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基于真核CMV启动子构建猪瘟病毒感染性cDNA克隆与病毒拯救

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中国预防兽医学报 2024年第6期46卷 561-567,607页

作者：关飞虎王静宋亚芬温立佳田野蒋颖杨承槐张辉张乾义石河子大学动物科技学院新疆石河子832000 中国兽医药品监察所北京100081 全国畜牧总站北京100125

为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切... 详细信息

为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切位点突变消失作为拯救病毒的遗传标记。将构建的质粒转染PK-15细胞培养后,收集细胞上清盲传3代后通过RT-PCR扩增蛋白编码基因,并经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。RT-PCR鉴定结果显示扩增到CSFV特异性基因;IFA结果显示接种病毒的细胞出现绿色荧光。表明病毒拯救成功,将其命名为BAC-rSM。将BAC-rSM株在PK-15细胞中连续传18代,将第18代病毒经RT-PCR扩增E2基因,并对遗传标记的位点经Afe I酶切和鉴定,分析BAC-rSM病毒的遗传稳定性,结果显示第18代BAC-rSM株遗传标记稳定存在,表明拯救的病毒具有遗传稳定性。将BAC-rSM和SM株病毒分别以MOI 1感染PK-15细胞,在感染后不同时间点收获病毒并测定病毒滴度,结果显示BAC-rSM和SM株生长动力学特征基本一致。对第18代BAC-rSM株与SM株进行全基因组序列比对分析,利用在线软件***/对Erns和E2蛋白二级结构预测,采用荧光定量PCR(qPCR)对BAC-rSM和SM株感染PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平。全基因测序比对分析结果显示,BAC-rSM株基因组共存在46个碱基突变,经预测其Erns和E2的突变导致各自的二级结构改变;qPCR检测结果显示,相对SM感染的PK-15细胞,BAC-rSM感染后8 h和24 h PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01)。本研究建立了一种简单、操作方便的CSFV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展CSFV的分子生物学、毒力决定因素、分子发病机制、疫苗开发和病毒与宿主相互作用的研究提供了新的技术方法。

关键词：猪瘟病毒 CMV启动子感染性克隆反向遗传操作系统

DDX1影响猪流行性腹泻病毒复制的机制研究

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中国畜牧兽医 2023年第4期50卷 1556-1566页

作者：霍明凯关飞虎邱润辉魏春燕于海涛朱嘉乐张辉石河子大学动物科技学院石河子832000 新疆生产建设兵团动物疾病防控重点实验室石河子832000 动物健康养殖国家国际联合研究中心石河子832000

【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX 1基因序列(登录号:X... 详细信息

【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX 1基因序列(登录号:XM_021087822.1),设计特异性引物PCR扩增DDX 1基因全长并连接至pMD19-T克隆载体,双酶切鉴定成功后连接至pcDNA3.1表达载体;连接产物转化后筛选阳性菌落;培养IPI-2I细胞,取传代2次的细胞铺于6孔板内进行后续试验,将阳性菌落的重组质粒转染至6孔板培养24 h后收集蛋白质,Western blotting检测DDX1转染效率;以感染复数(MOI)为1.0的PEDV感染已转染pcDNA3.1-DDX1或PBS(对照)的IPI-2I细胞,建立PEDV感染细胞模型,PEDV感染12 h后分别收集细胞总蛋白质和RNA;间接免疫荧光试验检测细胞水平上PEDV N蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测PEDV N基因mRNA表达水平,Western blotting检测PEDV N蛋白的表达水平;使用生物信息学软件预测DDX1蛋白的磷酸化位点;免疫沉淀试验检测PEDV感染IPI-2I细胞12 h后DDX1的磷酸化水平。【结果】PCR成功扩增得到大小为2223 bp的DDX 1目的基因条带。双酶切鉴定结果显示,成功构建pMD19-T-DDX1克隆载体和pcDNA3.1-DDX1真核表达载体。与PBS组相比,转染pcDNA3.1-DDX1的细胞DDX1蛋白表达水平极显著上升(P<0.01),表明DDX1转染成功。间接免疫荧光试验结果显示,与PBS组相比,PEDV感染组中出现大量绿色荧光信号,表明PEDV感染IPI-2I细胞模型构建成功;与PBS组相比,PEDV N蛋白的荧光信号明显减少,PEDV N基因mRNA表达水平及蛋白表达水平均极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析发现,DDX1蛋白具有多个磷酸化位点,其中包括17个丝氨酸、12个苏氨酸及6个酪氨酸。免疫沉淀试验结果显示,与未感染组相比,PEDV感染组中DDX1磷酸化水平极显著上升(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pcDNA3.1-DDX1真核表达载体,发现PEDV感染IPI-2I细胞12 h后,DDX1抑制了PEDV的复制,升高了磷酸化水平,说明DDX1在PEDV感染期间可能通过磷酸化抑制PEDV的复制。

