检索结果-南通市图书馆

同方期刊数据库

呼吸道合胞病毒融合前F蛋白三聚体定量检测方法的建立及应用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

微生物学免疫学进展 2024年第04期 16-22页

作者：唐悦王婉侯风萍寇桂英陈玥如郭岚李奇蒙傅生芳李雄雄兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗技术创新中心

目的建立呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）融合前F蛋白（prefusion F protein, pre-F）三聚体定量检测方法，并对其进行方法学验证和初步应用。方法选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14作为捕获抗体，辣根过氧化物... 详细信息

目的建立呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）融合前F蛋白（prefusion F protein, pre-F）三聚体定量检测方法，并对其进行方法学验证和初步应用。方法选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14作为捕获抗体，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的RSV pre-F特异性抗体D25作为检测抗体，通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度，对封闭液进行优化，建立双抗体夹心ELISA。分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证，并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测。结果该方法确定的捕获抗体AM14包被浓度为1.25μg/mL,检测抗体D25浓度为0.50μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）。方法验证结果显示，线性范围为1.50～24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好，仅与RSV pre-F三聚体反应；准确度和精密度验证结果显示回收率为87.41%～117.03%,变异系数（coefficient of variation,CV）为5.47%～14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时，回收率在87.65%～106.45%,证明该方法耐用性优良；该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测。结论成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法，该方法专属性强，准确度、精密度、耐用性均优良，可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测，无需Octet或者Biacore等精密仪器，具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点。

关键词：呼吸道合胞病毒融合前F蛋白定量酶联免疫吸附试验三聚体构象

同方期刊数据库

呼吸道合胞病毒滴度双抗体夹心ELISA检测方法的建立

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

国际免疫学杂志 2024年第1期47卷 33-38页

作者：王婉唐悦赵忆宁陈玥如傅生芳程亚慧李雄雄兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室、甘肃省疫苗工程技术研究中心兰州730046

目的建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)滴度。方法以RSV融合前F蛋白的两种抗体AM14与D25作为捕获抗体和检测抗体,通过对其抗体浓度的优化来确定DAS-ELISA较适反应条件,并对该方法的特异性、重复性、灵敏度及适用性进行验证。结果选择用AM14抗体作为捕获抗体,D25作为检测抗体。捕获抗体AM14较适工作浓度为20μg/mL,检测抗体D25的稀释比例为1∶3000。建立的DAS-ELISA与轮状病毒(rotavirus,RV)和人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3,HPIV-3)无交叉反应,且不同稀释倍数的RSV病毒进行批内与批间重复试验的变异系数(coefficient of variation,CV)均<10%;不同亚型的RSV及蛋白进行试验,均能检测到病毒滴度;检测结果与CCID50比较,可检测的稀释倍数略高。结论建立了检测RSV滴度的DAS-ELISA,该方法可为实验室RSV病毒滴度检测提供依据。

关键词：呼吸道合胞病毒融合前F蛋白双抗体夹心ELISA 病毒滴度

基于融合前F蛋白呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

微生物学免疫学进展 2022年第6期50卷 58-64页

作者：孙宇宸(综述) 傅生芳朱传凤(审校) 兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染(lower respiratory tract infection,LRTI)的主要原因,尚无可用于预防的疫苗。目前,WHO已将研发RSV疫苗确定为其疫苗研发和生物标准化倡议的优先事... 详细信息

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染(lower respiratory tract infection,LRTI)的主要原因,尚无可用于预防的疫苗。目前,WHO已将研发RSV疫苗确定为其疫苗研发和生物标准化倡议的优先事项之一。RSV融合蛋白(fusion protein,F)是病毒表面的主要保护性抗原,主要介导病毒包膜和靶细胞膜的融合。在感染过程中,F蛋白从亚稳态的融合前F蛋白(prefusion fusion protein,PreF)转变为稳定的融合后F蛋白(postfusion fusion protein,PostF)。近年来,研究发现PreF在体内诱导产生RSV中和抗体能力更强,适合作为免疫原用于RSV疫苗的研发。现就RSV PreF的结构、稳定策略及其作为疫苗候选抗原的应用作一概述。

关键词：呼吸道合胞病毒融合蛋白融合前构象减毒活疫苗亚单位疫苗病毒样颗粒疫苗纳米颗粒疫苗病毒载体疫苗

一株B亚型人呼吸道合胞病毒兰州分离株的全基因序列测定及其分子特征分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

病毒学报 2019年第4期35卷 648-656页

作者：傅生芳王婉马超兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)是每年引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染的主要病毒性病原,在全球造成了高疾病负担,明确RSV流行毒株的遗传背景是其流行病学研究和预防控制的基础。为了解HRSV兰州分离株RSV B/... 详细信息

