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高效赤红球菌协同CpG ODN增强鸡禽流感疫苗的免疫效力

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畜牧兽医学报 2022年第12期53卷 4367-4378页

作者：潘伟雄陈钰怡赵锃珏冯赛祥仇微红叶贺佳张玲华华南农业大学生命科学学院广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室广州510642 华南农业大学兽医学院广州510642 广州市华南农大生物药品有限公司广州511300

禽类疫苗存在免疫效率低、免疫持续时间短和细胞免疫刺激不足等问题,新型禽类疫苗佐剂亟待开发。作者的前期研究证实,CpG ODN具有高度的安全性以及良好的细胞和体液免疫刺激功能,然而,CpG ODN的生产和使用成本十分高昂,尚未用于禽类疫... 详细信息

禽类疫苗存在免疫效率低、免疫持续时间短和细胞免疫刺激不足等问题,新型禽类疫苗佐剂亟待开发。作者的前期研究证实,CpG ODN具有高度的安全性以及良好的细胞和体液免疫刺激功能,然而,CpG ODN的生产和使用成本十分高昂,尚未用于禽类疫苗佐剂。为了降低成本并提升功效,基于TLR2和TLR21潜在的协同关系,本研究以禽流感疫苗为模式疫苗,探究了赤红球菌和CpG ODN协同刺激免疫的关系。通过HI试验、细胞增殖试验和相关细胞因子表达量的检测,证实了该复合佐剂具有更强大的体液免疫和细胞免疫提升功效,能提升Th 1型免疫反应,免疫保护持续时间长,同时还能增强系统和局部免疫。通过检测受体的表达量,确证了CpG ODN与赤红球菌之间存在着协同关系。此外,在CpG ODN剂量减半的复合佐剂刺激试验中,发现由于协同关系的存在,CpG ODN半剂量的复合佐剂仍具有良好的免疫刺激效果。本研究为进一步降低CpG制剂的生产和使用成本做了先行探究,为CpG制剂高效且成本可控地应用于禽类动物养殖,乃至畜牧养殖奠定了基础。

关键词：高效佐剂 CpG ODN 赤红球菌 Th1型免疫

大肠杆菌(Escherichia coli)体外脂肪酸合成反应的重建

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生物化学与生物物理进展 2008年第8期35卷 954-963页

作者：冯赛祥朱磊罗彪孙益嵘王海洪华南农业大学生命科学学院广州510642

PCR扩增大肠杆菌参与脂肪酸合成的7个主要酶基因:fabD、fabG、fabH、fabA、fabZ、fabB和fabI,并构建相应的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中分别诱导表达酶蛋白,并使用Ni-NTA琼脂糖纯化到7种酶蛋白.体外添加所需酶蛋白和辅因子,在不使用[... 详细信息

PCR扩增大肠杆菌参与脂肪酸合成的7个主要酶基因:fabD、fabG、fabH、fabA、fabZ、fabB和fabI,并构建相应的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中分别诱导表达酶蛋白,并使用Ni-NTA琼脂糖纯化到7种酶蛋白.体外添加所需酶蛋白和辅因子,在不使用[2-14C]丙二酸单酰CoA的条件下,成功地实现了脂肪酸合成反应的重建,另外还建立了数个鉴定有关酶蛋白功能的标准反应,并用其鉴定了丙酮丁醇梭菌FabZ的功能.

关键词：细菌脂肪酸合成脂酰ACP 非变性聚丙烯酰胺凝胶

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鸡β干扰素的原核表达及抗病毒活性检测

中国动物传染病学报 2016年第4期24卷 59-63页

作者：吴斯宇黄健妮崔进冯赛祥欧阳国文向程威郭旸廖明焦培荣华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室广州510642

根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中发表的鸡β干扰素基因序列进行密码子优化与人工合成,构建原核表达质粒pET-28b-ChIFN-β,重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,产物主要以包涵体形式存在。包涵体进行变性、复性... 详细信息

根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中发表的鸡β干扰素基因序列进行密码子优化与人工合成,构建原核表达质粒pET-28b-ChIFN-β,重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,产物主要以包涵体形式存在。包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化后,SDS-PAGE、Western blot分析表明pET-28b-ChIFN-β表达正确,并且表达量较高。重组鸡β干扰素蛋白在DF-1细胞上能明显抑制水疱性口炎病毒繁殖,抗病毒活性达2.73×10-6UI/mg。本研究结果为鸡β干扰素在临床防治禽类病毒性疾病的探索奠定了基础。