关键词： DDX1 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 磷酸化

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基于布鲁氏菌Dps蛋白间接ELISA检测方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2022年第2期52卷 143-151页

作者：孙天浩关飞虎张倩李楠张博苗玉和王震陈创夫石河子大学动物科技学院新疆石河子832000 西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新中心新疆石河子832000 新疆农垦科学院新疆石河子832000 福建圣维生物科技有限公司福建南平353000

为建立一种布鲁氏菌病早期快速诊断的血清学方法,进一步加强对布鲁氏菌病的防控。对布鲁氏菌Dps蛋白进行生物信息学分析、原核表达,将纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立了布鲁氏菌病血清学间接ELISA检测方法并进行初步应用。结果显示,... 详细信息

为建立一种布鲁氏菌病早期快速诊断的血清学方法,进一步加强对布鲁氏菌病的防控。对布鲁氏菌Dps蛋白进行生物信息学分析、原核表达,将纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立了布鲁氏菌病血清学间接ELISA检测方法并进行初步应用。结果显示,当重组蛋白Dps包被量为0.25μg,5%脱脂奶粉溶液封闭1.5 h,用稀释度为1∶1000的一抗孵育1 h,稀释度为1∶5000的二抗孵育0.5 h,显色20 min时建立的间接ELISA方法条件最优,该方法的临界值D_(450)为0.694,与凝集试验的总符合率达到91.1%(82/90),同时具有较好的特异性和重复性。应用本方法对新疆伊犁地区2个羊场的308份血清进行检测,布鲁氏菌抗体阳性率为2.27%(7/308)。结果表明,本研究建立了特异性高、重复性好的血清学间接ELISA检测方法,为布鲁氏菌病的诊断和流行病学调查提供了参考。

关键词：布鲁氏菌 Dps蛋白原核表达间接ELISA

布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究

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中国畜牧兽医 2022年第5期49卷 1630-1640页

作者：邱润辉关飞虎王梓行郭嘉朱德馨张伟魏春燕霍明凯孙志华张辉石河子大学动物科技学院石河子832000 新疆生产建设兵团动物疾病防控重点实验室石河子832000 动物健康养殖国家国际联合研究中心石河子832000

【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合... 详细信息

【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1800 V电压、400Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】试验成功获得片段大小为522、539、1054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。

关键词：布鲁氏菌 BMCO基因缺失株生长曲线胞内生存

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一例鸭传染性浆膜炎的诊断与防治

河南农业 2016年第17期 91-92页

作者：关飞何晓玲祁华虎陈卓天津瑞普生物技术股份有限公司 300308 邯郸市峰矿区动物防疫监督站 056200

为了确诊某鸭群感染鸭疫里默氏杆菌病,通过临床症状、病理变化、细菌培养分离鉴定、生化试验及PCR,最终确诊该鸭群为鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合感染.通过对送检的4只鸭子肝脏与脑组织取样接种TSA(+5%胎牛血清+1%NAD)培养基,分离到鸭... 详细信息

为了确诊某鸭群感染鸭疫里默氏杆菌病,通过临床症状、病理变化、细菌培养分离鉴定、生化试验及PCR,最终确诊该鸭群为鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌混合感染.通过对送检的4只鸭子肝脏与脑组织取样接种TSA(+5%胎牛血清+1%NAD)培养基,分离到鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌.通过药敏试验,对大肠杆菌高敏药物有恩诺沙星,对鸭疫里默氏杆菌高敏药物有头孢噻呋钠和恩诺沙星.

