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改良骨髓间充质干细胞体外培养的方法

改良骨髓间充质干细胞体外培养的方法

作者：刁玉佩郑州大学

学位级别：硕士

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）也称骨髓基质来源干细胞,是存在于骨髓中除造血干细胞以外另一类具有多向分化潜能的干细胞。在一定诱导条件下,这类细胞可定向分化为多种造血以外的组织,特别是中胚层和神经外... 详细信息

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）也称骨髓基质来源干细胞,是存在于骨髓中除造血干细胞以外另一类具有多向分化潜能的干细胞。在一定诱导条件下,这类细胞可定向分化为多种造血以外的组织,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞,例如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞、神经细胞等。另外间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）体外获取容易,创伤微小,具有无限增殖和多向分化的潜能,再加上BMSCs具有贴壁生长的特性,在体外易分离和扩增,还易于外源基因的转入和表达,所以BMSCs受到医学界的青睐,它成为一种理想的细胞治疗工具和基因治疗的靶细胞。开创了再生医学和组织工程的先河。然而间充质干细胞在骨髓中的含量很低,需要进行体外分离纯化和大量增殖。这是目前面临的主要问题。目的通过观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞的生长增殖状态的影响得到一种更适合BMSCs体外生长的环境,以利于改良骨髓间充质干细胞体外培养的方法,提高体外培养的获得率,以便于其体外扩增和纯化,更好的应用于临床治疗。方法自6-8W龄SD雄性大鼠股骨、胫骨和腓骨中分离提取骨髓间充质干细胞。采用全骨髓贴壁法培养。分别给于以下三种血清微环境进行培养：同种异体血清组：分离提取细胞后原代用含10%大鼠同种异体血清的培养基培养,以后换液传代时用含10%胎牛血清的培养基培养;胎牛血清组：分离提取细胞后原代用含10%胎牛血清的培养基培养,以后换液传代时仍用含10%胎牛血清的培养基培养;无血清组：分离提取细胞后原代用不含胎牛血清的DMEM培养基培养,以后换液传代时用含10%胎牛血清的培养基培养。在倒置显微镜下观察不同血清微环境下骨髓间充质干细胞的生长形态、细胞生长曲线,流式细胞仪检测不同血清微环境培养条件下的细胞表面分子CD45和CD90的表达。应用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析。结果大鼠同种异体血清微环境下培养细胞形态较小,呈纺锤状,网状生长。10%胎牛血清微环境下培养细胞呈梭形成纤维样,集落式生长。无血清微环境下培养细胞稀少,只有稍许集落式生长。生长曲线中大鼠同种异体血清组倍增速度最快,其次为10%胎牛血清组,而无血清组未见明显倍增速率。流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第三代细胞的CD90阳性表达率均在80%以上,CD45阳性表达率在2%以下。而在无血清培养条件下CD90阳性表达率在74.09%,CD45阳性表达率却在6.09%。这说明无血清微环境下培养的细胞纯度明显低于含血清微环境下培养的细胞。结论在含体积分数为10%的大鼠同种异体血清微环境培养条件下所培养的细胞形态均一性好,融合度均高于其他组,且细胞首次传代的时间明显短于其他血清微环境。,且含体积分数为10%的大鼠同种异体血清和10%胎牛血清均适合骨髓间充质干细胞的生长,但在同种异体血清微环境下细胞增殖更快,而在无血清培养条件下未见明显增殖现象。根据以上结果表明同种异体血清微环境下更适于骨髓间充质干细胞的生长和纯化,更有利于体外培养方法的改良。

关键词：微环境细胞培养骨髓间充质干细胞同种异体血清大鼠纯化

鼓室内灌注地塞米松联合药物治疗突发性聋90例疗效分析

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2012年第7期26卷 306-308页

作者：刁玉佩董明敏郑州大学第一附属医院耳科郑州450052

目的:评价突发性聋(SHL)的治疗方法及疗效。方法:90例SHL患者随机分成基本药物组和联合治疗组2组,基本药物组33例(45耳)采用神经节苷酯、长春西汀等营养神经及血管扩张药治疗,联合治疗组57例(68耳)采用鼓室内灌注地塞米松治疗加基本药... 详细信息

