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猪白细胞介素-10和白细胞介素-12的分子克隆及其在原核细胞中的表达

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猪白细胞介素-10和白细胞介素-12的分子克隆及其在原核细胞中的表...

作者：兰文升新疆农业大学

学位级别：硕士

迄今为止，许多传染性疾病尚未得到有效防治，现行的灭活疫苗或弱毒疫苗等传统疫苗或免疫效力低下，或存在安全性问题，促使人们开发安全有效的新型疫苗。基于重组DNA技术的基因工程疫苗安全可靠、易于鉴别诊断，具有很大的应用前景，... 详细信息

迄今为止，许多传染性疾病尚未得到有效防治，现行的灭活疫苗或弱毒疫苗等传统疫苗或免疫效力低下，或存在安全性问题，促使人们开发安全有效的新型疫苗。基于重组DNA技术的基因工程疫苗安全可靠、易于鉴别诊断，具有很大的应用前景，但其抗原性一般较弱，需要有效的免疫佐剂以增强其保护效力。研究表明，若与抗原同时注射或预先注射细胞因子可明显增强机体产生针对该抗原的免疫应答。为进一步理解传染病的病理机制，有必要研究细胞因子在体内的变化规律和疾病发生之间的关系。细胞因子在激活一系列参与免疫反应的淋巴细胞（如B细胞、CTL细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等）过程中发挥重要调节作用，根据活化的淋巴细胞产生的细胞因子，将CD4+T细胞分为两个T细胞亚群，Th1和Th2，Th1细胞产生IL-2、IFN-γ和TNF-β，Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。细胞因子本身在诱导Th细胞极化中起关键作用，并能转化免疫反应的类型。了解Th1和Th2型细胞因子在特定疾病病理发生中的作用，将有可能通过使用某种细胞因子以诱导或加强所需要的免疫反应类型。白细胞介素-10（IL-10）又名细胞因子合成抑制因子（CSIF），B细胞衍生的T细胞生长因子（BTCGF），是一种能抑制Th1细胞释放细胞因子的免疫调节因子，由Th2细胞分泌，能抑制Th1细胞合成IL-2、IFN-γ。白细胞介素-12（IL-12）又名NK细胞刺激因子（NKSF）或细胞毒淋巴细胞成熟因子（CLMF），能诱导T细胞和NK细胞产生IFN-γ，并增强其细胞毒活性，它的关键作用是能诱导Th0细胞分化为Th1细胞以激发细胞免疫进程。IL-12是启动保护性细胞免疫的有效佐剂，在调节机体非特异性和特异性免疫方面具有重要作用，其调节方式主要通过刺激NK细胞和细胞毒淋巴细胞来完成。近十余年来，兽医上利用分子生物学技术对细胞因子进行了较多的研究，取得了重要进展，克隆出了一些细胞因子，猪IL-10（pIL-10）和猪IL-12（pIL-12）在国外已被克隆并被成功表达，而国内目前未见相关报道。本实验从LPS活化的猪外周血单个核细胞（PBMC）提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出pIL-10以及pIL-12两个亚基的编码基因，将其连接到克隆载体上，成功＜WP=6＞克隆了pIL-10和pIL-12基因。序列分析结果表明pIL-10基因与国外报道的基因序列完全一致，开放阅读框由528个核苷酸组成，推测编码的多肽由175个氨基酸组成。然后将pIL-10编码基因亚克隆到表达载体pPROEXTM HTb中，转化DH5α后，用IPTG诱导培养，表达了具有活性的重组pIL-10。pIL-12含有两个亚基，p35编码基因大小为720bp，p40为1044bp，分别编码223个氨基酸和325个氨基酸的多肽，序列分析显示，pIL-12的p35亚基基因序列与GenBank发表的完全一致，而p40亚基基因与GenBank发表的只有微小差异，提示p40基因可能存在多态性。然后将p35基因和p40基因分别亚克隆到原核表达载体pET30c、pET30b中，用IPTG诱导培养，分别表达出了预期分子量大小的重组蛋白。本研究构建的高效表达pIL-10的基因工程菌株，对于研究pIL-10在猪各种疾病中的免疫调节作用，以及开发治疗免疫功能紊乱的免疫调节剂及某些炎性疾病的抗炎防治剂，无疑具有很大的应用价值。构建的高效表达pIL-12的两个亚基的基因工程菌株，能产生具有免疫原性的蛋白，可用于单克隆抗体的生产，为pIL-12在临床上的应用奠定基础。

关键词：猪白细胞介素-10（pIL-10）猪白细胞介素-12（pIL-12）原核表达系统分子克隆

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2023年上半年我国进口蜂产品显著下降

中国蜂业 2023年第10期74卷 56-57页

作者：赵现锋陈兵王舒王婉君吴江兰文升深圳海关动植物检验检疫技术中心青岛海关技术中心华润五丰肉类食品(河南)有限公司深圳分公司

蜂产品一直是近年来我国传统的进口项目,但是随着国际国内经济贸易形势的发展,蜂产品进口贸易也在不断变化,以下分析2023年度上半年蜂产品的进口状况。根据海关数据统计,2023年上半年,我国一般贸易进口蜂产品总数量852.74吨,同比下降24.... 详细信息