关键词：鸭疫里默氏杆菌大肠杆菌药敏试验

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武装直升机仿真座舱系统设计与实现

武装直升机仿真座舱系统设计与实现

作者：石春虎南京理工大学

学位级别：硕士

武装直升机仿真座舱是武装直升机仿真训练系统的控制与信息中心。一方面,它实时地获取飞行员的各种操作和操纵信息;另一方面,它实时地将有关飞行信息、控制指令信息、故障信息及告警信息等通过航空仪表反映到飞行员面前。随着计算机图... 详细信息

武装直升机仿真座舱是武装直升机仿真训练系统的控制与信息中心。一方面,它实时地获取飞行员的各种操作和操纵信息;另一方面,它实时地将有关飞行信息、控制指令信息、故障信息及告警信息等通过航空仪表反映到飞行员面前。随着计算机图形学和计算机硬件的不断发展,基于虚拟仪表的半实物仿真座舱应用越来越多。本文以实际项目为依托,在明确了系统功能要求和性能要求的基础上,对仿真座舱系统进行了总体方案设计。采用具有真实操纵感的飞行/火控实物操纵装置配合图形仪表操作/显示的方法对武装直升机座舱环境进行仿真开发。系统中硬件操作设备的尺寸、形状、位置、基本功能均参照真实的座舱进行设计。通过专用的数据采集卡和自主设计的单片机电路板采集实物操纵装置中的传感器数据,由主控计算机对采集到的数据进行处理,通过网络驱动虚拟仪表实时动态显示。虚拟仪表程序采用面向对象的设计方法,利用GL Studio对仪表板和中央操纵台上的航空仪表进行模块化设计。采用GL Studio和Vega Prime相结合的方法解决了虚拟多功能显示器中叠加观瞄视频图像的难题,并且在此基础上开发了模拟攻击模块。经过调试,开发出的半实物仿真座舱系统人机界面友好、操作流畅,满足逼真性和实时性的要求。系统通用性和可扩展性强,不仅可用于飞行/火控仿真训练,也可用于并列式座舱直升机武器火控系统验证评估和作战使用研究。

关键词：武装直升机计算机辅助训练半实物座舱数据采集处理虚拟仪表网络套接字视频图像

同方学位论文库评论

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飞灰重金属浸出特性及其植物修复研究

飞灰重金属浸出特性及其植物修复研究

作者：马海虎浙江大学

学位级别：硕士

垃圾焚烧后的飞灰中含有一定量的Pb、Cd、Cr、Cu、Zn、Hg、Ni等重金属,这些重金属离子在自然环境中的驻留时间长,不为微生物降解,却可在人及动物体内累积,并能转化为毒性很强的重金属化合物而引发各种直接或间接疾病。利用超累积植物对... 详细信息

垃圾焚烧后的飞灰中含有一定量的Pb、Cd、Cr、Cu、Zn、Hg、Ni等重金属,这些重金属离子在自然环境中的驻留时间长,不为微生物降解,却可在人及动物体内累积,并能转化为毒性很强的重金属化合物而引发各种直接或间接疾病。利用超累积植物对重金属污染环境进行修复,分离、提取超累积植物体内的重金属,达到重金属的资源化利用的目的,能实现环境效益与经济效益的统一。本文以采自温州临江垃圾发电厂、温州市永强垃圾发电厂的飞灰为材料,研究了重金属在蒸馏水、河水、海水和模拟酸雨等四种液体中的静、动态浸出特性;通过植物和对应土壤样品的重金属含量分析,筛选出具有较强累积重金属能力的植物;利用筛选出的植物进行飞灰重金属的模拟修复,并对植物体内的重金属进行资源化利用研究,主要结果如下：1在研究飞灰重金属含量组成及静态浸出特性的基础上,重点研究了飞灰重金属在模拟酸雨、海水、河水和蒸馏水中的动态浸出特性。其研究结果与现实飞灰渗滤液中重金属的渗滤特性规律更加相似,可为解决有关飞灰重金属渗滤所引起的二次污染问题提供更为理想的方法措施和理论依据。2研究了包含香樟、羊蹄甲、雪松、白兰花、榕树和垂柳等数十种植物对飞灰浸出液中重金属的累积能力及生物修复作用。结果表明以上6种植物均具有较强的综合累积飞灰重金属的能力,能为飞灰重金属污染的修复提供新的可用生物资源和方法。3开展了利用香樟、羊蹄甲和榕树等生物修复飞灰浸出液中的Cu、Cd、Pb和Zn等重金属的研究,并且初步探讨了累积于植物体内的飞灰重金属收获、提取及资源化的方法。提出了在焚烧的基础上,利用" NH4Cl—NH3—H2O体系”浸出法回收植物体吸收的Cu、Cd、Pb和Zn四种金属元素,结果表明本法具有较高的回收率,能较好地回收植物中的金属。

关键词：飞灰重金属植物修复累积