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基于LAMP的好氧反硝化细菌筛选及其反硝化性能的研究

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基于LAMP的好氧反硝化细菌筛选及其反硝化性能的研究

作者：刘启臣青岛理工大学

学位级别：硕士

好氧反硝化过程是反硝化菌在有氧的条件下,将硝态氮或亚硝态氮依次还原为氮气的过程。好氧反硝化细菌在不同氮形式还原过程中依次利用4种金属还原酶催化完成,包含硝酸盐在周质硝酸盐还原酶Nap或膜质硝酸盐还原酶Nar的作用下还原为亚硝酸... 详细信息

好氧反硝化过程是反硝化菌在有氧的条件下,将硝态氮或亚硝态氮依次还原为氮气的过程。好氧反硝化细菌在不同氮形式还原过程中依次利用4种金属还原酶催化完成,包含硝酸盐在周质硝酸盐还原酶Nap或膜质硝酸盐还原酶Nar的作用下还原为亚硝酸盐,亚硝酸盐在亚硝酸盐还原酶Nir的作用下还原为NO,NO在亚硝酸盐氧化还原酶Nor的作用下还原为N2O,N2O在氧化亚氮还原酶Nos的作用下还原为N2。亚硝酸盐还原酶控制的反硝化过程是脱氮的关键性限速步骤、氧化亚氮还原酶是反硝化过程还原为氮气的最后一步,所以通过LAMP体系检测nir S、nir K和nosZ基因可以从分子生物学角度深入研究好氧反硝化菌群特性和反硝化过程氮素的转化规律,进而可以优化好氧反硝化菌的反硝化能力,为污废水环境治理提供便捷的菌株筛选方法和菌种资源,为生物脱氮科研与生产生活提供数据支撑。环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种新型的体外扩增DNA技术,即用2对(或3对)特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下(60～65℃),60 min就能完成核酸扩增的一种生化检测方法,较之其他常规基因检测技术,LAMP反应体系快速、简易、高特异性及不依赖于昂贵检测设备等优点。为了快捷、精确的筛选海水好氧反硝化菌株,本论文应用LAMP专用软件设计了nir S基因、nir K基因和nosZ基因的LAMP引物,利用特异性的LAMP反应体系,对候选好氧反硝化菌株进行初筛,再用PCR法、产气检测法进行复筛,并对筛选出的反硝化菌株进行了反硝化性能测试和反硝化能力环境因子优化。主要研究结果如下:(1)通过好氧反硝化条件下富集,从南美白对虾种虾培育系统的生物滤池中分离出13株候选菌株,分别编号为KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KFDX5、KFDX6、KFDX7、KWDX1、KWDX2、KWDX3、FJ3-1、FJ3-2和FJ6-1。(2)根据亚硝酸盐还原酶编码基因nir S基因和nir K基因,氧化亚氮还原酶编码基因nosZ基因序列设计LAMP引物,LAMP体系在60℃下反应60 min,通过Gene FinderTM核酸染料直接染色法和琼脂糖凝胶电泳法两种方法对扩增产物进行特异性检测。初步筛选出KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KWDX1、FJ3-1、FJ3-2等7株携带三种基因的反硝化菌株。为了避免通过LAMP筛选的菌株有假阳性,经PCR进一步验证,结果与LAMP筛选的结果一致。通过数字式压差仪进行产气检测三次筛选,筛选出确有气体产生的菌株。综合三步的结果,确认从南美白对虾种虾海水养殖系统中筛选到KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1、F3-2 5株产N2好氧反硝化菌株,这些菌株经16S r RNA基因测序,鉴定KFDX1为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、KFDX2为海角副球菌(Paracoccus homiensis)、KFDX3为产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)、KWDX1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、FJ3-2为脂解交替假单胞菌(Psudoaltermonus lipolytica)。(3)测定菌株在不同氮源条件下生长和脱氮特性结果表明,筛选出来的含nosZ基因且产气的菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2对亚硝酸氮、硝酸氮、氨氮和总氮的去除效果良好,去除率分别达到99%、90%、97%和90%以上,最大去除速率分别可高达4.9 mg/(L·h)、4.03 mg/(L·h)、4.15 mg/(L·h)和6.03 mg/(L·h)。去除速率明显高于不含该基因的菌株KFDX4、FJ3-1。以氮源为唯一变量时,5株菌株对亚硝酸氮的去除效果优于氨氮,优于硝酸氮。(4)环境条件对5株菌株生长和脱氮的影响实验结果显示,不同菌株生长和脱氮对环境的要求各异,对环境因素的耐受力也不同。5株菌株在温度为22℃～40℃,p H值在6.0～9.0,盐度为20～50,C/N为4～24,以柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖、乙醇、醋酸钠为唯一碳源的条件范围内均能保持良好生长并能维持较高的脱氮特性。(1)菌株KFDX1最佳生长条件为温度34℃、p H 7.0、盐度30g·L-1、C/N为20、碳源为乙醇;最佳脱氮条件为温度22℃、p H 7.0、盐度30 g·L-1、C/N为20、碳源为蔗糖或柠檬酸钠。24h亚硝酸盐去除率可达94%,硝酸盐去除率可达95%。(2)菌株KFDX2最佳生长条件为温度28℃、p H 7.5、盐度50 g·L-1、C/N为20、碳源为乙醇;最佳脱氮条件为温度40℃、p H 8.5和6.0、盐度50 g·L-1、C/N为20、碳源为葡萄糖。24h亚硝酸盐去除率为91%,硝酸盐