目的:评价突发性聋(SHL)的治疗方法及疗效。方法:90例SHL患者随机分成基本药物组和联合治疗组2组,基本药物组33例(45耳)采用神经节苷酯、长春西汀等营养神经及血管扩张药治疗,联合治疗组57例(68耳)采用鼓室内灌注地塞米松治疗加基本药物组药物治疗。结果:联合治疗组治疗总有效率(73.53%)远高于基本药物组(37.78%),疗效显著,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:采用鼓室内灌注地塞米松治疗加神经节苷酯、长春西汀等药物综合治疗SHL,疗效显著。

关键词：听觉丧失,突发性地塞米松鼓室灌注

鼓室内灌注地塞米松联合药物治疗突发性聋90例疗效分析

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听力学及言语疾病杂志 2012年第4期20卷 373-374页

作者：刁玉佩董明敏郑州大学第一附属医院耳科郑州450052

目的观察鼓室内灌注地塞米松联合药物治疗突发性聋的疗效。方法 90例(113耳)突发性聋患者随机分成2组,I组33例(45耳)采用神经节苷酯、长春西汀等静脉滴注及泼尼松龙口服等治疗,Ⅱ组57例(68耳)在I组用药的基础上,加用鼓室灌注地塞米松治... 详细信息

目的观察鼓室内灌注地塞米松联合药物治疗突发性聋的疗效。方法 90例(113耳)突发性聋患者随机分成2组,I组33例(45耳)采用神经节苷酯、长春西汀等静脉滴注及泼尼松龙口服等治疗,Ⅱ组57例(68耳)在I组用药的基础上,加用鼓室灌注地塞米松治疗,比较两组疗效。结果Ⅱ组总有效率(73.53%)高于I组(37.78%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论鼓室灌注地塞米松加神经节苷酯、长春西汀等综合治疗突发性聋疗效显著。

关键词：突发性聋鼓室灌注

Notch2对鼻咽癌细胞侵袭和转移特性的影响

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中华实验外科杂志 2022年第9期39卷 1737-1740页

作者：李萍刁玉佩郭明坤新乡市中心医院新乡医学院第四临床学院 453000

目的探讨Notch2对鼻咽癌细胞侵袭和转移特性的影响及其机制。方法选取2017年1月到2021年1月新乡市中心医院收治的45例鼻咽癌及其癌旁组织作为研究对象,采用免疫组织化学分析Notch2表达阳性率。采用脂质体Lipofectamine^(TM) 2000转染si... 详细信息

目的探讨Notch2对鼻咽癌细胞侵袭和转移特性的影响及其机制。方法选取2017年1月到2021年1月新乡市中心医院收治的45例鼻咽癌及其癌旁组织作为研究对象,采用免疫组织化学分析Notch2表达阳性率。采用脂质体Lipofectamine^(TM) 2000转染siRNA到人鼻咽癌细胞(CNE-1)沉默Notch2表达,建立对照组和Notch2 KD组细胞株,分别采用细胞计数试剂盒(CCK-8)测定两组细胞增殖;采用Transwell分析两组细胞侵袭,划痕实验分析细胞迁移;蛋白质免疫印迹(Western blot)分析细胞上皮间质转化和侵袭转移相关蛋白的表达水平。组间数据比较采用t检验。结果鼻咽癌组织Notch2蛋白表达评分[(9.04±1.59)分]明显高于癌旁组织[(3.98±1.01)分],差异有统计学意义(t=3.768,P<0.05)。对照组细胞48 h吸光度(A)值(1.85±0.08)明显高于Notch2 KD组细胞(1.42±0.12),差异有统计学意义(t=7.538,P<0.05)。对照组细胞侵袭数量[(120.00±13.71)个]明显高于Notch2 KD组细胞[(60.33±5.16)个],差异有统计学意义(t=6.966,P<0.05)。对照组细胞划痕愈合百分比[(81.33±5.01)%]明显高于Notch2 KD组细胞[(59.33±6.22)%],差异有统计学意义(t=7.538,P<0.05)。对照组细胞上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达水平(0.83±0.08)明显低于Notch2 KD组细胞(1.30±0.09),差异有统计学意义(t=10.040,P<0.05)。对照组细胞间质标志物波形蛋白(Vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达水平(1.51±0.11、1.22±0.13)明显高于Notch2 KD组细胞(0.88±0.07、0.71±0.12),差异有统计学意义(t=12.130、6.898,P<0.05)。癌旁组织基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表达水平(0.80±0.11、1.08±0.09)明显低于鼻咽癌组织(1.86±0.15、1.99±0.08),差异有统计学意义(t=16.780、21.400,P<0.05)。对照组细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平(1.06±0.08、1.39±0.09)明显低于Notch2 KD组细胞(0.59±0.06、0.64±0.12),差异有统计学意义(t=10.040、10.040,P<0.05)。结论Notch2蛋白在鼻咽癌组织中呈高表达,通过激活Notch信号通路促进鼻咽癌细胞侵袭和转移能力。