关键词：鸡β干扰素原核表达抗病毒活性

副猪嗜血杆菌SC096株荚膜多糖抗猪肺泡巨噬细胞吞噬能力的研究

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畜牧兽医学报 2016年第6期47卷 1232-1238页

作者：周琪贺现辉阳巧梅冯赛祥樊惠英廖明华南农业大学兽医学院广州510642 邵阳职业技术学院邵阳422000

为探讨荚膜多糖在副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)抗猪肺泡巨噬细胞吞噬中的作用,作者用间接免疫荧光试验和流式细胞术对H.parasuis SC096分离株及其荚膜缺陷型菌株进行了抗巨噬细胞吞噬试验。间接免疫荧光试验显示野生菌株组的H.pa... 详细信息

为探讨荚膜多糖在副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)抗猪肺泡巨噬细胞吞噬中的作用,作者用间接免疫荧光试验和流式细胞术对H.parasuis SC096分离株及其荚膜缺陷型菌株进行了抗巨噬细胞吞噬试验。间接免疫荧光试验显示野生菌株组的H.parasuis大多数存在于巨噬细胞外,而荚膜多糖缺失突变体则主要存在于巨噬细胞内。流式细胞仪检测结果表明,对应的野生型菌株组巨噬细胞总的吞噬率为12.51%,吞入效率为89.61%;而荚膜多糖缺陷型组巨噬细胞总的吞噬率为27.18%,吞入效率为91.06%。加入外源荚膜多糖后,野生型菌株组巨噬细胞总的吞噬率降为2.72%,吞入效率降为32.72%;荚膜多糖缺陷型组巨噬细胞总的吞噬率降为3.59%,吞入效率基本不变,为91.36%。荚膜多糖缺失后H.parasuis抗巨噬细胞吞噬能力降低,表明H.parasuis SC096株荚膜多糖具有抑制巨噬细胞吞噬能力的作用。

关键词：副猪嗜血杆菌荚膜多糖猪肺泡巨噬细胞吞噬能力

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鸡α干扰素的原核表达及纯化

中国兽医杂志 2016年第8期52卷 29-31页

作者：吴斯宇孙超崔进冯赛祥黄健妮王念晨曲楠楠廖明焦培荣华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510642 君拓价值投资公司美国新泽西州08542 北京利昂盛生物技术有限公司北京海淀100094

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要... 详细信息

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。

关键词：鸡α干扰素原核表达蛋白纯化

HPS OmpP2膜外结构环诱导PAMs IL-8 mRNA转录的研究

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中国兽医杂志 2015年第10期51卷 3-6页

作者：罗银珠贺现辉周素明冯赛祥姚文凤徐成刚廖明辛朝安华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点开放实验室广东广州510642 宁波大学海洋科学院海洋生物应用重点实验室浙江宁波315211 广东省河源市动物疫病预防控制中心广东河源517000

OmpP2是副猪嗜血杆菌的致病因子,也是其重要的免疫原性蛋白。为探明OmpP2蛋白8个膜外结构环(Loop)在HPS感染过程中的促炎作用,本试验以猪肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophages,PAMs)为细胞模型,以HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白、HP... 详细信息

OmpP2是副猪嗜血杆菌的致病因子,也是其重要的免疫原性蛋白。为探明OmpP2蛋白8个膜外结构环(Loop)在HPS感染过程中的促炎作用,本试验以猪肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophages,PAMs)为细胞模型,以HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白、HPS血清5型标准菌株全菌体及牛血清白蛋白(BSA)作为参照,通过Real-Time PCR的方法研究OmpP2 8个膜外结构环诱导PAMs产生炎性应答的作用。结果显示,与空白对照组相比,HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白膜外结构环均能诱导PAMs细胞使其促炎细胞因子IL-8的转录水平出现不同程度的上调,表明它们在HPS感染过程中参与了宿主肺泡巨噬细胞的促炎性免疫应答;在8个膜外结构环中,Loop7(2^(-△△Ct)≈8,P<0.05)表现出非常显著的刺激活性,远远高于其他膜外结构环组,并与HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白组的诱导上调幅度(2^(-△△Ct)≈12(P<0.05))最接近,表明Loop7在OmpP2蛋白诱导PAMsIL-8促炎性免疫应答过程中扮演着重要角色,结果暗示Loop7很可能是OmpP2致宿主肺巨噬细胞促炎性功能活跃区。本试验为进一步了解OmpP2蛋白功能及了解HPS诱导宿主细胞炎症反应分子机制提供实验基础。

