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D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的半理性设计及突变研究

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D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的半理性设计及突变研究

作者：冯哲齐鲁工业大学

学位级别：硕士

D-阿洛酮糖（D-allulose）是一种天然稀有糖,其甜度是蔗糖的70%,具有高溶解度和抗氧化活性,抗炎、抗氧化、调节胆固醇水平和改善胰岛素敏感性。但D-阿洛酮糖较为稀有,无法大规模提取应用,因此低成本的D-阿洛酮糖合成策略是其工业化的关... 详细信息

D-阿洛酮糖（D-allulose）是一种天然稀有糖,其甜度是蔗糖的70%,具有高溶解度和抗氧化活性,抗炎、抗氧化、调节胆固醇水平和改善胰岛素敏感性。但D-阿洛酮糖较为稀有,无法大规模提取应用,因此低成本的D-阿洛酮糖合成策略是其工业化的关键。近年来,利用Izumoring策略以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖已经成为一种替代化学合成的更加高效的办法。但由于D-阿洛酮糖的生物转化受到D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPEase）的转化率和酶本身产量的限制,使工业生产成本仍较为高昂。本研究首先通过对关键位点进行半理性设计和定点饱和突变,筛选获得了转化率更高,高温条件下稳定性更好的突变体。其后采用诱变育种的手段提高了工程菌株的酶表达量,最终利用多种纯化方式和气相扩散法制得了符合晶体学结构解析的初筛样本,为进一步探索转化率与空间结构变化之间的关系奠定了基础。主要结果如下:（1）DPEase半理性设计和筛选:通过对关键位点进行迭代饱和突变,构建了饱和突变库。对突变菌株摇瓶发酵后,以转化率作为关键指标采用全细胞催化的方式进行初步筛选。在构建的36种突变酶中,获得转化率明显优于原始酶的迭代突变酶213G/214D,其最适反应温度为65℃,较原始酶上升了5℃,70℃下孵育180min后的残余酶活为原始酶的4.6倍,Mn、Co能提高突变酶213G/214D转化率,分别提高了2.1%和2.3%,最优条件下突变酶213G/214D转化率最高可达39.1%,较原始酶转化率提升5.8%。分子动力学模拟分析发现,突变酶213G/214D在300K-500 K变温下的RMSD值明显降低,由原始酶的0.43降为0.35。在333K温度下,突变酶213G/214D关键氨基酸E150和E244的羰基氧原子距离底物C3原子的平均距离分别为0.36nm和0.43nm,远小于原始酶的0.52nm和0.59nm,这可能是突变酶转化率提升的原因之一。（2）突变酶213G/214D高效表达工程菌的选育:通过柔性肽将突变酶和绿色荧光蛋白偶联,构建了荧光强度与突变酶213G/214D表达量正相关的筛选用菌株。用紫外诱变的方式构建了突变库后,使用流式细胞仪高通量筛选出荧光强度显著升高的菌株180株。结果显示,未诱变对照96孔板的平均荧光强度为6.66*10～6,而经过筛选后的诱变菌平均荧光强度为1.45*10～7,荧光强度最高达到1.92*10～8。采用摇瓶发酵对荧光强度高的菌株进行复筛后,最终通过质粒消除,成功构建出了能够进行能够更高水平表达突变酶213G/214D的空白工程菌株E.coli/2E6。重新转化不含荧光蛋白的原始突变体质粒pET-20b-GD后,酶活测定显示,突变菌株酶活达到了7120U/m L,较原始菌株提高了0.78倍。（3）突变酶213G/214D结晶条件的优化:使用高压均质和Ni柱亲和层析,大量制备初步纯化酶液后,使用超滤管进行浓缩样品和buffer置换,交替使用分子筛层析和阴离子亲和层析制得了符合晶体学样品制备所需纯度的酶液。使用气相扩散法中的坐滴法和悬滴法,经96种结晶条件筛选和优化后,制得符合晶体学结构解析的初筛样品。初筛结果显示213G/214D突变酶的结晶条件为17%（w/v）聚乙二醇,0.1 M咪唑（p H 8.0）,0.25 M醋酸钙,214G/214D突变酶与底物复合体的结晶条件为14-15%（w/v）聚乙二醇、0.1M咪唑（p H 8.0）、0.2M醋酸钙,为突变酶213G/214D的晶体结构衍射分析奠定基础。

