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抑制猪源致病性大肠杆菌的乳酸菌筛选及其抑菌成分分析

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中国预防兽医学报 2022年第12期44卷 1277-1282,1297页

作者：冯瑜菲刘文鑫袁超文胡清泉岭南师范学院生命科学与技术学院广东湛江524048 湛江中心人民医院广东湛江524045 东北大学生命科学与健康学院辽宁沈阳110006 沈阳农业大学动物科学与医学学院辽宁沈阳110866

为筛选能够抑制猪源致病性大肠杆菌(Escherichia coli)的乳酸菌(LAB)并分析LAB的主要抑菌成分,本研究利用牛津杯法测定了21株从健康猪体内分离到的LAB对4株不同血清型猪源致病性E. coli的抑菌活性,并采用微量稀释法测定了其最小抑菌浓度... 详细信息

为筛选能够抑制猪源致病性大肠杆菌(Escherichia coli)的乳酸菌(LAB)并分析LAB的主要抑菌成分,本研究利用牛津杯法测定了21株从健康猪体内分离到的LAB对4株不同血清型猪源致病性E. coli的抑菌活性,并采用微量稀释法测定了其最小抑菌浓度(MIC)。结果显示,筛选到6株LAB,分别为唾液乳杆菌和粪肠球菌各2株、黏膜乳杆菌和约氏乳杆菌各1株,对4株致病性E. coli均具有明显的抑制作用,其中唾液乳杆菌L1-5的抑制效果最明显,MIC值最低,而约氏乳杆菌L4-3的抑菌活性最低,MIC值相对较高。通过测定生长曲线分析筛选到的LAB对致病性E. coli增殖的影响,采用有机酸排除、过氧化氢酶处理和蛋白酶敏感性检测等方法分析LAB发挥抑菌作用的主要成分,并进一步分析温度、紫外线和表面活性剂对LAB抑菌成分的影响。生长曲线测定结果显示,与LAB共培养后,4株E. coli的增殖速度均降低,且在各时间点的OD_(600nm)值均低于不加LAB的对照组。对LAB抑菌成分的分析结果显示,pH值调整为6.5后4株乳杆菌的抑菌活性均消失,而不同蛋白酶处理后2株粪肠球菌的抑菌活性极显著降低(P<0.01、P<0.001),分析可知其中4株乳杆菌的主要抑菌成分为有机酸,而2株粪肠球菌的主要抑菌成分推测为细菌素。抑菌作用稳定性分析结果显示,6株LAB在不同温度、紫外线照射和表面活性剂处理后仍具有较强的抑菌活性。上述结果表明,6株分离自健康猪体内的LAB对4株猪源致病性E.coli均具有明显的抑菌活性。本研究为防治猪大肠杆菌病的新型微生态制剂开发奠定了基础。

关键词：致病性大肠杆菌乳酸菌抑菌活性有机酸细菌素

表达猪圆环病毒3型Cap蛋白重组乳酸乳球菌的构建及免疫原性分析

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中国预防兽医学报 2022年第11期44卷 1201-1207页

作者：冯瑜菲胡清泉张力国袁超文岭南师范学院生命科学与技术学院广东湛江524048 沈阳农业大学动物科学与医学学院辽宁沈阳110866 辽宁省农业发展服务中心辽宁沈阳110030 东北大学生命科学与健康学院辽宁沈阳110006

为构建表达猪圆环病毒3型(PCV3)免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌,并在小鼠体内评估其免疫原性,本研究利用同源重组技术分别将PCV3 Cap基因及其与M细胞靶向肽Co1基因的融合基因分别克隆至乳酸乳球菌NZ3900配套的p NZ8149载体中,电转化受... 详细信息

为构建表达猪圆环病毒3型(PCV3)免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌,并在小鼠体内评估其免疫原性,本研究利用同源重组技术分别将PCV3 Cap基因及其与M细胞靶向肽Co1基因的融合基因分别克隆至乳酸乳球菌NZ3900配套的p NZ8149载体中,电转化受体菌后,构建两株重组乳酸乳球菌pNZ8149-Cap/NZ3900和pNZ8149-Cap-Co1/NZ3900,经Nisin诱导后利用western blot检测重组蛋白的表达,结果显示,Cap蛋白及Cap-Co1融合蛋白在重组乳酸乳球菌中均正确表达。将诱导后的两株重组菌口服免疫BALB/c小鼠,采用ELISA分别测定了免疫后不同时间(0、14 d、28 d和42 d)小鼠粪便中分泌型IgA(SIgA)和血清中IgG抗体水平,并利用流式细胞术检测免疫小鼠CD4^(+)和CD8^(+)T细胞水平,利用ELISA试剂盒检测小鼠IFN-γ和IL-4细胞因子含量。结果显示,与对照组相比,两株重组乳酸乳球菌免疫小鼠血清中IgG抗体水平无明显变化,而SIgA抗体水平极显著升高(P<0.001);同时,免疫小鼠CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的比值和细胞因子含量均极显著高于对照组(P<0.01、P<0.001);而且pNZ8149-Cap-Co1/NZ3900免疫小鼠后能够比pNZ8149-Cap/NZ3900免疫组诱导更高水平的免疫反应(P<0.05)。本研究首次证实表达PCV3 Cap蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫小鼠后能够刺激其产生特异性的黏膜免疫抗体及细胞免疫反应,为PCV3乳酸菌口服疫苗的研发奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒3型 Cap蛋白乳酸乳球菌免疫原性

