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CRISPR/Cas9技术敲除RAW264.7细胞的GPR43基因抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能

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细胞与分子免疫学杂志 2020年第6期36卷 481-486页

作者：徐方明苏丛伍婷陈昊然张鹏飞刘艳艳兰燕虎李家斌安徽医科大学第一附属医院感染病科安徽合肥230000 安徽医科大学附属巢湖医院感染病科安徽巢湖238000 安徽省细菌耐药性监控中心安徽合肥230000 安徽医科大学细菌耐药研究所安徽合肥230000

目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sg... 详细信息

目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sgRNA插入pLenticrisprV2质粒中,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pLenticrisprV2;将病毒感染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序GPR43基因相关序列并与野生型GPR43基因进行比对,确认敲除成功的细胞株(GPR43^-/-RAW264.7细胞),Western blot法检测GPR43蛋白水平。肺炎克雷伯菌感染GPR43^-/-RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测细菌感染后细胞内白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的变化,并观察敲除GPR43后,RAW264.7细胞吞噬能力的变化。结果挑选的单克隆细胞经Western blot验证GPR43蛋白不表达,并且DNA测序结果显示在sgRNA插入位置缺失34个碱基,证明成功敲除GPR43基因。GPR43^-/-RAW264.7细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均低于对照组,且GPR43^-/-RAW264.7细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力降低。结论CRISPR/Cas9技术敲除GPR43基因,抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能及炎性细胞因子的产生。

关键词： RAW264.7细胞成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9) G蛋白偶联受体43(GPR43) 肺炎克雷伯

Nod2基因在肺炎克雷伯菌肝脓肿中的作用研究

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安徽医科大学学报 2022年第9期57卷 1380-1384页

作者：孟宝伍婷苏丛孙雅婷唐明洋郭明娟兰燕虎李家斌安徽医科大学第一附属医院感染病科合肥230022 安徽医科大学第一附属医院感染管理科合肥230022 安徽省细菌耐药性监控中心合肥230022 安徽医科大学细菌耐药研究所合肥230022 安徽医科大学附属巢湖医院感染病科巢湖238000

目的建立肺炎克雷伯菌(***)感染Nod2基因肝组织条件敲除小鼠模型,初步探究Nod2基因在***感染引起肝脓肿过程中的作用及机制。方法将引进的Nod2^(flox/+)小鼠自交获得Nod2^(flox/flox)小鼠,同时将Alb-Cre^(+)小鼠与Nod2^(flox/+)进行杂... 详细信息

目的建立肺炎克雷伯菌(***)感染Nod2基因肝组织条件敲除小鼠模型,初步探究Nod2基因在***感染引起肝脓肿过程中的作用及机制。方法将引进的Nod2^(flox/+)小鼠自交获得Nod2^(flox/flox)小鼠,同时将Alb-Cre^(+)小鼠与Nod2^(flox/+)进行杂交获得Nod2^(flox/+);Alb-Cre^(+)的子代小鼠;将上述两种基因型的子代小鼠进行杂交,获得Nod2基因肝脏条件性敲除小鼠(Nod2^(flox/flox);Alb-Cre^(+))和同窝阴性对照组小鼠(Nod2^(flox/flox))。提取小鼠脚趾基因组DNA,经PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定子代小鼠基因型并提取小鼠肝脏,利用RT-qPCR和Western blot验证Nod2基因在肝脏中的敲除效果。实验组和对照组小鼠分别感染***,观察不同时间点小鼠生存率及肝组织病理变化;利用RT-qPCR检测实验组和对照组小鼠感染*** 48 h后肝组织内肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和趋化因子CXC配体1(CXCL1)的mRNA的表达水平。结果Nod2^(flox/flox);Alb-Cre^(+)小鼠肝脏NOD2 mRNA表达量降低(P<0.05),Western blot结果显示NOD2蛋白表达量降低;与对照组小鼠比较,实验组小鼠在感染***后生存率降低(中位生存时间60.5 h,P=0.0469),肝组织出现了更为严重的病理损伤;实验组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β和CXCL1的mRNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NOD2在***感染诱导肝脓肿的过程中起保护作用。

