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重组人fgl2微小RNA腺病毒表达载体的构建及其体外干预效应和体内分布的初探

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重组人fgl2微小RNA腺病毒表达载体的构建及其体外干预效应和体内...

作者：刘君慧华中科技大学

学位级别：硕士

【目的】前期研究表明，人纤维介素(human fibrinogen like protein2prothrombinase,fgl2)是肿瘤生长和转移等的关键因素，本研究针对这一基因，构建重组hfgl2的微小RNA(miRNA)腺病毒(Adenovirus，Ad)表达质粒(pAd-hfgl2-miRNA)，并进行包装、扩增为重组hfgl2-miRNA腺病毒(Ad-hfgl2-miRNA)。研究重组Ad-hfgl2-miRNA在细胞水平对hfgl2基因表达的抑制作用，及其在裸小鼠皮下移植瘤肝癌模型中体内hfgl2表达的分布情况。【方法】 1.利用miRNA设计软件，针对hfgl2基因分别设计3对pre-miRNA序列，构建表达质粒， pcDNA6.2-hfgl2-miRNA1、2、3和非相关干扰质粒，然后将其分别与pcDNA3.1-hfgl2共转染至人胚肾细胞(293T细胞)，通过Real-time PCR和western-blot检测在细胞水平的干预效应。 2.参照Invitrogen公司的腺病毒表达系统试剂盒说明书，使用GATEWAY技术将pcDNA6.2-hfgl2-miRNA1表达质粒重组成pAd-hfgl2-miRNA腺病毒表达质粒。然后进行病毒包装、扩增，制备重组hfg12-miRNA腺病毒颗粒。 3.使用病毒DNA小提试剂盒，PCR扩增片段，鉴定目的基因。 4.使用TCID50法测定重组Ad-hfgl2-miRNA的滴度。 5.确定腺病毒感染HCCLM6细胞的最适感染复数MOI，并共培养，使用Realtime PCR和Western-Blot检测其抑制作用，使用PKH26法以流式细胞技术检测hfgl2干扰后的HCCLM6细胞增殖能力的改变;使用CCK-8法测定半数抑制浓度。 6.瘤内注射1×109IU带有绿色荧光蛋白的重组Ad-hfgl2-miRNA，使用活体荧光成像仪连续拍照，直至荧光消失。 7.使用Realtime PCR检测瘤内注射1×10IU重组Ad-hfgl2-miRNA后第1、3、7、9、11、15、19、24天，裸小鼠人肝癌模型的心、肝、脾、肺、肾、小肠及荷瘤的hfgl2-miRNA表达情况。 8.采集瘤内注射1×10IU重组Ad-irrelevant-miRNA后第1、3、7、11、24天裸小鼠人肝癌模型的眼球血，采集有荷瘤但未进行任何干预的裸小鼠的眼球血及无荷瘤的正常裸小鼠的眼球血，一并行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH-L)、尿素氮(BUN)、血肌酐(CR)检测。重组Ad-irrelevant-miRNA干预裸小鼠的心、肝组织用4％的甲醛固定，行H.E.染色，观察组织病理学改变。【结果】 1.成功构建重组人fg12微小RNA腺病毒表达载体，合成、扩增重组人fg12微小RNA腺病毒。 2.在细胞水平水平，重组Ad-hfgl2-miRNA对hfgl2表达具有明显抑制作用，IC50=600MOI。 3.活体荧光成像仪可观察到注射后第1天即有荧光表达，以第3、4天表达最强，第7、8天消失。 4. QRT-realtime PCR可在裸小鼠心、肝、脾、肺、肾、小肠及给药部位荷瘤检测到hfgl2-miRNA，并维持停药后第24天。心、脾、肺、肾、荷瘤组织中的mRNA表达水平，以给药后第7天为表达高峰，组间无明显差异，P＞0.05。在肝脏中的mRNA水平，第3天为表达高峰，较空白对照组、其他时间点明显增高，具有显著性差异P＜0.05。在小肠中的mRNA水平，第7天为表达高峰，较空白对照组、其他时间点明显增高，具有显著性差异P＜0.01。第11天表达水平较空白对照组明显增高，两者比较具有统计学意义P＜0.05，其他时间点与空白对照组无明显差异。 5.血生化检测：Ad-irrelevant-miRNA注射后，第1、3、7、11、24天，ALT、AST、CK、LDH-L可观察到增高趋势，但无统计学异常，P＞0.05。BUN、CR基本正常。非相关对照组、空白有荷瘤对照组与空白无荷瘤对照组之间无显著性差异，P＞0.05。心、肝组织HE染色，显微镜下未见实质细胞明显损伤性改变(如：细胞大量坏死，明显出血和炎症细胞浸润等)。【结论】 1.重组人fg12微小RNA腺病毒表达载体的成功构建，为研究miRNA对基因治疗提供应用基础。 2.重组人fgl2微小RNA腺病毒注射液在体外可有效抑制hfgl2的表达及增殖作用，为肝癌模型体内实验提供实验基础。 3. hfgl2在模型中广泛分布，重组人fgl2微小RNA腺病毒注射液在体内无明显毒性作用，为针对hfgl2这一关键靶基因的肝癌治疗的安全性研究提供了基础。