新农科背景下植物组织培养课程思政教学改革与探索

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智慧农业导刊 2022年第22期2卷 120-122页

作者：卢翔冯瑜菲张鸿雁莫雨杏岭南师范学院生命科学与技术学院广东湛江524048

农学教育是我国高等教育的重要组成部分。课程思政是教育培养德才兼备的农业科技人才的重要途径。该文以植物组织培养课程为例,分析其开展课程思政的必要性,介绍课程思政元素的挖掘,探讨课程思政改革实践方法和途径以及改革措施。以期... 详细信息

农学教育是我国高等教育的重要组成部分。课程思政是教育培养德才兼备的农业科技人才的重要途径。该文以植物组织培养课程为例,分析其开展课程思政的必要性,介绍课程思政元素的挖掘,探讨课程思政改革实践方法和途径以及改革措施。以期在调动学生学习主动性和积极性的基础上,将专业自信、爱国主义教育、创新精神、职业道德教育及思辨和团队协作能力有效融入课程教学,为深化农林教育改革提供借鉴,为农业、农村和涉农企业培养高素质复合型技术技能人才奠定基础。

关键词：新农科课程思政植物组织培养教学改革措施

猪水肿病大肠杆菌毒力因子鸡卵黄抗体制备及Stx2e基因LAMP方法建立

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猪水肿病大肠杆菌毒力因子鸡卵黄抗体制备及Stx2e基因LAMP方法建立

作者：冯瑜菲东北农业大学

学位级别：硕士

猪水肿病（Edema disease of swine,ED）是由某些溶血性大肠杆菌引起断奶仔猪的一种毒血症。临床特征为头部和胃壁等处水肿、共济失调、惊厥和麻痹等。该病发病急、死亡快,往往来不及治疗,死亡率很高。猪水肿病的发生与大肠杆菌的F18ab... 详细信息