关键词：肺炎克雷伯菌肝脓肿 Nod2基因炎症反应保护作用

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基于CRISPR-Cas9技术构建gpr41基因敲除的RAW264.7细胞系

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安徽医科大学学报 2020年第5期55卷 800-803页

作者：苏丛徐方明伍婷张鹏飞陈昊然刘艳艳兰燕虎李家斌律娜安徽医科大学附属巢湖医院感染病科巢湖238000 安徽医科大学第一附属医院感染病科合肥230022 安徽省细菌耐药性监控中心合肥230022 安徽医科大学细菌耐药研究所合肥230022

采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质... 详细信息

采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质粒转化DH5α感受态细胞,筛选出重组子测序验证gRNA的有效性。鉴定成功的pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒采用转染试剂转染巨噬细胞系RAW264.7。筛选阳性单克隆细胞株,Western blot检测gpr41基因的表达。测序结果证实pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒构建成功;Western blot筛选出重组质粒pLenticrisprV2-gpr41-gRNA3转染RAW264.7细胞13号单克隆株的GPR41蛋白不表达。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了gpr41基因敲除的巨噬细胞株,为研究gpr41基因在RAW264.7细胞中的作用机制奠定基础。

关键词： CRISPR-Cas9技术 gpr41 巨噬细胞基因敲除

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肠道菌群参与细菌性肺炎的免疫调控研究进展

中华传染病杂志 2022年第3期40卷 181-184页

作者：孟宝伍婷苏丛郭明娟刘艳艳兰燕虎李家斌安徽医科大学第一附属医院感染病科合肥230022 安徽医科大学第一附属医院感染管理科合肥230022 安徽医科大学附属巢湖医院感染病科巢湖238000 安徽省细菌耐药性监控中心合肥230022

细菌性肺炎是全球范围内严重影响人类健康的感染性疾病,常见的致病菌包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等。近年来,越来越多的研究表明肠道菌群在细菌性肺炎发生、发展过程中具有保护作用,肠道菌群失调可能... 详细信息

细菌性肺炎是全球范围内严重影响人类健康的感染性疾病,常见的致病菌包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等。近年来,越来越多的研究表明肠道菌群在细菌性肺炎发生、发展过程中具有保护作用,肠道菌群失调可能会使肺部对细菌的清除能力降低。本研究从固有免疫和获得性免疫两个角度来阐述肠道菌群在肺部细菌性感染过程中的保护机制。

关键词：肠道菌群肺炎细菌性固有免疫获得性免疫

晚期内含子/溶酶体适配子和促分裂原活化蛋白激酶以及哺乳动物重组雷帕霉素激活物分子2基因的RNA干扰慢病毒载体的构建及其对巨噬细胞中炎性因子分泌的影响

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中华传染病杂志 2019年第10期37卷 605-609页

作者：伍婷徐方明苏丛刘艳艳兰燕虎李家斌安徽医科大学第一附属医院感染病科合肥230000 安徽医科大学附属巢湖医院感染疾病科 238000 安徽省细菌耐药性监控中心合肥230000