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)是每年引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染的主要病毒性病原,在全球造成了高疾病负担,明确RSV流行毒株的遗传背景是其流行病学研究和预防控制的基础。为了解HRSV兰州分离株RSV B/LZ11/12的全基因组序列、分子结构特征及遗传变异情况,本研究对其全基因组进行扩增克隆和测序后,与GenBank中相关的参考毒株序列构建系统发生树并进行遗传进化及相似性分析。针对其主要蛋白F、G和SH的氨基酸进行了比对和差异分析,并对F蛋白的N-糖基化位点进行分析。结果表明B/LZ11/12与B亚型RSV的核苷酸同源性高达99%以上,其基因组全长15 275bp,具有RSV的所有结构特征。遗传进化分析显示,B/LZ11/12与B/GZ/13-730、B/England138/2016和SC2225同属于一个分支,提示亲缘关系最近。G基因遗传进化树表明该毒株属于RSV B亚型BA9基因型。主要氨基酸位点分析显示该毒株的G基因和F基因均具有一个特有的变化,即Glu87Gly和Val243Ala的氨基酸替换。F蛋白N-糖基化位点分析显示该毒株具有RSV F蛋白的5个共有修饰位点,即27~30(NITE)、70~73(NGTD)、116~119(NYTI)、120~123(NTTK)和126~129(NVSI)。相似性分析表明整个基因组最易变异的区域在SH和G基因,其次是NS1、NS2和L基因的3′端。本研究首次获得了RSV B/LZ11/12兰州分离株全基因组序列,并阐明了其基因组分子结构特征,该结果对RSV病毒的基因及氨基酸数据库进行了数据补充,也为我国RSV流行病学数据进行了补充。

关键词：人呼吸道合胞病毒(HRSV) B亚型基因组序列分析分子特征

呼吸道合胞病毒TaqMan~实时定量RT-PCR检测方法的建立

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国生物制品学杂志 2018年第11期31卷 1257-1261,1267页

作者：傅生芳王云瑾朱传凤马超兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室甘肃兰州730046

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的TaqMan~实时定量RT-PCR检测方法。方法根据GenBank中RSV相关序列,以A、B亚型毒株基因组保守区域设计并合成RSV特异性引物和探针,采用体外转录RNA标准品,建立TaqMan~实时... 详细信息

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的TaqMan~实时定量RT-PCR检测方法。方法根据GenBank中RSV相关序列,以A、B亚型毒株基因组保守区域设计并合成RSV特异性引物和探针,采用体外转录RNA标准品,建立TaqMan~实时定量RT-PCR方法,同时验证方法特异性、检测范围、灵敏度和精密度。采用建立的方法检测50份下呼吸道感染患儿的痰样品。结果 RNA标准品建立的标准曲线R2> 0. 99,扩增效率在90%～110%之间。建立的方法可特异性扩增RSV Long株和RSV A2株核酸样本,IFA和HPIV-3核酸样本均无扩增;最高可检测到1. 3×10~9 copies/μL的RNA标准品,最低可检测到单拷贝的RNA标准品;4名实验员检测同一样品Ct值的试验内CV小于1. 72%,试验间的CV在2. 44%～3. 39%之间。50份下呼吸道感染患儿痰样品中,24份为RSV阳性,阳性率为48%。结论成功建立了RSV的TaqMan~实时定量RT-PCR方法,且该方法快速、特异、灵敏,可用于临床样本中RSV的有效检测。

关键词： TaqMan^(R)实时定量RT-PCR 呼吸道合胞病毒体外转录 RNA标准品

线性化聚乙烯亚胺介导的高效瞬时转染条件的优化

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

国际生物制品学杂志 2023年第3期46卷 156-160页

作者：陈玥如赵忆宁唐悦王婉傅生芳李雄雄兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心兰州730046

目的优化线性化聚乙烯亚胺(polyethylenimine linear,PEI)介导的高效瞬时转染条件,提高重组蛋白在人胚胎肾(human embryonic kidney,HEK)293F悬浮细胞中的瞬时表达效率.方法构建和鉴定重组质粒增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluore... 详细信息

目的优化线性化聚乙烯亚胺(polyethylenimine linear,PEI)介导的高效瞬时转染条件,提高重组蛋白在人胚胎肾(human embryonic kidney,HEK)293F悬浮细胞中的瞬时表达效率.方法构建和鉴定重组质粒增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)/pcDNA3.1+,通过瞬时转染的方式将质粒转入HEK293F细胞中进行表达.对转染试剂PEI与重组质粒的比例以及收获时间进行优化,通过倒置显微镜观察、SDS-PAGE和流式细胞仪检测目标蛋白的表达量,确定目标蛋白在HEK293F细胞中的最佳表达条件.采用优化后的条件在T500摇瓶(工作体积120 ml)中进行扩大表达.结果构建的重组质粒EGFP/pcDNA3.1+序列正确,在重组质粒浓度为3.0μg/ml、DNA∶PEI为2∶1、转染后24 h添加终浓度为2 mmol/L的丙戊酸钠、转染后4 d收获条件下,目的蛋白的表达量最高.此条件也适用于放大培养体积至T500的瞬时转染.结论优化了一种快速有效的基于PEI的瞬时转染方法来高水平表达重组蛋白.