关键词：基因治疗人纤维介素(hfgl2) RNA干扰肝癌

新时期中国共产党践行群众路线的制度建设研究

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新时期中国共产党践行群众路线的制度建设研究

作者：刘君慧贵州师范大学

学位级别：硕士

党的十八大报告提出:“精神懈怠危险、能力不足危险、脱离群众危险、消极腐败危险更加尖锐地摆在全党面前。”党要摆脱“四个风险”,以更好的姿态迎接“执政考验、改革开放考验、市场经济考验、外部环境考验”四个考验,就必须坚定群众观... 详细信息

党的十八大报告提出:“精神懈怠危险、能力不足危险、脱离群众危险、消极腐败危险更加尖锐地摆在全党面前。”党要摆脱“四个风险”,以更好的姿态迎接“执政考验、改革开放考验、市场经济考验、外部环境考验”四个考验,就必须坚定群众观点,坚持走群众路线。中国共产党践行群众路线的制度建设有着丰富的理论基础。这些理论基础包括马克思、恩格斯、列宁关于无产阶级政党维护群众利益的制度建设的理论、中国共产党关于群众路线制度制度建设的理论以及中国传统文化当中的制度文化思想。这些理论为新时期中国共产党践行群众路线制度建设提供了指导。新时期,中国共产党践行群众路线制度,面临着更为复杂多变的情况。首先,外部环境的变化即世情、国情的变化;其次,党践行群众路线制度建设的对象的变化,包括人民群众主体的多元化、改利益多样化和诉求方式的多样化;最后,党践行群众路线制度建设主体的变化,包括党员队伍结构的变化、党员群众立场的变化以及素质能力的不适应。因此,只有使群众路线常态化、规范化,加强中国共产党践行群众路线制度的建设,才能真正做到保持同群众的血肉联系,才能真正巩固党的执政地位和领导地位。改革开放至今,我们党在践行群众路线的制度建设的进程中,也积累了不少的经验,如,制定了群众路线赖以遵循的相关制度、制定了详细细则、注重加强党员的思想政治教育。同时,也收获了一些教训,如制度体系不完善、制度意识不强、制度不规范。由此,我们进一步探索新时期如何完善群众路线制度建设,初步得到如下结论:首先,应该完善从群众中来的社情民意反映制度,其次应该完善到群众中去的民主决策制度,最后应该完善相信群众、依靠群众的监督制度。

关键词：新时期中国共产党践行群众路线制度建设

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树木引种技术第1版

树木引种技术

1982年

作者：李国庆刘君慧

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作者：李国庆刘君慧

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毛白杨良种选优技术的研究

河南农林科技 1979年第12期 25-31页

作者：刘君慧河南农学院园林系

毛白杨是我国特有的杨树树种,栽培历史悠久,它具有生长快、材质好、分布广、寿命长、成大材等优点,是我省发展的主要树种。一、毛白杨的变异是选优的基础生物的种和变种,都是由以前别的种演变而来的。变异的根本原因,是生物内在变异的... 详细信息

毛白杨是我国特有的杨树树种,栽培历史悠久,它具有生长快、材质好、分布广、寿命长、成大材等优点,是我省发展的主要树种。一、毛白杨的变异是选优的基础生物的种和变种,都是由以前别的种演变而来的。变异的根本原因,是生物内在变异的倾向和外界生活条件的影响,内因是变化的根据,外因是变化的条件,内因和外因互相作用使生物不断发生变异,因此,变异是生物界的普遍规律。大量事实证明,生物的变异也能积累和加强,从而形成新的类