猪水肿病（Edema disease of swine,ED）是由某些溶血性大肠杆菌引起断奶仔猪的一种毒血症。临床特征为头部和胃壁等处水肿、共济失调、惊厥和麻痹等。该病发病急、死亡快,往往来不及治疗,死亡率很高。猪水肿病的发生与大肠杆菌的F18ab菌毛与志贺毒素Ⅱ型变异体（Stx2e）密切相关。目前,对该病的防治主要采用大肠杆菌多价苗免疫和抗生素治疗,但防治效果均不理想。卵黄抗体作为一类可替代抗生素的高效生物防治制剂在防治猪水肿病中显示出明显的效果,为该病的防治开辟了新的途径。本研究提取了F18ab菌毛蛋白与Stx2e,并利用原核表达技术,分别获得了F18ab菌毛与Stx2e的具有中和抗原表位的Fed F重组蛋白和Stx2eB重组蛋白。分别以上述4种蛋白作为免疫原对6月龄海兰蛋鸡进行免疫。共进行3次免疫,每次间隔两周。其中,Stx2e免疫组在一免时分为0.20 mg /只和0.40mg/只两个免疫剂量组,二免时,将一免的每个免疫剂量组再分为两小组,两个小组的免疫剂量分别为该组一免时的免疫剂量和一免时免疫剂量的2倍,三免时,所有免疫组的免疫剂量均为二免时最高免疫剂量组的剂量;Stx2eB重组蛋白免疫组在一免时分为0.50 mg /只和1.00mg/只两个免疫剂量组,二免和三免的免疫方式同Stx2e免疫组;F18ab菌毛蛋白免疫组在一免时分为0.38 mg /只和0.76mg/只两个免疫剂量组,二免和三免的免疫方式同Stx2e免疫组;Fed F重组蛋白免疫组三次免疫的剂量分别为1.00mg/只、2.00mg/只、2.00mg/只。二免后一周收蛋并用氯仿抽提法提取卵黄抗体,用间接ELISA法检测抗体效价。其中,以Stx2e、Stx2eB重组蛋白、F18ab菌毛蛋白、Fed F重组蛋白作为免疫原的免疫组ELISA效价最高值分别为1:5120、1:5120、1:20480、1:1280,且高水平效价分别可维持6周、2周、4周、3周。安全性实验结果显示,4种卵黄抗体均达到《中国兽药典》对兽医生物制品的标准。吸附和吸附抑制试验结果显示,抗F18ab菌毛蛋白卵黄抗体和抗FedF重组蛋白卵黄抗体分别与F18ab+大肠杆菌按1:1的体积比混合作用30min后,均能够抑制F18ab+大肠杆菌对仔猪小肠上皮细胞的吸附,而未用卵黄抗体处理的F18ab+大肠杆菌可紧密的吸附于仔猪小肠上皮细胞表面。体外中和试验结果显示,抗Stx2e卵黄抗体和抗Stx2eB重组蛋白卵黄抗体均可以抑制Stx2e对Vero细胞的致病变作用,接种这2种卵黄抗体的Vero细胞和对照组相比仍有大量正常生长的细胞,仅出现少量的死亡细胞。体内中和试验结果显示,抗Stx2e卵黄抗体在原液、1:2、1:4三个稀释浓度下,对昆明鼠的保护率分别为100%、60%、60%,抗Stx2eB重组蛋白卵黄抗体在原液、1:2、1:4三个稀释浓度下,对昆明鼠的保护率分别为100%、60%、40%,而生理盐水对照组和仅腹腔注射卵黄抗体的对照组昆明鼠生长正常,仅注射Stx2e对照组昆明鼠在48h内死亡率达到80%。本研究还建立了环介导等温扩增法（LAMP）用来检测Stx2e基因,根据GenBank中12条Stx2e序列和9条Stx2序列,针对Stx2e基因的保守区设计一套引物。以煮沸法处理的Stx2e+大肠杆菌过夜培养物为模板进行LAMP反应,所得扩增产物溶液变浑浊而对照管未发生变化。LAMP扩增产物电泳后呈特征性梯状条带,而阴性对照无扩增条带,在LAMP体系中加入1μl SYBR GreenⅠ染料后,肉眼观察时阳性管呈翠绿色,而阴性管则为淡橙色,紫外灯下,阳性管发出绿色荧光,而阴性管则无颜色变化。经反应条件优化后的LAMP方法在63℃反应1h后可得最佳反应效果。特异性试验结果显示,该LAMP方法仅对Stx2e+大肠杆菌产生特征性梯状扩增条带,而对LT+、ST+、Stx2+大肠杆菌检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对Stx2e+大肠杆菌的最低检出量为38CFU/管,是PCR方法敏感性的100倍。LAMP方法和PCR方法对模拟样品检测结果的符合率为100%。证明本法具有快速、特异和敏感的特点。本研究结果表明,针对致猪水肿病大肠杆菌的Stx2e与F18ab菌毛可以制备出高效价的卵黄抗体,为该病的特异性防治提供了物质基础,并为下一步的临床应用提供了实验基础。所建立的针对Stx2e基因的LAMP快速检测方法具有快速、灵敏、特异、结果判定简便的特点,有利于猪水肿病的诊断和Stx2e+大肠杆菌的快速检测。

关键词：猪水肿病大肠杆菌 Stx2e毒素 F18ab菌毛卵黄抗体 LAMP

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新形势下食品安全学课程线上教学改革的探讨

中国食品 2022年第9期 52-54页

作者：冯瑜菲卢翔张鸿雁彭慧宋秀丽岭南师范学院生命科学与技术学院

随着我国经济社会的快速发展及居民生活条件的不断改善,人们对饮食方面的要求逐年升高,由原来的满足吃饱逐渐转向吃得安全、吃得健康,不仅要求食品要外观好、口感佳、营养足,更要求食品品质更加安全、放心。现如今,在食品行业高速发展... 详细信息

随着我国经济社会的快速发展及居民生活条件的不断改善,人们对饮食方面的要求逐年升高,由原来的满足吃饱逐渐转向吃得安全、吃得健康,不仅要求食品要外观好、口感佳、营养足,更要求食品品质更加安全、放心。现如今,在食品行业高速发展的过程中暴露出许多食品安全问题,严重威胁着公众的生命健康,如近年来曝光的三聚氰胺毒事件、苏丹东鸭蛋事件、皮革奶事件、地沟油事件及瘦肉精事件等,使得消费者对我国的食品安全状况越来越没信心。

