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高效转化胆固醇菌株的筛选、鉴定及转化条件优化

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应用与环境生物学报 2014年第1期20卷 101-106页

作者：郭倩张铁雨冯进辉王玉陈曦路福平吴洽庆朱敦明天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津市生物催化技术工程中心天津300308 浙江省食品药品检验研究院浙江310004

胆固醇由甾体母核和侧链构成,是一种新的甾体资源.以胆固醇为唯一碳源的选择培养基,利用富集培养法从土壤中筛选出一株细菌,编号5901.该菌能够快速高效转化胆固醇,专一性生成4-胆甾烯-3-酮.经形态学观察和16S rDNA序列比对分析,该菌株为... 详细信息

胆固醇由甾体母核和侧链构成,是一种新的甾体资源.以胆固醇为唯一碳源的选择培养基,利用富集培养法从土壤中筛选出一株细菌,编号5901.该菌能够快速高效转化胆固醇,专一性生成4-胆甾烯-3-酮.经形态学观察和16S rDNA序列比对分析,该菌株为Rhodococcus sp.该菌株转化胆固醇的最优条件为:生长温度和转化温度均为30℃,初始pH 8.0.胆固醇质量浓度为5 g/L,反应24 h后,胆固醇转化率为95%.本研究表明,590 1菌株较之前报道的菌株,底物浓度高,转化速率快,也可以催化其它甾体化合物的3β-羟基氧化和5位双键位移反应,具有潜在的研究和应用价值.

关键词：胆固醇 4-胆甾烯-3-酮胆固醇氧化酶红球菌植物甾醇

来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质

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生物工程学报 2013年第4期29卷 480-489页

作者：周传华陈曦冯进辉肖冬光吴洽庆朱敦明天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津300308

葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal（GenBank ***20452．1）构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8．0；合... 详细信息

葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal（GenBank ***20452．1）构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8．0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45℃。在45℃下孵育2h对ShNAL的活力基本无影响，高于45℃时，活力迅速下降。该酶在pH5．0～10．0的环境中比较稳定，4℃下放置24h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）、N-乙酰甘露糖胺（Man）和丙酮酸（Pyr）的K。值分别是（4．0±0．2）mmol／L、（131．7±12．1）mmol／L和（35．1±3．2）mmol／L，kca／Km值分别为1．9L／（mmol·S）、O．08L／（mmol·S）和0．08L／（mm01·s）。

关键词：葡萄球菌 N-乙酰神经氨酸裂合酶表达纯化生物催化

系列甾体药物关键中间体转化菌种构建及智能化生产应用

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生物工程学报 2022年第11期38卷 4335-4342页

作者：冯进辉张汝金张峥斌吴洽庆朱敦明中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308 国家合成生物技术创新中心天津300308 浙江仙居君业药业有限公司浙江台州317300

甾体激素药物是仅次于抗生素的第二大类药物,当前甾体工业的初始原料已经由从黄姜等植物中提取的薯蓣皂素转向植物甾醇。作为食用油工业的副产物,植物甾醇来源广泛,价格低廉,经微生物转化后可生成雄烯二酮(androstenedione,AD)、雄二烯... 详细信息

甾体激素药物是仅次于抗生素的第二大类药物,当前甾体工业的初始原料已经由从黄姜等植物中提取的薯蓣皂素转向植物甾醇。作为食用油工业的副产物,植物甾醇来源广泛,价格低廉,经微生物转化后可生成雄烯二酮(androstenedione,AD)、雄二烯二酮(androstadiendione,ADD)、9α-羟基-雄烯二酮(9α-hydroxy-androstenedione,9α-OH-AD)等一系列化合物,这些关键中间体可用于甾体药物合成。甾体代谢途径长、副产物多、调控复杂,传统的微生物筛选、诱变育种方法和油水两相转化体系已经不适于当前的工业生产需求。文中以笔者团队与浙江仙居君业药业有限公司联合开发的新一代甾体药物关键中间体的转化菌株构建和智能化生产为例,综述甾体药物中间体菌种改造和转化工艺开发及其在产业化应用中的进展。未来,随着合成生物学技术的发展,有望开发出更适于甾体药物合成的新一代中间体;乃至以葡萄糖等为原料,使用微生物直接合成甾体原料药。这些生物技术(biotechnology,BT)创建的新一代菌株在基于信息化、智能化技术(intelligent technology,IT)建设的现代工厂中的应用,将会形成更高效、更绿色的生产方式,并产生显著的社会效益和经济价值。

关键词：甾体类药物关键中间体微生物转化雄烯二酮智能工厂

高通量筛选具有催化活性和立体选择性羰基还原酶

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生物工程学报 2015年第2期31卷 220-230页

作者：张航陈曦冯进辉鲍锦库吴洽庆朱敦明四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室四川成都610064 中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津市生物催化技术工程中心天津300308

