金属热处理 2015年第11期40卷 120-125页

作者：李太江李勇李巍刘刚米紫昊刘立营王乐李聚涛西安热工研究院有限公司陕西西安710032

为提高水轮机过流部件焊接修复区域抗磨蚀性能,对0Cr13Ni5Mo马氏体不锈钢材质的转轮采用0Cr16Ni5MoRe不锈钢焊材进行焊接修复,研究热处理工艺对焊接接头性能影响。研究结果表明,通过延长焊后热处理时间至10 h,可有效改善母材、焊缝、热... 详细信息

为提高水轮机过流部件焊接修复区域抗磨蚀性能,对0Cr13Ni5Mo马氏体不锈钢材质的转轮采用0Cr16Ni5MoRe不锈钢焊材进行焊接修复,研究热处理工艺对焊接接头性能影响。研究结果表明,通过延长焊后热处理时间至10 h,可有效改善母材、焊缝、热影响区的冲击性能,同时其弯曲性能也得到明显改善。采用0Cr16Ni5MoRe不锈钢焊条焊接0Cr13Ni5Mo不锈钢后,经焊后缓冷并610℃保温10 h空冷后焊接接头各项指标符合标准规定。

关键词：水轮机马氏体不锈钢焊接热处理

S31042钢使用82型焊材焊接接头的显微组织和力学性能

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焊接学报 2017年第12期38卷 119-124页

作者：刘福广李太江刘立营曹凯米紫昊包春斌孙忠义西安热工研究院有限公司西安710054 华能国际电力股份有限公司营口电厂营口115007

通过力学性能试验、光学金相显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜研究了S31042钢使用82型焊材焊接接头高温时效后的显微组织和力学性能.结果表明,650℃时效3 000 h后,接头的室温抗拉强度和硬度略有升高,但上升幅度低于同材质焊材接... 详细信息

通过力学性能试验、光学金相显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜研究了S31042钢使用82型焊材焊接接头高温时效后的显微组织和力学性能.结果表明,650℃时效3 000 h后,接头的室温抗拉强度和硬度略有升高,但上升幅度低于同材质焊材接头;82型焊材焊接接头的高温持久强度低于同材质焊材接头,只能达到同材质焊接接头的88%.高温时效会使82型焊材焊缝的缺口冲击吸收功下降,但始终保持在70 J以上;82型焊材焊缝强度不足是导致该接头室温强度、持久强度低于同材质焊材焊接接头的主要原因;82型焊材焊缝强度主要源于合金元素的固溶强化,晶界处球状M23C6相的连续网状及亚晶界处针状δ相的簇状分布,对强度提高作用较小,但会降低焊缝的冲击韧性.

关键词：超超临界机组奥氏体耐热钢 S31042钢 82型焊材