关键词： D-阿洛酮糖 D-阿洛酮糖3差向异构酶紫外诱变高通量筛选

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基于虚拟迭代的某牵引车车架疲劳耐久性分析

机械设计与制造 2024年

作者：田佳伟冯哲叶明松何水龙桂林电子科技大学机电工程学院东风柳州汽车有限公司

为高效评估用户里程内车辆疲劳耐久表现，以某6×4牵引车车架为研究对象，通过襄阳试验场强化道路采集车辆轮心六分力。在HyperMesh中建立包含主副油箱附件的车架有限元模型并校核其静强度，应用惯性释放理论获取其单位载荷下应力场分... 详细信息

为高效评估用户里程内车辆疲劳耐久表现，以某6×4牵引车车架为研究对象，通过襄阳试验场强化道路采集车辆轮心六分力。在HyperMesh中建立包含主副油箱附件的车架有限元模型并校核其静强度，应用惯性释放理论获取其单位载荷下应力场分布结果。建立整车刚柔耦合多体动力学模型并开展K&C试验进行模型校核，基于试验场六分力数据，利用Adams/car与Femfat-Lab联合仿真虚拟迭代得到悬架系统与车架连接处载荷谱。结合车架单位载荷应力场结果、车架疲劳载荷谱及车架材料ε-N疲劳曲线，根据Miner线性累积损伤理论，采用nCode软件对车架进行疲劳仿真分析。结果表明：该牵引车车架结构可以满足用户周期里程内的疲劳寿命要求，与试验场实车耐久试验结果一致。

关键词：六分力载荷谱多体动力学虚拟迭代疲劳耐久性

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保温板复合外墙整体浇筑成型施工技术

石材 2024年第6期 51-53页

作者：冯哲甘肃红鹭项目管理咨询有限公司甘肃白银730900

传统的外墙保温方式存在着施工周期长、工艺复杂等问题,而保温板复合外墙整体浇筑成型施工技术则解决了这些难题,成为未来建筑施工的重要方向。基于此,本文首先对该技术进行介绍,接着分析了其技术要点,希望能给该技术的实施提供一定参考。

关键词：保温板复合外墙整体浇筑成型技术分析

“三全育人”理念下开拓美育融入高校思想政治教育的新路径——以苏州科技大学为例

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办公室业务 2024年第4期 184-186页

作者：冯哲苏州科技大学

美育作为提升学生道德情操,涵养心灵教育的直接手段,是“三全育人”的重要组成部分。结合当前实际情况,应针对青年大学生特点,进一步厘清“三全育人”教育理念与美育工作的内在逻辑,探索新时代高校开展美育工作的有效途径,“以美育德、... 详细信息

美育作为提升学生道德情操,涵养心灵教育的直接手段,是“三全育人”的重要组成部分。结合当前实际情况,应针对青年大学生特点,进一步厘清“三全育人”教育理念与美育工作的内在逻辑,探索新时代高校开展美育工作的有效途径,“以美育德、以美培元”,不断开拓美育融入学生思想政治教育的育人新路径。

关键词：三全育人美育实施路径

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医院资源计划系统成本原子级数据治理及实践

中国数字医学 2024年第6期19卷 26-30页

作者：张琪王晓飞徐正明冯哲复旦大学附属华山医院信息中心上海200040

探讨面对医院成本管理复杂性高、难度大的挑战,如何借助医院资源计划(HRP)系统建立统一高效的成本管理体系。结合医院实践,通过构建面向成本管理的原子级数据治理体系和实践路径,逐步迭代优化HRP系统,最终实现对全院成本的精细化管理,... 详细信息

探讨面对医院成本管理复杂性高、难度大的挑战,如何借助医院资源计划(HRP)系统建立统一高效的成本管理体系。结合医院实践,通过构建面向成本管理的原子级数据治理体系和实践路径,逐步迭代优化HRP系统,最终实现对全院成本的精细化管理,辅助管理决策,为各医疗机构建立HRP系统提供相关技术参考和行业思考。

关键词：医院资源计划系统成本管理原子级数据治理

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宕垟里公园游客服务中心屋面桁架结构设计

中国科技期刊数据库工业A 2024年第7期 0001-0004页

作者：冯哲鸣华汇工程设计集团股份有限公司浙江绍兴312000

本项目位于温州市平阳县,为游客服务中心,高度为10.500米。结构采用MIDAS和Rhino软件对模型进行分析,同时采用MIDASFEANX对复杂关键节点进行有限元分析。本文介绍了屋面的结构体系选型,构件布置以及选型,整体模型和构件分析结果,节点有... 详细信息