蜂产品一直是近年来我国传统的进口项目,但是随着国际国内经济贸易形势的发展,蜂产品进口贸易也在不断变化,以下分析2023年度上半年蜂产品的进口状况。根据海关数据统计,2023年上半年,我国一般贸易进口蜂产品总数量852.74吨,同比下降24.28%,环比下降44.21%,总金额为1335.87万美元,同比下降47.94%,环比下降50.57%。上半年我国进口蜂蜜数量691.29吨,同比下降35.65%,进口蜂蜜金额1117.84万美元,同比下降54.69%,进口均价16.17美元/kg,蜂蜜进口金额占所有蜂产品进口总额的83.68%。

关键词：贸易形势进口金额进口贸易蜂产品进口总额环比蜂蜜

进口冰鲜大西洋鲑中传染性鲑鱼贫血症病毒的鉴定

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病毒学报 2017年第1期33卷 96-102页

作者：刘莹贾鹏王津津史秀杰于力郑晓聪何俊强兰文升刘荭深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心深圳518045 深圳市检验检疫科学研究院深圳518001

传染性鲑鱼贫血症病毒(Infectious salmon anaemia virus,ISAV)作为一种对鲑鳟鱼类危害严重的病原,对世界鲑鳟养殖业造成较大经济损失。本研究依据世界动物卫生组织(OIE)推荐的方法,对2014年经深圳口岸进口的冰鲜大西洋鲑进行了ISAV检... 详细信息

传染性鲑鱼贫血症病毒(Infectious salmon anaemia virus,ISAV)作为一种对鲑鳟鱼类危害严重的病原,对世界鲑鳟养殖业造成较大经济损失。本研究依据世界动物卫生组织(OIE)推荐的方法,对2014年经深圳口岸进口的冰鲜大西洋鲑进行了ISAV检测,9批挪威进口冰鲜大西洋鲑被检出疑似ISAV阳性。然而,9批样品ISAV病毒分离结果均为阴性。基于ISAV血凝素酯酶(Hemaglutinin esterase,HE)基因序列的分析结果,9株ISAV均属于HPR非缺失型ISAV(HPR0ISAV),且与挪威ISAV分离株同源性达98.3%~100.0%。本研究共从491批冰鲜大西洋鲑中检出HPR0ISAV阳性9批,阳性检出率为1.8%。因此,应加强对挪威进口冰鲜大西洋鲑的检疫,以防HPR0ISAV传入我国。

关键词：大西洋鲑传染性鲑鱼贫血症病毒鉴定

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深圳市售进口蜂产品携带蜂病毒初步风险分析

中国蜂业 2023年第11期74卷 39-42页

作者：赵现锋陈兵王卫明吴江史卫军王婉君兰文升曾少灵深圳海关动植物检验检疫技术中心湖北省秭归县畜牧发展中心华润五丰肉类食品(河南)有限公司深圳分公司

为了解深圳市售进口蜂产品携带蜜蜂急性麻痹病毒、黑蜂王台病毒、慢性蜜蜂麻痹病毒、残翅病毒、克什米尔蜜蜂病毒和囊状幼虫病毒等6种常见蜂病毒情况,研究团队采购了80份深圳地区市场零售进口蜂产品样品,应用分子生物学方法进行核酸检... 详细信息

为了解深圳市售进口蜂产品携带蜜蜂急性麻痹病毒、黑蜂王台病毒、慢性蜜蜂麻痹病毒、残翅病毒、克什米尔蜜蜂病毒和囊状幼虫病毒等6种常见蜂病毒情况,研究团队采购了80份深圳地区市场零售进口蜂产品样品,应用分子生物学方法进行核酸检测。结果表明,80份样品中检出黑蜂王台病毒、残翅病毒和克什米尔蜜蜂病毒等3种蜂病毒核酸。其中,黑蜂王台病毒的核酸检出率最高,共65批,占比达81.25%,残翅病毒为22.5%,克什米尔蜜蜂病毒为1.25%。由此可见,目前深圳市场零售进口蜂产品携带部分种类蜂病毒,建议加强检测追踪。

关键词：蜂产品蜂病毒风险分析

主要水生动物疫病病原学及检疫技术研究——深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心研究成果

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科技成果管理与研究 2014年第12期 91-92页

作者：兰文升

我国是世界水产养殖产量最多的国家之一，水产养殖业在我国农业生产中具有举足轻重的地位，同时，水产贸易也是我国农业创汇的重要支柱。深圳毗邻香港，是连接国际和国内的重要枢纽，每天有大量的水产品通关，因此深圳口岸也是水生动物... 详细信息