根据羰基还原酶催化可逆氧化还原反应的原理,利用与偶氮还原酶催化偶氮染料还原反应耦合的颜色变化,建立了一种新的羰基还原酶筛选方法。由于羰基还原酶在催化醇底物氧化反应时会产生NAD(P)H,当在反应体系中加入偶氮还原酶AzoB和偶氮染... 详细信息

根据羰基还原酶催化可逆氧化还原反应的原理,利用与偶氮还原酶催化偶氮染料还原反应耦合的颜色变化,建立了一种新的羰基还原酶筛选方法。由于羰基还原酶在催化醇底物氧化反应时会产生NAD(P)H,当在反应体系中加入偶氮还原酶AzoB和偶氮染料金橙Ⅰ的时候,偶氮还原酶可以利用NAD(P)H作为电子的供体与底物金橙Ⅰ发生反应,导致反应体系颜色的变化,这样就能够根据明显的颜色变化推断出该羰基还原酶是否对所选底物表现出特定的活性,进而可以筛选出有活性的羰基还原酶。同时,使用不同构型的手性醇作为底物时,根据体系的颜色变化,可以实现羰基还原酶的活性和立体选择性的同时筛选。

关键词：手性醇羰基还原酶偶氮还原酶偶氮染料筛选方法

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微生物脱有机硫研究前沿

中国生物工程杂志 2003年第11期23卷 37-41页

作者：于波冯进辉李福利许平山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100

环境问题日益成为人们关注的焦点 ,现代工业的发展使人类对化石燃料的依赖性越来越大。化石燃料的大量使用也造成了环境的严重污染 ,常规的加氢法处理燃油能耗高 ,处理效果不理想等方面的缺陷促进了生物脱硫的研究。简述了国外过去三年... 详细信息

环境问题日益成为人们关注的焦点 ,现代工业的发展使人类对化石燃料的依赖性越来越大。化石燃料的大量使用也造成了环境的严重污染 ,常规的加氢法处理燃油能耗高 ,处理效果不理想等方面的缺陷促进了生物脱硫的研究。简述了国外过去三年来在生物脱硫工作中取得的进展 ,包括菌株的改造 ;单加氧酶活力必需的黄素还原酶DszD ;途径的最后一个酶HPBS脱硫酶以及国外公司的一些工作。

关键词：生物脱有机硫黄素还原酶 HPBS脱硫酶处理效果

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一株红球菌脱硫菌株脱硫特性的研究

化学学报 2004年第19期62卷 1883-1888页

作者：马翠卿佟明友于波曾义勇方向晨冯进辉张全李福利许平山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院抚顺113001

从炼油厂污水排放口取得的土样中筛选到一株能降解二苯并噻吩 (DBT)的菌株 ,用GC/MS方法 ,证明其降解DBT走硫专一脱除途径 ,即“4S途径” .该菌株被命名为SDUZAWQ ,用微生物生理生化实验及 16SrDNA序列分析初步鉴定为红球菌属 (Rhodococ... 详细信息

从炼油厂污水排放口取得的土样中筛选到一株能降解二苯并噻吩 (DBT)的菌株 ,用GC/MS方法 ,证明其降解DBT走硫专一脱除途径 ,即“4S途径” .该菌株被命名为SDUZAWQ ,用微生物生理生化实验及 16SrDNA序列分析初步鉴定为红球菌属 (Rhodococcussp .) .实验结果表明 ,红球菌SDUZAWQ可有效降解苯并噻吩 (BT)和DBT及其甲基衍生物 .在 2d内 ,BT与DBT可同时完全降解 ,0 .5mmol·L-1的BT在 1d内可降解掉 86% ,降解速度高于DBT的降解 .5 MBT的降解率也高于 4,6 DMDBT和 4 MDBT .4 MDBT较 4,6 DMDBT更难降解 ,在 2d内 ,红球菌SDUZAWQ可降解 62 %的 4,6 DMDBT ,而相同条件下 ,4 MDBT仅能被降解 3 6% .

