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作者：冯法节福建农林大学

学位级别：硕士

地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.),玄参科多年生草本植物,栽培历史悠久,是我国著名的道地药材“四大怀药”之一。但地黄生产中存在着严重的连作障碍问题,同一块地种植地黄之后需80年方可再种,严重制约了地黄生产和土地资源的可持续... 详细信息

地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.),玄参科多年生草本植物,栽培历史悠久,是我国著名的道地药材“四大怀药”之一。但地黄生产中存在着严重的连作障碍问题,同一块地种植地黄之后需80年方可再种,严重制约了地黄生产和土地资源的可持续利用。目前,对于地黄连作障碍产生原因的研究主要集中于土壤微生物、根系分泌物的自毒作用及其生态生理响应等方面,而其形成的分子机理尚不清楚。本研究以“温85-5”地黄品种为供试材料,连作(连续种植2年,SP)为处理、头茬(种植1年,FP)为对照,分别在地黄不同生育时期(苗期、拉线期、块根膨大前期、块根膨大中期、成熟期)获取根部和叶部样品,利用新一代Illumina测序技术,分别构建上述10个根、叶样品(包括连作和头茬)转录组文库,并与之前课题组所获转录组进行整合;同时,利用升级版数字化基因表达谱(RNA-Seq)技术,建立连作/头茬不同生育时期地黄根部的数字化基因表达差异谱,筛选连作障碍形成进程中的关键响应基因,解析地黄连作毒害发生、发展进程中可能的“毒害”事件。主要研究结果如下:1.利用Illumina技术分别对头茬和连作地黄根(R)和叶(L)的样品进行测序,每个样品均获得超过12,000万个的raw reads,组装后分别获取71,922个Unigene和130,655个Contigs、54,722个Unigene和102,253个Contigs,将其与课题组之前所获转录组进行整合组装后共获得66,960个Unigene。对上述Unigene与Swissprot、Nr蛋白库等相关数据库进行同源性比较表明:在Nr数据库中,有46,147条序列和其它物种的已知功能基因有一定程度的同源性;有30,947条序列在Swissprot数据库中用于注释;COG分类显示,18,029条序列具有功能注释;GO分类显示,34,912条序列具有分子功能;KEGG分析显示,27,532条序列参与了119个谢路途径。在地黄基因组未知的情况下,本研究建立和整合了课题组所有地黄遗传信息序列,为揭示地黄响应连作障碍的分子机理奠定了技术和信息基础。2.筛选不同生育时期关键连作响应基因:分别构建连作和头茬地黄在苗期、拉线期、块根膨大前期、块根膨大中期和成熟期这5个生育时期根部升级版数字化基因表达谱,不同文库均获得超过6M raw reads。以头茬地黄为对照,连作地黄为处理,分析不同生育时期,响应连作危害的基因。结果表明:在苗期连作和头茬地黄间(SP1/FP1)筛选了 7,653个差异表达的基因;拉线期筛选了 602个差异表达基因;块根膨大前期筛选到2,092个差异表达基因;块根膨大中期筛选到3,676个差异表达基因;成熟期筛选到8,435个差异表达基因。对5个时期关键连作响应基因的功能分析表明:苗期连作地黄的染色质修复机制被抑制、细胞分裂关键进程被阻断、植物生长发育相关进程被完全打破;拉线期的激素代谢进程紊乱、水杨酸相关基因被显著上调、根系生长开始受到抑制;块根膨大前期连作地黄对光的感知能力受到影响;膨大中期水杨酸信号通路在连作地黄中被极其显著上调;成熟期连作地黄地上部分基本死亡、部分块根重新发育成幼苗。综上可知,苗期已经开始感知了连作毒害、并随着发育进程的推进危害逐渐加剧。3.连作和头茬地黄发育模式差异的研究。分别以头茬和连作地黄的苗期作为对照、以拉线期、块根膨大前期、块根膨大中期和成熟期作为处理。分析连作和头茬地黄发育模式的差异。结果表明:在头茬地黄中,拉线期、块根膨大前期、块根膨大中期、成熟期与苗期相比分别获得4,405、3,973、3,968、8,192个差异基因。在连作地黄中,分别获得7,822、8,597、8,794、12,040个差异基因。分别对连作和头茬地黄发育过程中关键差异基因进行功能分析,结果表明:在头茬地黄的发育过程中,大量与细胞周期调控、蛋白合成和发育密切相关的基因随着发育进程的推进,在协调有序地进行表达;而重茬地黄中大量发育代谢相关基因的秩序被完全打乱,与染色质修饰相关的基因在连作地黄中被显著上调表达,表明地黄在受到连作危害过程中,大量的基因被关闭或者被开启。在地黄遗传信息匮乏的情况下,本研究利用新一代测序技术(Solexa/Illumina sequencing),构建了地黄及其根、叶转录组文库,建立了连作地黄数字化功能基因差异谱,筛选了响应地黄连作障碍的关健基因。研究结果表明:连作毒害通过抑制染色质修复机制扰乱了连作地黄体内正常基因的表达秩序;导致细胞周期循环进程被关闭、代谢受阻、光响应被抑制;同时,通过诱导连作地黄体内激素代谢紊乱,来促进水杨酸等衰老激素相关基因大幅表达。本研究初步分析了连作地黄“毒害”的作用机理,为深入研究地黄连作障碍成因、解读连作障碍的分子机理,开发消减连作危害