关键词： Notch2 鼻咽癌侵袭转移

核小体装配蛋白1样1对鼻咽癌细胞增殖特性的影响及其机制

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中华实验外科杂志 2022年第8期39卷 1557-1560页

作者：刁玉佩李萍郭明坤新乡市中心医院新乡医学院第四临床学院453000

目的探讨核小体装配蛋白1样1(NAP1L1)对鼻咽癌细胞增殖能力的影响及其机制。方法选取2017年1月到2021年1月新乡市中心医院收集的60例鼻咽癌组织和癌旁组织作为研究对象, 采用免疫组织化学分析癌旁组织和鼻咽癌组织NAP1L1蛋白表达水平。... 详细信息

目的探讨核小体装配蛋白1样1(NAP1L1)对鼻咽癌细胞增殖能力的影响及其机制。方法选取2017年1月到2021年1月新乡市中心医院收集的60例鼻咽癌组织和癌旁组织作为研究对象, 采用免疫组织化学分析癌旁组织和鼻咽癌组织NAP1L1蛋白表达水平。采用NAP1L1短发卡RNA(shRNA)慢病毒感染低分化鼻咽癌细胞SUNE-1, 建立对照组和NAP1L1 KD组细胞系, 采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、克隆形成实验和体外移植瘤实验分析NAP1L1对鼻咽癌细胞增殖的影响。采用流式细胞术分析两组细胞周期水平;采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分析肿瘤组织和癌旁组织中周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)和细胞周期素D1(CCND1) mRNA和蛋白表达水平。组间计量数据比较采用t检验。结果 NAP1L1蛋白主要表达于细胞核中。定量结果显示, 癌旁组织NAP1L1蛋白表达强度(31.64±7.01)明显低于鼻咽癌组织NAP1L1蛋白表达强度(91.80±15.18), 差异有统计学意义(t=27.87, P<0.05)。对照组细胞48 h和72 h吸光度(A)值(1.08±0.08、1.89±0.11)明显高于NAP1L1 KD组细胞48 h和72 hA值(0.79±0.08、1.31±0.05), 差异有统计学意义(t=6.328、11.570, P<0.05)。克隆形成实验结果显示, 对照组细胞克隆形成数量(109.50±14.45)明显高于NAP1L1 KD组细胞克隆形成数量(66.33±7.69), 差异有统计学意义(t=6.462, P<0.05)。接种30 d后对照组细胞在裸鼠成瘤体积和重量[(1 072.90±114.87) mm3、(4.96±0.52) g]显著高于NAP1L1 KD组细胞[(855.90±55.54) mm3、(3.27±0.23) g], 差异有统计学意义(t=5.387、9.425, P<0.05)对照组细胞G0/G1期比例[(55.03±3.09)%]明显低于NAP1L1 KD组细胞[(74.88±2.16)%], 差异有统计学意义(t=12.890, P<0.05)。对照组细胞G2/M期比例[(5.61±0.63)%]明显低于NAP1L1 KD组细胞[(14.01±1.03)%], 差异有统计学意义(t=17.080, P<0.05)。对照组细胞S期比例[(30.27±1.79)%]明显高于NAP1L1 KD组细胞[(11.44±2.34)%], 差异有统计学意义(t=15.650, P<0.05)。对照组细胞CDK4、CDK6和CCND1蛋白表达水平(1.23±0.06、1.03±0.09、0.88±0.05)明显高于NAP1L1 KD组细胞(0.41±0.07、0.60±0.05、0.30±0.05), 差异有统计学意义(t=21.330、10.560、19.980, P<0.05)。结论 NAP1L1在鼻咽癌组织中呈高表达, 通过调节与肿瘤细胞周期相关蛋白的表达水平, 调节细胞周期变化, 进而影响肿瘤细胞恶性增殖的能力。