关键词：好氧反硝化菌环介导等温扩增 nosZ基因快速筛选生物脱氮

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葡萄球菌感染及耐药性分析

基层医学论坛 2008年第5期12卷 160-162页

作者：刘启臣朱兆生夏津县人民医院山东夏津253200

葡萄球菌广泛分布于自然界,也常见于人和动物的皮肤及与外界相通的腔道中。金黄色葡萄球菌是人类重要的致病菌,可引起社区和医院的化脓性感染。凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）是人体皮肤和黏膜正常菌群之一,20世纪80年代后随着介入性诊疗措... 详细信息

葡萄球菌广泛分布于自然界,也常见于人和动物的皮肤及与外界相通的腔道中。金黄色葡萄球菌是人类重要的致病菌,可引起社区和医院的化脓性感染。凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）是人体皮肤和黏膜正常菌群之一,20世纪80年代后随着介入性诊疗措施、糖皮质激素、免疫抑制剂等的广泛使用及患者伴有肿瘤、糖尿病等复杂的基础性疾病，使其成为重要的机会致病菌并出现多重耐药菌株。葡萄球菌的耐药问题已演变为医院感染和临床治疗的棘手问题。

关键词：葡萄球菌感染耐药性分析凝固酶阴性葡萄球菌金黄色葡萄球菌机会致病菌多重耐药菌株人体皮肤医院感染

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生物技术通报 2019年第9期35卷 210-217页

作者：李秋芬刘启臣徐爱玲张艳宋志文青岛理工大学环境与市政工程学院青岛266033 中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071

为了快捷、精确的筛选海水好氧反硝化菌株,应用专用软件设计了 nirS 基因、nirK 基因和 nosZ 基因的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,利用特异性的 LAMP 反应体系,对候选好氧反硝化菌株进行初筛,再用 ... 详细信息

为了快捷、精确的筛选海水好氧反硝化菌株,应用专用软件设计了 nirS 基因、nirK 基因和 nosZ 基因的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,利用特异性的 LAMP 反应体系,对候选好氧反硝化菌株进行初筛,再用 PCR 法、产气检测法进行复筛,并对筛选出的反硝化菌株进行了反硝化性能测试。结果显示,通过 LAMP 体系在 60℃下反应60 min、GeneFinderTM 核酸染料直接染色法对扩增产物进行观察,从好氧培养条件下分离的候选菌株中筛选出 KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KWDX1、FJ3-1 和 FJ3-2 等 7 株同时含 nirS 基因或 nirK 基因和 nosZ 基因的好氧反硝化菌株初选菌株;PCR 的筛选结果与 LAMP 体系筛选结果一致,经产气检测,其中有 6 株产气,最终筛选出 KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1、FJ3-2 5 株可产 N2 的好氧反硝化菌。反硝化性能测试结果表明,24 h 后,这 5 株菌对 NO2-N 和 NO3-N 的去除率分别达到 99%和 90%以上,最大去除速率分别可高达 4.9 mg/(L·h)和 4.03 mg/(L·h)。这对改进反硝化菌株的筛选方法和推动其在废水处理中的应用具有重要意义。