关键词：副猪嗜血杆菌 OmpP2 膜外结构环猪肺巨噬细胞细胞因子 IL-8

galU和galE基因敲除对副猪嗜血杆菌脂寡糖分子质量的影响

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动物医学进展 2013年第11期34卷 66-68页

作者：李静怡徐成刚冯赛祥贺现辉邹易廖明华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室广东广州510642

副猪嗜血杆菌所引起的疾病每年给全世界养猪业造成巨大的经济损失,但是其毒力因子和致病机制仍不清楚。galU(编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶)和galE(编码UDP-半乳糖-4’-异构酶)是与多糖合成相关的2个基因,为了解它们的缺失对副猪嗜血杆菌脂... 详细信息

副猪嗜血杆菌所引起的疾病每年给全世界养猪业造成巨大的经济损失,但是其毒力因子和致病机制仍不清楚。galU(编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶)和galE(编码UDP-半乳糖-4’-异构酶)是与多糖合成相关的2个基因,为了解它们的缺失对副猪嗜血杆菌脂寡糖分子质量的影响,利用热酚法抽提脂寡糖,经过SDS-PAGE和银染。结果显示,galU和galE的缺失导致脂寡糖的泳动速度明显加快,表明这两个基因与脂寡糖的分子质量密切相关。

关键词：副猪嗜血杆菌脂寡糖 galU galE

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副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2的提取及鉴定

中国畜牧兽医 2014年第9期41卷 225-230页

作者：罗银珠徐成刚周素明冯赛祥贺现辉樊惠英廖明辛朝安华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室广东广州510642 宁波大学海洋科学院海洋生物应用重点实验室浙江宁波315211

为简化副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白中的单一蛋白外膜蛋白P2(OmpP2)的分离步骤,降低膜蛋白分离的设备要求,本试验用Hps标准3型(SW114)、5型(Nagasaki)菌株作为试验材料,选用溶菌酶、核酸酶对Hps进行酶解以获得其完... 详细信息

为简化副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白中的单一蛋白外膜蛋白P2(OmpP2)的分离步骤,降低膜蛋白分离的设备要求,本试验用Hps标准3型(SW114)、5型(Nagasaki)菌株作为试验材料,选用溶菌酶、核酸酶对Hps进行酶解以获得其完整外膜,然后利用含有2%tritonX-100缓冲液对外膜进行进一步解离,最后利用适量浓度的胰酶对强疏水蛋白进行酶解,实现了Hps高纯度OmpP2的体外快速提取。SDS-PAGE结果显示,上述2株菌OmpP2大小分别约为43和38ku;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定结果显示,从上述蛋白酶解下来的肽段经比对与Hps的OmpP2完全吻合。斑点杂交(Dot-blot)显示采自Hps患病猪血清在点有5型菌株(Nagasaki)OmpP2和点有3型菌株(SW114)OmpP2NC膜上均发生杂交显色反应,该结果暗示OmpP2是一个具有免疫活性的抗原。本研究为OmpP2功能及免疫保护性研究奠定了基础,也为副猪嗜血杆菌病免疫学诊断提供新的参考。

关键词：副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2 提取鉴定

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基于微生物遗传技术与兽医学科结合的人才培养改革探索

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现代农业科技 2020年第16期 236-237页

作者：冯赛祥瞿孝云孙海亮华南农业大学广东广州510642

加快农业科技创新,是实现现代农业的重大要素,是建设社会主义新农村的重大举措,是推进农村改革发展的重要任务,其中人才是关键.培养农业创新型人才有着重要的现实意义.本文从课程内容设计、授课形式等方面对微生物技术与兽医学科交叉结... 详细信息

加快农业科技创新,是实现现代农业的重大要素,是建设社会主义新农村的重大举措,是推进农村改革发展的重要任务,其中人才是关键.培养农业创新型人才有着重要的现实意义.本文从课程内容设计、授课形式等方面对微生物技术与兽医学科交叉结合教育进行探索,并提出微生物遗传技术与兽医学科结合课程建立需考虑的问题,以期为兽医创新人才培养提供参考.

关键词：微生物遗传技术兽医学科人才培养