关键词：核小体装配蛋白1样1 鼻咽癌增殖周期

长链非编码RNA SNHG16通过微小RNA-455-3p/Nocth2对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的影响

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中华实验外科杂志 2022年第10期39卷 1964-1967页

作者：李萍刁玉佩宋春霞新乡市中心医院新乡医学院第四临床学院耳鼻咽喉头颈外科 453000

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)SNHG16通过微小RNA(miR)-455-3p/Nocth2对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的影响及其机制。方法选取2017年6月到2021年6月新乡市中心医院收治的51例鼻咽癌及其癌旁组织作为研究对象,采用荧光定量聚合酶链反应(... 详细信息

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)SNHG16通过微小RNA(miR)-455-3p/Nocth2对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的影响及其机制。方法选取2017年6月到2021年6月新乡市中心医院收治的51例鼻咽癌及其癌旁组织作为研究对象,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析肿瘤组织和癌旁组织lncRNA SNHG16和miR-455-3p表达水平。采用慢病毒建立lncRNA SNHG16敲降稳定细胞系SNHG16 KD组和对照组,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析两组细胞增殖能力和体内成瘤能力。采用流式细胞术分析两组细胞凋亡水平;采用流式细胞术分析细胞周期变化;采用生物信息学和生物信息学和双荧光素酶报告基因分析lncRNA SNHG16靶基因。组间数据比较采用t检验。结果癌旁组织lncRNA SNHG16表达水平(0.89±0.09)明显低于鼻咽癌组织lncRNA SNHG16表达水平(2.11±0.22),差异有统计学意义(t=36.260,P<0.05)。对照组细胞吸光度(A)值(1.93±0.06)明显高于SNHG16 KD组(1.27±0.06),差异有统计学意义(t=18.350,P<0.05)。对照组细胞在裸鼠体内成瘤体积[(904.94±39.53)mm^(3)]明显高于SNHG16 KD组细胞成瘤体积[(742.82±97.80)mm^(3)],差异有统计学意义(t=4.860,P<0.05)。对照组细胞成瘤重量[(4.70±0.46)g]明显高于SNHG16 KD组细胞[(2.22±0.18)g],差异有统计学意义(t=15.960,P<0.05)。对照组细胞凋亡比例[(4.07±1.34)%]明显低于SNHG16 KD组细胞[(26.79±5.16)%],差异有统计学意义(t=10.430,P<0.05)。对照组细胞G0/G1期比例[(31.56±3.27)%]明显高于SNHG16 KD组细胞[(45.96±1.72)%],差异有统计学意义(t=9.5201,P<0.05)。lncRNA SNHG16是miR-455-3p的海绵。对照组细胞miR-455-3p表达水平(1.19±0.10)明显低于SNHG16 KD组细胞(2.15±0.15),差异有统计学意义(t=13.040,P<0.05)。对照组细胞Notch2表达水平(0.93±0.05)明显高于SNHG16 KD组细胞(0.44±0.06),差异有统计学意义(t=13.040,P<0.05)。结论lncRNA SNHG16海绵吸附miR-455-3p,进而调控Nocth2表达水平,调节鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期。

关键词：长链非编码RNA SNHG16 微小RNA-455-3p Nocth2 鼻咽癌

纤维喉镜下咽鼓管吹张治疗分泌性中耳炎的临床效果观察

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世界最新医学信息文摘 2016年第13期 90-91页

作者：刁玉佩河南省新乡市中心医院

目的:观察纤维喉镜下咽鼓管吹张治疗分泌性中耳炎的临床效果。方法:选择2014年1月;015年5月之间我院收治的120例分泌性中耳炎患者作为研究对象,根据入院顺序分为实验组和对照组,每组60例患者。为对照组实行常规的导管吹张法治疗,实验组... 详细信息