我国是世界水产养殖产量最多的国家之一，水产养殖业在我国农业生产中具有举足轻重的地位，同时，水产贸易也是我国农业创汇的重要支柱。深圳毗邻香港，是连接国际和国内的重要枢纽，每天有大量的水产品通关，因此深圳口岸也是水生动物疫病传人和传出的高风险地区。列入国际兽疫局（OIE）名录中的水生动物病害有30多种，其中85％以上是病毒病。近年来，各国要求检疫的病害种类越来越多，相关技术也在不断提高。我国对水生动物疫病的研究，往往是在疫病已经暴发或对养殖业造成了相当大的危害后才开始，长期以来由于缺乏有效和规范的检测方法，无法对这些疫病的发生进行监测和预警，因此，对水生动物疫病病原进行研究和建立相应的检测方法迫在眉睫。

关键词：深圳出入境检验检疫局水生动物疫病动植物检验检疫技术中心病原学研究成果检疫技术水产养殖业

传染性造血器官坏死病毒糖蛋白抗血清的制备及应用

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渔业科学进展 2012年第6期33卷 112-117页

作者：朱旭兰文升刘荭高隆英杜鹃陈孝煊华中农业大学水产学院武汉430070 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 518045 深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室 518045

应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hemato-poietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖... 详细信息

应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hemato-poietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白。经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57kDa。Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别。用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,ELISA显示抗体效价可达1∶64000。经制备的抗血清可以作为一抗建立ELISA检测方法,用于检测细胞悬液的病毒粒子,将抗血清稀释到1∶16000仍能与IHNV全病毒发生反应。本研究利用重组的IHNV糖蛋白成功制备了高效价的抗血清,并能够与IHNV全病毒发生特异性结合,为IHNV免疫学检测方法建立奠定了基础。

关键词：传染性造血器官坏死症病毒糖蛋白原核表达抗血清

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)特性和对鲤春病毒的敏感性

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渔业科学进展 2016年第6期37卷 56-61页

作者：王津津刘莹于力贾鹏陈兵史秀杰郑晓聪兰文升何俊强刘荭深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心深圳518045

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)是中国科学院水生生物研究所在20世纪70年代开展草鱼出血病研究时建立的一株细胞系,迄今已传至300多代,在中国鱼类病毒学研究领域发挥了重要作用。本研究采用形态学观察、细胞生长曲线测... 详细信息

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)是中国科学院水生生物研究所在20世纪70年代开展草鱼出血病研究时建立的一株细胞系,迄今已传至300多代,在中国鱼类病毒学研究领域发挥了重要作用。本研究采用形态学观察、细胞生长曲线测定、细胞周期测定、细胞核型分析、细胞凋亡检测、电镜观察等方法,对GCO的生长特性及鲤春病毒血症病毒(SVCV)在该细胞中的增殖特性等进行了研究。结果显示,GCO细胞的最适生长温度为25℃,在M199和MEM等细胞培养液中均能较好地生长,培养液中最适的胎牛血清浓度为10%。测定了GCO细胞系对SVCV病毒的敏感性,发现与鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)等世界动物卫生组织(OIE)推荐和各检测实验室常用的鱼类细胞系相比,GCO细胞系对SVCV表现出非常高的敏感性。生长曲线、电镜观察和凋亡实验显示,SVCV能引起GCO细胞系出现明显而稳定的细胞病变,引起GCO细胞系出现凋亡,并在细胞质中大量增殖。结果表明,GCO细胞系适用于SVCV病毒的分离、检测以及病毒致病性的有关研究。GCO细胞的适宜生长温度为15–28℃,这一特点将使它可以广泛地用于多种水生动物病毒的分离。

关键词：草鱼性腺细胞系生物学特性易感性鲤春病毒血症病毒

鱼类病毒性出血性败血症病毒核蛋白基因的原核表达

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华中农业大学学报 2012年第3期31卷 376-380页

作者：杜娟兰文升刘荭郑晓聪陈孝煊华中农业大学水产学院武汉430070 深圳市外来有害生物重点实验室深圳518045 深圳出入境检验检疫局深圳518045

通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 221bp核蛋白基因片段,诱导表达重组质粒pET28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导5h蛋白表达量最高,获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致,约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后,将沉淀和上清分别用于SDS-PAGE电泳,结果表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。表达蛋白经过复性、纯化,得到了较高纯度的可溶性蛋白。经Western-blot检测表明,该表达产物能被羊抗VHSV阳性血清特异性识别。

关键词：病毒性出血性败血症病毒核蛋白基因克隆原核表达可溶性蛋白

蚊虫乙酰胆碱酯酶的真核表达、纯化及活性测定

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华中农业大学学报 2012年第4期31卷 423-427页

作者：谭烽兰文升崔峰乔传令陈雯莉华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理国家重点实验室北京100101

利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得到了纯... 详细信息

利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得到了纯度较高的乙酰胆碱酯酶。参照Ellman法对酶的活性进行测定,结果显示纯酶的活力为2.219×10-4 mol/(min.g)。

关键词：有机磷农药乙酰胆碱酯酶昆虫杆状病毒表达系统纯化酶生物传感器