关键词：毛白杨指数法标准差平均数平均指标超级苗分枝特性选优良种优良品种

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《共产党宣言》与中国共产党的基本纲领建设

青年与社会（中） 2014年第12期 13-14页

作者：刘君慧贵州师范大学贵州贵阳550000

《共产党宣言》是马克思主义经典著作中影响最大、传播最广的作品，马克思、恩格斯在《共产党宣言》中阐述了共产党人正确处理最低纲领与最高纲领关系的相关原则，中国共产党两个纲领建设的理论渊源可以追溯到《共产党宣言》。多年来，... 详细信息

《共产党宣言》是马克思主义经典著作中影响最大、传播最广的作品，马克思、恩格斯在《共产党宣言》中阐述了共产党人正确处理最低纲领与最高纲领关系的相关原则，中国共产党两个纲领建设的理论渊源可以追溯到《共产党宣言》。多年来，中国共产党为了破解这一课题，进行了艰辛曲折的探索。随着时代的发展，其内涵不断完善，并在建设有中国特色社会主义的伟大实践之中起着积极的指导意义。

关键词：共产党宣言基本纲领建设指导意义

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以货物进行公益性捐赠的涉税处理与相关建议

注册税务师 2022年第7期 53-56页

作者：刘君慧广西中税网税务师事务所

2020年我国脱贫攻坚取得了全面胜利,至此,小康社会的实现,标示着共同富裕提上日程。共同富裕的主要方式是先富起来的一部分人自愿进行公益性捐赠。近两年来,疫情以及国际经济形势的影响,很多企业都出现了现金流紧张的现象,以货物进行公... 详细信息

2020年我国脱贫攻坚取得了全面胜利,至此,小康社会的实现,标示着共同富裕提上日程。共同富裕的主要方式是先富起来的一部分人自愿进行公益性捐赠。近两年来,疫情以及国际经济形势的影响,很多企业都出现了现金流紧张的现象,以货物进行公益性捐赠成为更具可操作性的方案。

关键词：公益性捐赠脱贫攻坚现金流涉税处理小康社会国际经济形势共同富裕先富起来

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信息技术在档案收集及管理工作中的应用

中外企业家 2019年第4期 110-110页

作者：刘君慧福建省社会体育指导中心

伴随我国信息技术水平的逐步提升,多元化的新型信息技术获得了普遍地运用,于各个行业及领域都呈现出信息化、规范化的发展势态。在档案管理中要全面地掌握当前先进的信息技术及其优势特色,日渐培养有关档案管理的新思维以寻求新型的管... 详细信息

伴随我国信息技术水平的逐步提升,多元化的新型信息技术获得了普遍地运用,于各个行业及领域都呈现出信息化、规范化的发展势态。在档案管理中要全面地掌握当前先进的信息技术及其优势特色,日渐培养有关档案管理的新思维以寻求新型的管理模式,从而使得信息技术在档案管理中越来越占据核心地位。现如今,如何高效增强档案管理能力以让其可以高度地契合信息化社会的发展需求,已经上升为了众多档案管理工作者思考的课题。对此,该文将首先阐释档案管理工作信息化的应用表现,再根据实际情况中出现的问题提出几点针对性地解决路径。

关键词：信息技术水平档案收集管理应用解决路径

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核桃枝型特征及选优的初步研究

河南农林科技 1979年第4期 22-24页

作者：刘君慧河南农学院

核桃是我国主要油料树种之一。我省从1962年开始引种新疆核桃,现已广泛种植。不仅增加了我省核桃资源,同时也提供了核桃选优的物质基础。我省从新疆维吾尔自治区塔里木盆地周围有关县,引进的核桃品种有丰产、库车丰产薄壳、库车隔年、... 详细信息

核桃是我国主要油料树种之一。我省从1962年开始引种新疆核桃,现已广泛种植。不仅增加了我省核桃资源,同时也提供了核桃选优的物质基础。我省从新疆维吾尔自治区塔里木盆地周围有关县,引进的核桃品种有丰产、库车丰产薄壳、库车隔年、叶城薄壳、库车薄壳16号、木马、大果等40多个。这些核桃品种在

关键词：枝型平均树体腋花芽单株产量侧花芽核桃品种选优