关键词：地黄连作障碍 Illumina测序转录组数字化基因表达谱关键响应基因

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地黄扩展蛋白基因RgEXPA10的克隆与表达分析

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药学学报 2015年第2期50卷 233-240页

作者：王丰青周艳黄勇李明杰田云鹤冯法节陈新建张重义河南农业大学农学院河南郑州450002 福建农林大学中药材GAP研究所福建福州350002

以地黄(Rehmannia glutinosa)叶片c DNA为模板,克隆地黄扩展蛋白基因,获得一条972 bp的c DNA序列,包含了762 bp的开放阅读框(ORF),命名为Rg EXPA10,Gen Bank登录号为KF011918,编码253个氨基酸。以基因组DNA为模板,扩增出一条1 207 bp的... 详细信息

以地黄(Rehmannia glutinosa)叶片c DNA为模板,克隆地黄扩展蛋白基因,获得一条972 bp的c DNA序列,包含了762 bp的开放阅读框(ORF),命名为Rg EXPA10,Gen Bank登录号为KF011918,编码253个氨基酸。以基因组DNA为模板,扩增出一条1 207 bp的序列,测序结果显示包含3个外显子和2个内含子,Gen Bank登录号为KF011919。应用生物信息学方法分析其氨基酸序列结构特征,结果显示,Rg EXPA10包含DPBB_1和Pollen_allerg_1结构域,有26氨基酸的核定位序列和19氨基酸的跨膜结构域。进化分析发现在拟南芥26个α扩展蛋白中,Rg EXPA10与At EXPA8的同源性最高。在22个植物的同源蛋白中,地黄Rg EXPA10与番茄扩展蛋白的亲缘关系最近。以实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测Rg EXPA10基因的表达量,发现Rg EXPA10在地黄未展开的幼嫩叶片里表达最强,其次为膨大中的块根,在衰老的叶片中表达最弱。出苗后60和90天时,在地黄块根中的表达较强。在连作、盐和渍水3种逆境胁迫下,地黄叶片内Rg EXPA10的表达量均显著降低。为研究Rg EXPA10在地黄发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。

关键词：地黄扩展蛋白克隆表达分析

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地黄根系分泌物化感效应与酚酸类物质的关系研究

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中药材 2015年第4期38卷 659-663页

作者：张宝李烜桢冯法节古力张君毅张留记张重义福建农林大学福建福州350002 河南农业大学河南郑州450002 华侨大学福建厦门362021 河南省中医药研究院河南郑州450004

目的：通过研究不同生育时期地黄根系分泌物化感潜力和酚酸类物质含量动态变化,揭示酚酸类物质与地黄化感效应之间的关系。方法：利用新型根系分泌物收集装置,收集地黄不同生育时期根系分泌物,采用HPLC分析5种酚酸（香豆酸、对羟基苯甲... 详细信息