目的构建针对晚期内含子/溶酶体适配子和促分裂原活化蛋白激酶以及哺乳动物重组雷帕霉素激活物分子2(late endosomal/lysosomal adaptor,mitogen-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin activator 2,lamtor2)基因的小发夹RNA慢病毒载体,探讨RNA干扰lamtor2基因表达后对肺炎克雷伯菌感染引起的巨噬细胞中炎性因子分泌的调控作用.方法针对小鼠lamtor2基因设计2对小发夹RNA(shlamtor2),重组构建慢病毒载体pLKO.1-puro shlamtor2,并感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞.设2个实验组,pLKO.1-puro shlamtor2-1感染组(sh1组)和pLKO.1-puro shlamtor2-2感染组(sh2组),以空载pLKO.1质粒感染RAW264.7细胞为对照组.通过实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中lamtor2基因表达.肺炎克雷伯菌感染sh2组细胞,采用实时定量PCR方法检测细菌感染后细胞内白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α表达水平的变化.2组间比较采用t检验.结果重组慢病毒颗粒pLKO.1-shlamtor2感染RAW 264.7细胞后,对照组lamtor2基因mRNA相对表达量为1.000±0.000,sh1组为0.596±0.125,sh2组为0.120±0.080,sh2组的lamtor2表达量低于sh1组,差异有统计学意义(t=3.399,P=0.015),且sh1组和sh2组的表达量均低于对照组,差异均有统计学意义(t=3.333、9.734,均P<0.05).以肺炎克雷伯菌感染的野生RAW 264.7细胞作为对照,sh2组细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β(t=15.20)、IL-6(t=43.30)和TNF-α(t=12.67)表达水平均高于对照组(均P<0.01).结论针对lamtor2基因的小发夹RNA可通过RNA干扰机制稳定下调巨噬细胞中lamtor2基因的表达,基因下调对感染了肺炎克雷伯菌的巨噬细胞内的炎性因子的分泌有明显的促进作用.

关键词：巨噬细胞克雷伯菌,肺炎基因沉默 shRNA

电话随访在干眼症门诊患者延续性护理中的应用

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国际护理学杂志 2017年第20期36卷 2800-2803页

作者：刘杉史俊虎郝兰燕河北省眼科医院整形泪器病科河北省眼科学重点实验室河北邢台054001

目的探讨电话随访在干眼症门诊患者延续性护理中的应用及效果.方法选取2015年1-12月该院泪器门诊就诊的干眼症患者118例,按就诊时间先后顺序分为对照组和实验组各59例.对照组采用门诊常规健康教育,实验组在此基础上定期电话随访,进行... 详细信息

目的探讨电话随访在干眼症门诊患者延续性护理中的应用及效果.方法选取2015年1-12月该院泪器门诊就诊的干眼症患者118例,按就诊时间先后顺序分为对照组和实验组各59例.对照组采用门诊常规健康教育,实验组在此基础上定期电话随访,进行延续护理干预.结果实行延续护理3个月后,电话调查患者的满意度,根据回访记录及患者的复诊情况,了解患者的用药及治疗依从性.6个月后,联合主管医生电话随访,收集患者的疾病转归情况.对照组的疾病总有效率为71.19%,治愈率为32.2%,实验组患者的疾病总有效率为89.83%,治愈率为55.93%,在用药及治疗依从性方面对照组为79.66%,用药依从性达100%,差异具有统计学意义（P〈0.01）.对照组的满意度为91.5%,实验组的满意度为100%,实验组在各方面明显高于对照组.结论对干眼症门诊患者实行电话随访为主的延续性护理,提高了人们对干眼症及其危害的认识,增强了自我防范意识,自觉养成了良好的生活和行为习惯,坚持用药,改善症状,提高了满意度.

关键词：电话随访干眼症延续护理

经眉切口SMAS提升术矫治上睑松弛的临床研究

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中国医疗美容 2016年第9期6卷 1-3页

作者：史俊虎刘杉王健民吕秀丽郝兰燕河北省眼科医院河北省眼病治疗中心河北邢台054001

目的探讨经眉切口浅表肌肉腱膜系统(SMAS)提升术治疗上睑松弛的矫治效果,以期寻找对于上睑松弛老化的有效治疗方法。方法 1、选择2013年6月至2015年6月在我院就诊的上睑松弛患者32例;2、采用局麻下经眉切口SMAS提升术,手术根据患者眉下... 详细信息