关键词：线性化聚乙烯亚胺瞬时转染人胚胎肾293F细胞增强型绿色荧光蛋白

人呼吸道合胞病毒兰州株全基因组序列测定及分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国生物制品学杂志 2019年第7期32卷 735-741页

作者：朱传凤瓦晓霞傅生芳马超兰州生物制品研究所有限责任公司

目的为了解人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytium virus,HRSV)兰州株(HRSV LZ01/09)的遗传特征及分子进化规律,进一步丰富RSV基因组数据库,对HRSV LZ01/09的全基因组序列进行测定及分析。方法通过RT-PCR法对HRSV LZ01/09全基... 详细信息

目的为了解人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytium virus,HRSV)兰州株(HRSV LZ01/09)的遗传特征及分子进化规律,进一步丰富RSV基因组数据库,对HRSV LZ01/09的全基因组序列进行测定及分析。方法通过RT-PCR法对HRSV LZ01/09全基因组片段进行扩增及序列测定,利用分子生物学软件对测序结果进行拼接,并与GenBank登录的RSV实验参比株和各基因型代表株进行分子进化分析。结果 HRSV LZ01/09全基因组全长为15204 bp,基因组的结构为NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-1-M2-2-L,与报道的RSV实验参比株相同;全基因组序列比对分析表明,HRSV LZ01/09兰州株基因组序列与RSV RSS2株的同源性最高,为96. 7%,与其他RSV-A亚型毒株同源性次之,为94. 9%~95. 2%,与RSV-B亚型9320株同源性最低,为80.9%;依据RSV-G基因的第2个可变区进行系统进化树分析,HRSV LZ01/09兰州株基因组与NA1病毒分离株属于同一个分支。结论HRSV LZ01/09兰州株病毒基因组具有RSV的遗传特征,属于RSV-A亚型,基因型属于NA1型。

关键词：呼吸道合胞病毒全基因组序列测定同源性系统进化树分析

人呼吸道合胞病毒黏附蛋白片段的原核表达及纯化

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国生物制品学杂志 2012年第4期25卷 389-392页

作者：朱传凤傅生芳寇桂英陈汉泉余黎周旭兰州生物制品研究所有限责任公司兰州730046

目的原核表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株黏附蛋白(G)片段。方法利用PCR技术从HRSV兰州株(A亚型)中扩增G基因AA75-225片段,克隆至原核表达载体pET-42b(+)中,构建重组表达质粒pET-42b-G,转化... 详细信息

目的原核表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株黏附蛋白(G)片段。方法利用PCR技术从HRSV兰州株(A亚型)中扩增G基因AA75-225片段,克隆至原核表达载体pET-42b(+)中,构建重组表达质粒pET-42b-G,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 PCR扩增获得453 bp的DNA片段;重组表达质粒pET-42b-G经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量为50 230,表达量占菌体总蛋白的25%,以包涵体和可溶性两种方式存在;纯化后重组蛋白纯度可达95%以上,可与抗RSV-G蛋白单克隆抗体特异性结合。结论已成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了HRSV兰州株G片段,为后续RSV疫苗的研制、RSV感染的血清学诊断及试剂盒的研发提供了材料。

关键词：呼吸道合胞病毒黏附蛋白原核细胞基因表达纯化

用位点特异性载体蛋白偶联PCV13和PPV23的二代24价肺炎球菌结合疫苗(VAX-24)的非临床免疫原性比较

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

微生物学免疫学进展 2022年第4期50卷 76-76页

作者：傅生芳(校) 不详

尽管肺炎球菌结合疫苗(PCVs)得到了广泛使用并降低了疾病的发生率,但其血清型的替换和随之而来的向疫苗未覆盖的血清型的转变,使得开发能覆盖更多血清型的肺炎球菌结合疫苗仍然是公共卫生优先事项。然而,有研究证明使用常规技术将其他... 详细信息

尽管肺炎球菌结合疫苗(PCVs)得到了广泛使用并降低了疾病的发生率,但其血清型的替换和随之而来的向疫苗未覆盖的血清型的转变,使得开发能覆盖更多血清型的肺炎球菌结合疫苗仍然是公共卫生优先事项。然而,有研究证明使用常规技术将其他的血清型纳入现有的肺炎球菌结合疫苗中是有问题的。由于载体抑制作用,多糖结合物的不断增加会持续降低对个体血清型的免疫应答水平。

关键词：位点特异性血清型免疫应答常规技术免疫原性 PCV1 公共卫生抑制作用