目的：通过研究不同生育时期地黄根系分泌物化感潜力和酚酸类物质含量动态变化,揭示酚酸类物质与地黄化感效应之间的关系。方法：利用新型根系分泌物收集装置,收集地黄不同生育时期根系分泌物,采用HPLC分析5种酚酸（香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸）含量变化并通过生物测试（萝卜种子发芽试验）评价其化感潜力,分析根系分泌物化感效应与5种酚酸含量的相关性。结果：地黄不同生育时期根系分泌物浸种后萝卜种子发芽率为97.89%、92.38%、89.52%、85.71%、85.71%、84.76%和83.81%,随生育期推进呈逐渐降低趋势,其中从块根膨大前期开始与对照表现出显著差异;芽长为5.68、5.76、5.91、5.65、5.41、5.28和5.11 cm,呈先升高后降低的趋势,同样从块根膨大前期开始与对照相比差异达到显著水平。HPLC检测地黄不同生育时期根系分泌物均发现了5种酚酸,但其含量未呈现与根系分泌物化感作用相似的变化规律,对两者相关性分析发现,除丁香酸与发芽长度呈显著负相关外（r=-0.833,P〈0.05）,其他酚酸含量均未与萝卜种子发芽率和芽长表现出显著相关性（r=-0.666-0.590）。结论：地黄于块根膨大前期开始表现出显著化感作用,且化感作用随生育期的推进逐渐增强。丁香酸可能是引起地黄化感效应的主导物质。

关键词：地黄根系分泌物化感作用酚酸

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地黄钙信号体系相关基因的鉴定及其在连作条件下响应特征分析

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药学学报 2017年第12期52卷 1951-1961页

作者：杨楚韵李鑫宇李明杰冯法节古力张宝陈淑强陈爱国张重义福建农林大学作物科学学院福建福州350002 河南农业大学农学院河南郑州450002 福建农林大学福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室福建福州350002

钙信号是植物响应胁迫的重要系统之一,前期研究发现钙信号参与了连作地黄感知、传导和响应连作胁迫的进程。为了确证钙信号在地黄连作障碍形成过程中的作用方式,本研究在前期地黄大容量转录组基础上,利用生物信息学方法详细鉴定地黄钙... 详细信息

钙信号是植物响应胁迫的重要系统之一,前期研究发现钙信号参与了连作地黄感知、传导和响应连作胁迫的进程。为了确证钙信号在地黄连作障碍形成过程中的作用方式,本研究在前期地黄大容量转录组基础上,利用生物信息学方法详细鉴定地黄钙信号转导体系相关蛋白的编码基因,并对其在连作和头茬地黄中的表达模式进行分析。同时,采用焦锑酸盐法和钙荧光染色法测定连作和头茬地黄根细胞中钙离子浓度差异。鉴定出5个CaMs、12个CBLs、21个CDPKs、21个CIPKs、16个CMLs和9个CRKs等84个钙信号体系相关基因。通过对连作和头茬地黄钙信号体系相关基因差异表达模式进行分析,发现连作效应增强了地黄钙信号体系中关键基因的表达。进一步利用qRT-PCR方法对12个关键的钙信号转导相关基因进行表达验证,确证了钙信号响应了连作胁迫进程。此外,2种钙离子浓度检测方法也均证实连作胁迫显著促进了地黄胞内钙离子的积累。本研究从分子和细胞水平上确证了钙信号在地黄连作障碍形成中扮演着重要角色,为进一步从分子水平上解读地黄连作障碍的形成机制奠定了基础。

关键词：地黄连作障碍自毒作用钙信号体系钙离子浓度

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地黄植株体内miRNAs与其连作障碍关系的研究进展

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中国中药杂志 2017年第6期42卷 1104-1108页

作者：曹晓风杨艳会冯法节李明杰古力王丰青陈新建张重义福建农林大学福建福州350002 河南工业大学河南郑州450001 河南农业大学河南郑州450002

MicroRNAs是一类内源性小分子的非编码RNA,它通过对其靶基因的降解或抑制翻译来调控基因表达,进而调控植物的生理活动。植物在遇到逆境胁迫时,miRNAs会作用于与逆境相关的基因,启动体内的抗逆机制抵抗不利因素。地黄的连作障碍也是一种... 详细信息