目的:观察纤维喉镜下咽鼓管吹张治疗分泌性中耳炎的临床效果。方法:选择2014年1月;015年5月之间我院收治的120例分泌性中耳炎患者作为研究对象,根据入院顺序分为实验组和对照组,每组60例患者。为对照组实行常规的导管吹张法治疗,实验组采取纤维喉镜下咽鼓管吹张治疗术。比较两组的疗效以及听阙。结果:实验组的疗效和听阙显著优于对照组,P<0.05。结论:纤维喉镜下咽鼓管吹张治疗分泌性中耳炎的效果要显著优于常规导管吹张法,该治疗方法值得临床推广。

关键词：纤维喉镜下咽鼓管吹张分泌性中耳炎听阙

芒柄花黄素对喉癌TU686细胞生长、增殖和凋亡的影响

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临床与实验病理学杂志 2021年第10期37卷 1207-1212页

作者：刁玉佩李萍郭明坤王乐新乡市中心医院新乡医学院第四临床学院耳鼻咽喉科新乡453000 郑州大学第一附属医院耳科郑州450052

目的探讨芒柄花黄素(formononetin,FMN)对喉癌TU686细胞生长、增殖、凋亡及p53通路相关蛋白的影响。方法应用CCK-8法检测不同浓度FMN对喉癌TU686细胞活性的影响,筛选合适剂量;克隆形成法检测细胞克隆形成率;Western blot法检测细胞增殖... 详细信息

目的探讨芒柄花黄素(formononetin,FMN)对喉癌TU686细胞生长、增殖、凋亡及p53通路相关蛋白的影响。方法应用CCK-8法检测不同浓度FMN对喉癌TU686细胞活性的影响,筛选合适剂量;克隆形成法检测细胞克隆形成率;Western blot法检测细胞增殖标志物Ki-67及PCNA的表达量;流式细胞术检测细胞凋亡率及线粒体膜电位的变化;试剂盒检测氧化应激标志物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;Western blot法检测p53、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达水平。结果与FMN 0μmol/L组相比,FMN浓度为10μmol/L时,喉癌TU686细胞活力无明显变化(P>0.05);FMN浓度≥20μmol/L可抑制喉癌TU686细胞活力,差异有显著性(P0.05),20、40μmol/L组细胞活力、克隆形成率、细胞增殖率、线粒体膜电位、SOD活性均明显降低(P<0.05);细胞凋亡率、MDA含量显著增加(P<0.05),p53、Cleaved cas9/cas9、Cleaved cas3/cas3的表达水平上调(P<0.05)。结论FMN具有抑制喉癌TU686细胞生长、增殖,促进细胞凋亡的作用。

关键词：喉肿瘤芒柄花黄素 TU686细胞凋亡 p53

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经耳内窥镜治疗难治性鼻出血的临床效果

临床医学研究与实践 2020年第32期5卷 115-117页

作者：刁玉佩郭明坤李萍赵婕新乡市中心医院河南新乡453000

目的探讨难治性鼻出血的常见出血部位、出血特点及耳内镜下的止血策略。方法经耳内窥镜治疗50例难治性鼻出血患者,分析、总结治疗效果。结果50例鼻出血患者出血点均在内镜下找到,其中下鼻道后穹窿处13例(26.0%)、嗅裂区35例(70.0%)、下... 详细信息

目的探讨难治性鼻出血的常见出血部位、出血特点及耳内镜下的止血策略。方法经耳内窥镜治疗50例难治性鼻出血患者,分析、总结治疗效果。结果50例鼻出血患者出血点均在内镜下找到,其中下鼻道后穹窿处13例(26.0%)、嗅裂区35例(70.0%)、下鼻道前穹窿处2例(4.0%)。50例患者均止血成功,其中48例患者在耳内镜下射频治疗止血,2例嗅裂区出血患者合并有高血压,射频治疗后鼻腔仍有少量渗血,经心内科会诊调整降压药物,血压稳定后1 d,未再渗血。患者均达到理想的治愈效果,治愈率为100.0%。结论难治性鼻出血大多为动脉性出血,若处理不当,会造成不良后果,甚至危及生命;可应用耳内镜在鼻腔仔细寻找难治性鼻出血的出血部位,给予精准定位并有效止血。

关键词：难治性鼻出血耳内窥镜射频治疗