关键词：好氧反硝化菌环介导等温扩增 nosZ 基因快速筛选

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加强站内感染控制保证采浆安全

基层医学论坛 2006年第2期10卷 189-190页

作者：刘景梅朱兆生刘启臣夏津县单采血浆站山东夏津253200 夏津县人民医院山东夏津253200

随着现代医学科学技术的不断发展,血浆站感染管理工作越来越受到重视.血浆站的感染控制工作的好坏直接影响到血浆的质量,控制站内感染是血浆站质量管理体制的重要组成部分,只有感染控制好了,才能保证供浆者、采浆者及工作人员的安全.才... 详细信息

随着现代医学科学技术的不断发展,血浆站感染管理工作越来越受到重视.血浆站的感染控制工作的好坏直接影响到血浆的质量,控制站内感染是血浆站质量管理体制的重要组成部分,只有感染控制好了,才能保证供浆者、采浆者及工作人员的安全.才能保证环境不被污染.

关键词：感染控制工作安全医学科学技术感染管理工作管理体制工作人员血浆内感染供浆者质量

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加强检验科血液检测中安全防护的重要意义

基层医学论坛 2006年第2期10卷 34-35页

作者：刘景梅刘启臣朱兆生夏津县单采血浆站夏津县人民医院

在临床实验室工作中,由于检验工作者长期接触具有生物危险性的物品,所以实验室的安全防范问题就显得尤为重要,为了自己及患者的健康,减少医源性感染,'安全第一'是必须遵守的原则.血液是病原体的传播载体,特别是乙肝病毒(HBV)和艾滋病病... 详细信息

在临床实验室工作中,由于检验工作者长期接触具有生物危险性的物品,所以实验室的安全防范问题就显得尤为重要,为了自己及患者的健康,减少医源性感染,'安全第一'是必须遵守的原则.血液是病原体的传播载体,特别是乙肝病毒(HBV)和艾滋病病毒(HIV).我国是乙肝大国,人群中有10%左右乙肝患者和HBV携带者.近年来,艾滋病的发病率和HIV携带者逐年增加,这给天天与血液打交道的检验人员造成了极大的威胁.然而实验室的工作人员自我防范意识淡薄,实验室相应的保护措施、管理制度的缺乏,这就要求必须加强防范意识这方面的教育.

关键词：血液检测血液检查 HIV 乳胶手套戴手套 HBV 采血人员真空采血系统消毒液检验人员接触传染接触传播实验室标本处理

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加强检验科血液检测中安全防护的重要意义

基层医学论坛（B版） 2006年第1期10卷 34-35页

作者：刘景梅刘启臣朱兆生夏津县单采血浆站山东夏津253200 夏津县人民医院山东夏津253200

在临床实验室工作中,由于检验工作者长期接触具有生物危险性的物品,所以实验室的安全防范问题就显得尤为重要,为了自己及患者的健康,减少医源性感染,“安全第一”是必须遵守的原则。血液是病原体的传播载体,特别是乙肝病毒(HBV)和艾滋... 详细信息

在临床实验室工作中,由于检验工作者长期接触具有生物危险性的物品,所以实验室的安全防范问题就显得尤为重要,为了自己及患者的健康,减少医源性感染,“安全第一”是必须遵守的原则。血液是病原体的传播载体,特别是乙肝病毒(HBV)和艾滋病病毒(HIV)。我国是乙肝大国,人群中有10%左右乙肝患者和HBV携带者。近年来,艾滋病的发病率和HIV携带者逐年增加,这给天天与血液打交道的检验人员造成了极大的威胁。然而实验室的工作人员自我防范意识淡薄,实验室相应的保护措施、管理制度的缺乏,这就要求必须加强防范意识这方面的教育。[第一段]

关键词：血液检测安全防护检验科临床实验室工作乙肝病毒(HBV) 艾滋病病毒 HBV携带者 HIV携带者自我防范意识乙肝患者