MicroRNAs是一类内源性小分子的非编码RNA,它通过对其靶基因的降解或抑制翻译来调控基因表达,进而调控植物的生理活动。植物在遇到逆境胁迫时,miRNAs会作用于与逆境相关的基因,启动体内的抗逆机制抵抗不利因素。地黄的连作障碍也是一种胁迫,从miRNAs水平上研究,有利于解读地黄连作障碍的分子机制。该文对地黄体内miRNAs的功能及调控机制进行了综述,并对miRNAs在地黄的研究中进行了展望。

关键词：地黄 miRNAs 连作障碍胁迫基因调控

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多元组学背景下地黄连作障碍形成的分子机制研究进展

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中国中药杂志 2017年第3期42卷 413-419页

作者：李明杰冯法节张宝古力王丰青杨艳会田云鹤陈新建张重义福建农林大学作物科学学院福建福州350002 福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室福建福州350002 河南农业大学河南郑州450002 河南工业大学生物工程学院河南郑州450001

连作障碍的研究虽然已经有多年的历史,但目前仍没有有效的治疗方法,其根本原因是其形成体系的复杂性。该文从连作植物根际土壤多元因子的互作关系入手,详细阐述了栽培植物连作障碍形成的生理生态机制,提出了栽培药用植物、自毒化感物质... 详细信息

连作障碍的研究虽然已经有多年的历史,但目前仍没有有效的治疗方法,其根本原因是其形成体系的复杂性。该文从连作植物根际土壤多元因子的互作关系入手,详细阐述了栽培植物连作障碍形成的生理生态机制,提出了栽培药用植物、自毒化感物质和根际微生物间复杂的多元互作是驱动连作障碍形成的根本原因,指出了植物功能基因组学和代谢组学以及微生物宏组学相结合的多元组学技术在深入理解特定生境多因子互作关系研究中的优势。同时,该文以地黄为例,从根际化感自毒物质累积效应、根际微生态的灾变及连作植株的分子响应等多元角度综述了地黄连作障碍形成的分子机制,并详细总结了多元组学技术在这些机制研究中的运用和进展。该文为从分子水平上系统地揭示栽培药用植物连作障碍形成的分子机制提供了新的思路。

关键词：地黄多元组学连作障碍分子机制栽培药用植物

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海南八所军话新、老派声调系统的循环演变

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中国语文 2024年第4期 458-464,511,512页

作者：冯法强海南师范大学文学院海口

八所军话新派和老派三个声调的调值发生对调,老派阴平、阳平、去声的调值分别变为新派去声、阴平、阳平的调值。分析发现八所新、老派调值的演变为推链式音变,并且首尾相接形成环式音变,演变的机制对平山久雄“声调调值变化环流说”既... 详细信息

八所军话新派和老派三个声调的调值发生对调,老派阴平、阳平、去声的调值分别变为新派去声、阴平、阳平的调值。分析发现八所新、老派调值的演变为推链式音变,并且首尾相接形成环式音变,演变的机制对平山久雄“声调调值变化环流说”既有支撑又有补充。

关键词：循环演变推链拉链连读变调

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不同来源地黄化感物质对土壤微生物功能多样性的影响

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广东农业科学 2014年第10期41卷 48-50,54页

作者：李晶晶李烜桢张宝冯法节曹晓风李振方张重义福建农林大学生命科学学院福建福州350002 福建农林大学中药材GAP研究所福建福州350002 河南农业大学中药材研究所河南郑州450002 福建农林大学作物科学学院福建福州350002

地黄连作障碍严重制约了地黄的产量和品质,化感自毒作用是植物连作障碍形成的重要原因之一,研究地黄化感物质的来源(根、叶、根系分泌物)显得尤为重要。通过在土壤中添加地黄化感物质的不同载体(根、叶、根系分泌物),对一段时期内土壤... 详细信息