目的探讨经眉切口浅表肌肉腱膜系统(SMAS)提升术治疗上睑松弛的矫治效果,以期寻找对于上睑松弛老化的有效治疗方法。方法 1、选择2013年6月至2015年6月在我院就诊的上睑松弛患者32例;2、采用局麻下经眉切口SMAS提升术,手术根据患者眉下垂程度与眉-睑距离的大小采用经眉下或眉上切口,设计手术切除皮肤量,切开皮肤、皮下组织,并切除设计切口内皮肤,沿皮下组织与眼轮匝肌之间向下分离皮瓣,暴露SMAS(眼轮匝肌与额肌筋膜组织),折叠缝合SMAS使眉及上睑得以提升,缝合皮肤切口,加压包扎双眼。结果我们根据患者眉下垂程度与眉-睑距离的不同,分别采取了眉下切口(眉下垂程度轻,眉睑距离较大)或眉上切口(眉下垂程度明显),通过SMAS的折叠提升和松弛皮肤的切除,使松弛的上睑和下垂的眉部组织均得到有效的矫正,患者恢复或接近了自己年轻时的眼部状态,获得了满意的临床效果。结论经眉切口SMAS提升术矫治上睑松弛及老化治疗效果良好。

关键词：经眉切口浅表肌肉腱膜系统上睑松弛提升术

延续护理在鼻内镜下泪囊鼻腔吻合术患者中的应用

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护理实践与研究 2016年第20期13卷 56-57页

作者：刘杉史俊虎吕秀丽郝兰燕郭云格河北省眼科医院邢台市054001

目的:探讨延续护理在鼻内镜下泪囊鼻腔吻合术患者中的应用效果。方法:选取2014年1月?2015年12月我院收治的380例鼻内镜下泪囊鼻腔吻合术的患者为研究对象，随机将其等分为试验组和对照组，对照组给予常规出院指导，试验组除接受常规的... 详细信息

目的:探讨延续护理在鼻内镜下泪囊鼻腔吻合术患者中的应用效果。方法:选取2014年1月?2015年12月我院收治的380例鼻内镜下泪囊鼻腔吻合术的患者为研究对象，随机将其等分为试验组和对照组，对照组给予常规出院指导，试验组除接受常规的出院指导外，建立出院患者登记表，发放复诊卡片及满意度调查表，根据患者的情况制定个体化护理措施，进行延续跟踪护理。结果:实施延续护理6个月后,患者从复查依从性及患者满意度等方面与对照组比较明显提高，差异有统计学意义(P<〇.05)。结论:护士对鼻内镜下泪囊鼻腔吻合术患者进行延续护理，可使患者的遵医率提高，明显提高患者术后护理满意度，值得推广。

关键词：延续护理鼻内镜泪囊鼻腔吻合术应用

博来霉素联合地塞米松治疗儿童眼睑眶周血管瘤的疗效观察

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中国美容医学 2019年第1期28卷 9-11页

作者：刘杉史俊虎杨俭伟郝兰燕王健民河北省眼科医院眼整形泪器科河北邢台054001

目的:探讨应用博来霉素联合地塞米松局部注射治疗儿童眼睑及眶周血管瘤的临床疗效。方法:回顾性分析眼睑及眶周血管瘤患者23例,对其使用博来霉素联合地塞米松局部注射治疗,对治疗注射后瘤体容积变化以及总体治疗效果进行分析和评价。结... 详细信息

目的:探讨应用博来霉素联合地塞米松局部注射治疗儿童眼睑及眶周血管瘤的临床疗效。方法:回顾性分析眼睑及眶周血管瘤患者23例,对其使用博来霉素联合地塞米松局部注射治疗,对治疗注射后瘤体容积变化以及总体治疗效果进行分析和评价。结果:本组总有效率达到100.0%,其中治愈率为47.8%,基本治愈26.1%,好转26.1%;治疗前平均体积为(3.58±0.24)cm^3,治疗后为(0.60±0.16)cm^3,差异有统计学意义(P<0.05)。且并发症较少,包括注射后一过性体温升高,注射局部肿胀,短时间内均可消退,未见严重并发症出现。结论:博来霉素联合地塞米松局部注射治疗眼睑眶周血管瘤安全有效,费用低廉,操作简便,并发症少,且可多次重复进行,可作为儿童眼睑眶周血管瘤的有效治疗方法。

关键词：血管瘤儿童眼睑眶周博来霉素地塞米松局部注射