关键词：居民生活条件食品品质线上教学皮革奶瘦肉精食品行业三聚氰胺食品安全状况

大学生专业课自主学习与课程思政融合探索——以微生物学课程为例

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中国教育技术装备 2022年第5期 104-105,108页

作者：张鸿雁王芸卢冬梅祁红兵冯瑜菲李敏岭南师范学院生命科学与技术学院 524048

随着全民学习时代的到来,自主学习能力已经成为一个人终身发展的基础,而培养学生学会学习成为重要的教育目标。课程思政是将课程与思想政治教育结合起来,以立德树人为教育的根本任务的教育理念。通过分析高校大学生自主学习与课程思政... 详细信息

随着全民学习时代的到来,自主学习能力已经成为一个人终身发展的基础,而培养学生学会学习成为重要的教育目标。课程思政是将课程与思想政治教育结合起来,以立德树人为教育的根本任务的教育理念。通过分析高校大学生自主学习与课程思政结合的特点及在微生物学课程中融入思政教育的案例,研究大学专业课中进行课程思政的方法和策略。

关键词：大学生专业课微生物学自主学习课程思政

大学生专业课自主学习与课程思政融合探索——以微生物学课程为例

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中国教育技术装备 2023年

作者：张鸿雁王芸卢冬梅祁红兵冯瑜菲李敏岭南师范学院生命科学与技术学院

随着全民学习时代的到来，自主学习能力已经成为一个人终身发展的基础，而培养学生学会学习成为重要的教育目标。课程思政是将课程与思想政治教育结合起来，以立德树人为教育的根本任务的教育理念。通过分析高校大学生自主学习与课程思... 详细信息

随着全民学习时代的到来，自主学习能力已经成为一个人终身发展的基础，而培养学生学会学习成为重要的教育目标。课程思政是将课程与思想政治教育结合起来，以立德树人为教育的根本任务的教育理念。通过分析高校大学生自主学习与课程思政结合的特点及在微生物学课程中融入思政教育的案例，研究大学专业课中进行课程思政的方法和策略。

关键词：大学生微生物学自主学习课程思政

大肠杆菌F_5菌毛胶体金免疫层析检测方法的建立

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中国兽医科学 2010年第11期40卷 1166-1170页

作者：杨旭东刘文鑫冯瑜菲胡文霞师东方东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立一种特异、稳定、敏感的检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析方法,用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗F5菌毛单克隆抗体,并喷涂在结合垫上;将纯化的兔抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上,分... 详细信息

为建立一种特异、稳定、敏感的检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析方法,用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗F5菌毛单克隆抗体,并喷涂在结合垫上;将纯化的兔抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线;组装试纸条,进行敏感性、特异性、稳定性、重复性试验,并对模拟样品和临床样品进行初步检测。结果显示,对F5菌毛蛋白的最小检出量为38.2μg/mL;与大肠杆菌F4、F6、F41和F18ab菌毛无交叉反应;4℃条件下密封保存120d后仍能有效检出样品;批内、批间检测F5菌毛蛋白的结果没有差别且检测线清晰,具有良好的重复性;对14份临床样品检测的结果与间接夹心ELISA、平板凝集试验、PCR的符合率为100%。

关键词：胶体金免疫层析产肠毒素大肠杆菌 F5菌毛

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蓝舌病病毒反向遗传操作系统的建立

中国预防兽医学报 2014年第2期36卷 85-89页

作者：杨涛徐青元孙恩成冯瑜菲李俊平孙亮孙晶吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立蓝舌病病毒(BTV)的反向遗传操作系统,本研究构建了分别表达血清1型BTV SZ97/1株VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、NS1和NS2蛋白的7个真核表达质粒,同时又构建了含有SZ97/1株BTV的全部10个基因节段的T7聚合酶体外转录重组质粒。并利用T7 ... 详细信息

为建立蓝舌病病毒(BTV)的反向遗传操作系统,本研究构建了分别表达血清1型BTV SZ97/1株VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、NS1和NS2蛋白的7个真核表达质粒,同时又构建了含有SZ97/1株BTV的全部10个基因节段的T7聚合酶体外转录重组质粒。并利用T7 RNA聚合酶对酶切线性化的10个体外转录质粒进行体外转录,制备BTV全部10个基因的体外转录RNA。将已构建的7个真核表达质粒和体外转录获得的RNA产物依次共转染BHK-21细胞,拯救出含有分子标记的BTV。本研究首次在我国建立了BTV的反向遗传操作系统,为我国深入开展该病毒致病机理、传播机制、基因组功能的研究以及新型疫苗的研发奠定了基础。

关键词：蓝舌病蓝舌病病毒反向遗传学