本项目位于温州市平阳县,为游客服务中心,高度为10.500米。结构采用MIDAS和Rhino软件对模型进行分析,同时采用MIDASFEANX对复杂关键节点进行有限元分析。本文介绍了屋面的结构体系选型,构件布置以及选型,整体模型和构件分析结果,节点有限元分析结果。结果表明,对于大跨度的金属屋面,选择空间桁架结构形式,能有效提升结构刚度和稳定性,同时满足建筑使用功能要求。

关键词：大跨度桁架结构整体模型计算节点分析

农村幼儿园家园共育工作的现实困境与应对策略

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文教资料 2024年第1期 156-158,163页

作者：冯哲毓长沙师范学院学前教育学院湖南长沙410100

农村幼儿园开展家园共育工作是新时代农村学前教育质量提升的必然要求。本文针对农村幼儿园的家园共育工作容易陷入家园双方地位不等、教师职责模糊、教师能力不足的三大现实困境,探究出其产生的原因:农村幼儿教师与家长的家园共育观念... 详细信息

农村幼儿园开展家园共育工作是新时代农村学前教育质量提升的必然要求。本文针对农村幼儿园的家园共育工作容易陷入家园双方地位不等、教师职责模糊、教师能力不足的三大现实困境,探究出其产生的原因:农村幼儿教师与家长的家园共育观念有待更新、农村幼儿园家园共育工作制度未有效推进和农村幼儿教师培养培训体系不完善,并提出塑造双主体平等参与的协同观念、落实家园共育规范的工作制度、完善农村幼儿园教师家园共育能力提升的培训体系等应对策略,以期改进农村幼儿园家园共育工作。

关键词：农村幼儿园家园共育困境与对策

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基于CFD的某商用车扬尘污染仿真优化分析

机械设计与制造 2024年第6期400卷 177-181,186页

作者：肖飞田佳伟冯哲何水龙东风柳州汽车有限公司广西柳州544005 桂林电子科技大学机电工程学院广西桂林541004

针对某新型商用车在泥土路面低速行驶工况中,易扬起地面尘土造成局部空气污染问题。建立商用车CFD仿真分析模型,进行实验对标以验证仿真模型的精确性。将DPM离散相模型分析方法与离散动力学相结合,对商用车外流场中多相流进行数值仿真,... 详细信息

针对某新型商用车在泥土路面低速行驶工况中,易扬起地面尘土造成局部空气污染问题。建立商用车CFD仿真分析模型,进行实验对标以验证仿真模型的精确性。将DPM离散相模型分析方法与离散动力学相结合,对商用车外流场中多相流进行数值仿真,揭示了扬尘污染的产生机理。由此制定不同的扬尘治理方案,结合HyperStudy软件进行优化分析,寻求最佳扬尘治理方案,并开展实验验证。研究结果表明:通过优化风扇位置,更换“U型”护风罩并优化导风板尺寸的改进方案,扬尘颗粒数相较原车减少了44.67%,在保证散热性能的前提下,明显改善了扬尘污染现象。

关键词：扬尘污染 CFD仿真离散相模型流场控制多目标优化

四位一体模式个体标准化功能锻炼对股骨骨折患者肢体肿胀及功能独立性的影响分析

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基层医学论坛 2024年第14期28卷 29-32页

作者：冯哲云湖口县中医医院江西九江332500

目的探究在股骨骨折患者康复护理中应用四位一体模式个体标准化功能锻炼对患者肢体肿胀与功能独立性的影响。方法选取2020年1月—2022年1月湖口县中医医院骨伤科收治的76例股骨骨折患者作为研究对象,根据患者住院号单双数分为参照组与... 详细信息

目的探究在股骨骨折患者康复护理中应用四位一体模式个体标准化功能锻炼对患者肢体肿胀与功能独立性的影响。方法选取2020年1月—2022年1月湖口县中医医院骨伤科收治的76例股骨骨折患者作为研究对象,根据患者住院号单双数分为参照组与研究组,各38例。2组均实施常规护理干预,研究组予以四位一体模式的个体标准化功能锻炼,比较2组干预前后肢体肿胀程度、功能独立性量表(functional independence measure,FIM)评分和术后并发症发生率。结果干预后,研究组肢体肿胀程度小于参照组(P<0.05)。干预后,研究组FIM量表评分高于参照组(P<0.05)。研究组术后并发症发生率低于参照组(P<0.05)。结论在股骨骨折康复护理中应用四位一体模式的个体标准化功能锻炼可缓解患者肢体肿胀,提高其生活独立能力,降低并发症发生风险。

关键词：四位一体模式个体标准化功能锻炼股骨骨折肢体肿胀