地黄连作障碍严重制约了地黄的产量和品质,化感自毒作用是植物连作障碍形成的重要原因之一,研究地黄化感物质的来源(根、叶、根系分泌物)显得尤为重要。通过在土壤中添加地黄化感物质的不同载体(根、叶、根系分泌物),对一段时期内土壤微生物功能多样性发生的变化进行分析,基于BIOLOG平板法分析不同时期各个处理以酚酸类物质为碳源及以其他碳源为底物的微生物生长情况,研究化感物质的主要来源。结果表明:处理1 d,根处理最有利于以多聚物、氨基酸、糖类、胺类、羧酸为碳源的微生物生长,叶处理最有利于以酚酸为碳源的微生物生长,根系分泌物处理微生物生长情况仅好于对照。处理30、60、90、180 d,根处理最有利于以酚酸为碳源的微生物生长,叶处理最有利于以多聚物、氨基酸为碳源的微生物生长,根系分泌物处理微生物多样性最差,不利于以各类碳源为底物的微生物生长。

关键词：地黄化感物质土壤微生物功能多样性 BIOLOG

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地黄EST-SSR标记的开发及扩增体系的建立

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广东农业科学 2015年第10期42卷 120-126页

作者：冯法节李明杰古力张宝何华勤杨艳会陈新建张重义福建农林大学中药材GAP研究所福建福州350002 河南工业大学中药材研究所河南郑州450000 河南农业大学生命科学学院河南郑州450002

在转录组基础上批量开发地黄特异EST-SSR标记序列,同时通过优化DNA模板浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度,结合正交优化试验建立地黄EST-SSR的PCR最佳扩增体系,为进一步鉴定和开发地黄多态性SSR提供重要的基础资料。结果表明:在地黄8... 详细信息

在转录组基础上批量开发地黄特异EST-SSR标记序列,同时通过优化DNA模板浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度,结合正交优化试验建立地黄EST-SSR的PCR最佳扩增体系,为进一步鉴定和开发地黄多态性SSR提供重要的基础资料。结果表明:在地黄87665条转录本序列中,共筛选了1812条不小于18bp的SSR序列,其中二核苷酸数量最多,共有721个(70.8%),其次为三核苷酸和六核苷酸,分别有486、578个。而在所有SSR类型中AG/CT(457个)为最多的重复类型,其次为AC/GT(256个)。EST-SSR体系优化结果表明:最佳反应体系为15μL体系中含80ng模板DNA、0.1μmol/L引物、150μmol/Ld NTPs和1.5U TaqDNA聚合酶,在退火温度55℃进行30个循环。

关键词：地黄 EST-SSR 扩增体系品种选育

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氯吡格雷与阿司匹林联用治疗急性心梗的疗效和安全性研究

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中文科技期刊数据库（引文版）医药卫生 2024年第10期 0131-0134页

作者：冯迎节河北省廊坊市安次区医院内一科河北廊坊065000

联用阿司匹林、氯吡格雷在急性心梗中的疗效。方法纳入60心梗患者(2020年1月~2023年1月)随机分组,分别以联合治疗、基础治疗干预,分析心功能、血小板水平、不良反应、治疗效果。结果研究组LVEF(66.29±4.74%)、心排血量(4.84±0.75L/m... 详细信息

联用阿司匹林、氯吡格雷在急性心梗中的疗效。方法纳入60心梗患者(2020年1月~2023年1月)随机分组,分别以联合治疗、基础治疗干预,分析心功能、血小板水平、不良反应、治疗效果。结果研究组LVEF(66.29±4.74%)、心排血量(4.84±0.75L/min)高于对照组LVEF(56.86±3.97%)、心排血量(4.09±0.68L/min),P<0.05。研究组LVESd(35.26±5.12mm)、LVEDd(41.36±3.54mm)低于对照组LVESd(40.26±4.65mm)、LVEDd(48.72±3.29mm),P<0.05。研究组血浆hs-CRP(4.52±0.37mg/L)、血小板聚集(12.86±5.55%)低于对照组血浆hs-CRP(8.54±0.52mg/L)、血小板聚集(30.35±5.19%),P<0.05。研究组不良反应3.33%少X2值=6.4052,P<0.05。研究组治疗效果100.00%高,X2值=5.4545,P<0.05。结论以阿司匹林、氯吡格雷治疗急性心梗效果显著,能改善患者心功能,以及血小板功能,值得借鉴。

关键词：急性心梗氯吡格雷阿司匹林心功能安全性应用效果

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