关键词：红球菌脱硫菌株脱硫特性二苯并噻吩化石燃料

萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

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四川大学学报（自然科学版） 2013年第5期50卷 1109-1118页

作者：牛可钦冯进辉吴洽庆鲍锦库四川大学生命科学学院成都610065 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

本研究从萨尔瓦多型银合欢(Leucaena leucocephala ***)种子中分离纯化出一种新的胰蛋白酶抑制剂,即萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白抑制剂(Trypsin Inhibitor from Leucaena leucocephala *** seeds,LlsTI).成熟的种子经粉碎,生理盐水浸提... 详细信息

本研究从萨尔瓦多型银合欢(Leucaena leucocephala ***)种子中分离纯化出一种新的胰蛋白酶抑制剂,即萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白抑制剂(Trypsin Inhibitor from Leucaena leucocephala *** seeds,LlsTI).成熟的种子经粉碎,生理盐水浸提之后,经CM-Sepharose阳离子交换层析得到LlsTI纯品.该胰蛋白抑制剂为19.8kDa的单体蛋白.其N末端测序结果为KGSYLRDVRG,而其内部则含有一段KTAPLVVGFLK的序列,与已知的蛋白酶抑制剂序列都不同,表明LlsTI为一种新的胰蛋白酶抑制剂,同时也含有一部分与已知Kunitz型抑制剂相保守的碱基.LlsTI对胰蛋白酶的摩尔抑制比近似为1∶1.其对于胰蛋白酶属竞争性抑制剂,其Ki值为2.77×10-10 ***对胰蛋白酶的抑制活力表现出对高温和pH变化较高的耐受性.但其活性受100mM DTT影响.本研究对LlsTI对其它丝氨酸类蛋白酶的抑制作用也做了测定,其中只有胰蛋白酶的活性受到了抑制.根据圆二色谱的分析结果,LlsTI是一种αβ蛋白,其二级结构在室温下的水和缓冲液Tris-HCl(pH7.5)中组成相似.

关键词：胰蛋白酶抑制剂萨尔瓦多型银合欢温度耐受性 pH耐受性抑制动力学圆二色谱

一种来源于毕赤酵母的高对映选择性羰基还原酶的性质及底物谱分析

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生物工程学报 2013年第2期29卷 169-179页

作者：田来强刘卫东陈曦冯进辉杨洪江吴洽庆朱敦明马延和天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津300308

手性醇是一类非常重要的化合物,羰基还原酶催化酮的不对称还原生成对应的手性醇。从毕赤酵母Pichia pastoris GS115基因组数据中找到一个潜在的NADPH依赖的羰基还原酶,研究毕赤酵母***115中的羰基还原酶。根据其核酸序列设计引物,从*** ... 详细信息

手性醇是一类非常重要的化合物,羰基还原酶催化酮的不对称还原生成对应的手性醇。从毕赤酵母Pichia pastoris GS115基因组数据中找到一个潜在的NADPH依赖的羰基还原酶,研究毕赤酵母***115中的羰基还原酶。根据其核酸序列设计引物,从*** GS115基因组中扩增到目的基因ppcr,大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA纯化,对酶的性质和底物谱进行了研究。PPCR的最适反应温度为35℃,最适反应pH为6.0,低于45℃时有很好的稳定性。对3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km和kcat分别为9.48 mmol/L和0.12 s-1。PPCR表现出广泛的底物谱和很高的对映选择性,对醛、α-酮酯、芳香族β-酮酯及芳香族酮都表现出了很好的活性,在测定的底物中,除极少数底物外,ee值均达到97%以上。因此,PPCR具有较好的应用前景。

关键词：羰基还原酶不对称还原手性醇毕赤酵母

一种来源于运动替斯崔纳菌KA081020-065的新型卤醇脱卤酶的表达纯化及性质分析

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生物工程学报 2015年第5期31卷 659-669页

作者：王雷袁京姚培圆程丽华解美仙贾荣荣冯进辉王敏吴洽庆朱敦明天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津市生物催化技术工程中心天津300308 河北诚信有限责任公司河北石家庄051130

卤醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase)不仅对于含氯污染物的生物降解、净化环境具有重要意义,而且在手性医药中间体合成中也是一种重要的生物催化剂,但其数量较少。采用基因挖掘在基因组数据库中获得一种来自运动替斯崔纳菌Tistrella mo... 详细信息

卤醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase)不仅对于含氯污染物的生物降解、净化环境具有重要意义,而且在手性医药中间体合成中也是一种重要的生物催化剂,但其数量较少。采用基因挖掘在基因组数据库中获得一种来自运动替斯崔纳菌Tistrella mobilis KA081020-065的新型卤醇脱卤酶基因Hhe TM,将该基因克隆、表达在大肠杆菌BL21(DE3)中,利用镍柱亲和层析将该酶进行纯化并研究了其酶学性质。Hhe TM是一种同源四聚体;最适温度为50℃;不同的p H缓冲液对其活性有较大影响;在碱性、30℃以下的条件下稳定性高。在氰根离子存在的条件下,Hhe TM能够催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯,为酶法合成阿托伐他汀关键中间体提供了一种新的卤醇脱卤酶。

关键词：卤醇脱卤酶运动替斯崔纳菌 (R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