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奇异变形杆菌脂多糖抗原的制备及其对小鼠免疫原性、毒性、安全性和保护性评价

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中国生物制品学杂志 2022年第8期35卷 943-948页

作者：杨文腰韩镌竹廖辉修雪亮张建侯雅丹周荔葆辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳110179 辽宁省检验检测认证中心辽宁沈阳110016

目的筛选耐受抗生素种类多、毒力强、免疫原性好、安全性高及副反应小的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis,PM),为预防用疫苗的生产提供生产用菌株。方法选择31株PM,通过检测抗生素耐药性、毒力,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)抗原的免... 详细信息

目的筛选耐受抗生素种类多、毒力强、免疫原性好、安全性高及副反应小的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis,PM),为预防用疫苗的生产提供生产用菌株。方法选择31株PM,通过检测抗生素耐药性、毒力,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)抗原的免疫原性、安全性及毒性筛选候选菌株,进一步评价其多价抗原对候选株的保护性和同种属其他菌株的交叉保护性。结果大部分PM具有多重耐药性,对四环素、氯霉素的耐药性分别为83.87%和87.09%,但对亚胺培南、头孢噻肟敏感,仅为3.23%和29.03%,其中耐受4种以上抗生素的占57%。筛选出9株毒力较强的候选菌株。盐酸羟胺在位消化最佳时间在66~72 h之间,LPS抗原含量达到稳定,为1.150 mg/mL。候选株LPS抗原的免疫原性均低于10μg/mL;安全性符合要求;毒性试验LD50除PM15(0.379 mg/mL)、PM100(0.594 mg/mL)和PM109(0.424 mg/mL)外,其余菌株均不低于0.6 mg/mL;Dienes试验表明,6株PM均属于不同菌株。LPS多价抗原对候选株的保护率达70%以上,对PM其他菌株的交叉免疫保护率分布在20%~90%之间,50%以上的占77.78%。结论6株PM候选株LPS多价抗原对候选株具有保护性,也对PM其他菌株具有交叉保护性,为后续PM医院获得性感染的预防研究提供了数据支持。

关键词：奇异变形杆菌脂多糖抗原抗生素耐药性毒力免疫原性安全性毒性交叉保护性

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CD1d四聚体检测技术的初步改良

CD1d四聚体检测技术的初步改良

作者：修雪亮中国医科大学

学位级别：硕士

前言 NKT细胞TCR识别由非胸腺依赖抗原与CDld结合而成的复合物。α-GalCer为目前发现的NKT细胞结合效能最强的糖脂抗原,其可以装载入CDld分子抗原结合沟槽,应用此糖脂和分子所建立的CDld四聚体技术是检测NKT细胞的权威方法。 ... 详细信息

前言 NKT细胞TCR识别由非胸腺依赖抗原与CDld结合而成的复合物。α-GalCer为目前发现的NKT细胞结合效能最强的糖脂抗原,其可以装载入CDld分子抗原结合沟槽,应用此糖脂和分子所建立的CDld四聚体技术是检测NKT细胞的权威方法。肝脏是机体最大的消化与代谢器官,然而其在免疫学领域的作用日渐清晰,甚至有人已把肝脏作为独立的免疫器官;NKT细胞在肝内单个核细胞比率达到8%-15%,为所有具备淋巴样器官中最多的器官。本试验即利用肝脏内NKT细胞比率较高的特性,以评定不同制备条件建立的四聚体检测效果,从而对其制备条件进行改良。不同肝脏单个核细胞制备方法可对NKT细胞比率产生影响,选择一种稳定的制备方法也是保证改良方案实施的重要基础。 Tween-20是常用的实验室有机助溶剂,属水包油型乳化剂,可用作增溶剂、扩散剂、稳定剂、润滑剂和抗静电剂。CDld四聚体在制备过程中用含有Tween-20的PBS分散糖脂抗原是能否建立成功四聚体的关键步骤,但其亦能对反应体系造成不利影响,因而在保证其分散效果的同时也应该控制Tween-20在整个反应体系里的量才能找到一个理想的平衡点。a-GalCer与融合蛋白的孵育时间是CDld四聚体制备过程的限速步骤,现今的制作流程中二者的孵育时间皆在12小时以上,这完全限制了CDld四聚体技术的快速应用。本研究建立的CDld四聚体技术可对小鼠胸腺、脾脏、肝脏iNKT细胞进行检测,并对CDld四聚体制作过程的PBS所含Tween-20浓度及a-GalCer与融合蛋白的孵育时间进行摸索,希求应用最少的Tween-20及最短的孵育时间达到良好稳定的检测效果的目的。方法以肝脏内单个核细胞为检测对象,利用含Tween-20不同浓度PBS所建立CDld四聚体检测其NKT比率,通过对比Tween-20浓度不同对CDld四聚体检测效率的差异,确定最合理的Tween-20浓度;以肝脏内单个核细胞为检测对象,利用糖脂a-GalCer与CDld-IgG1 Fc融合蛋白经不同孵育时间所建立CDld四聚体对其NKT比率进行检测,通过对比孵育时间的不同对CDld四聚体检测效率的差异,确定最合理的孵育时间。结果 CDld四聚体检测NKT方法的建立应用保守建立方法,即用含Tween-201%的PBS稀释a-GalCer糖脂储存液,并与CDld-IgG1 Fc融合蛋白孵育过夜12小时所建立的四聚体检测液对所提纯肝脏单个核细胞、胸腺细胞、脾脏单个核细胞进行检测,可检测到NKT细胞亚群,其检测阳性比率与国外文献相符,表明四聚体建立成功。用含不同浓度Tween-20 PBS （0.00%、0.05%、0.10%、0.25%.0.50%、1.00%、2.00%）制备的CDld四聚体检测肝脏单个核细胞内NKT细胞,对其检测效率进行比较,在0.5%至2%范围内增加时,所测得NKT细胞比率稍有下降趋势或比率相当,统计学处理Tween-20浓度在0.5、1%、2%时,三者的检出能力无统计学差异,显示Tween-20在0.5%时即能制备出具有完整检出能力的CDld四聚体。不同糖脂a-GalCer与CDld-IgG1 Fc融合蛋白装载时间（1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h）所制备的CDld四聚体检测肝脏单个核细胞内NKT细胞,对其检测效率进行比较。数据表明,随装载时间在1h、2h、4h、6h、8h范围内不断增加,所测得NKT细胞比率不断增加;在8h、12h、24h范围内增加时,所测得NKT细胞比率稍有下降趋势或比率相当,统计学处理装载时间在8h、12h、24h时,三者的检出能力无统计学差异,显示装载时间8h时即能制备出具有完整检出能力的四聚体。结论建立CDld四聚体检测技术,可以对肝脏、胸腺、脾脏NKT细胞进行检测。在CDld四聚体制备过程中,用于分散a-CalCer糖脂抗原的PBS所含Tween-20的浓度可降低到0.5%。在CDld四聚体制备过程中,a-CalCer和CDld-IgG1 Fc融合蛋白的孵育时间可缩短到8h。

关键词： α-GalCer NKT细胞四聚体肝脏

奇异变形杆菌-金黄葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗的制备及其对小鼠的保护效果

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中国生物制品学杂志 2016年第9期29卷 903-906页

作者：杨文腰修雪亮王瀛张建戴泽文王琦周荔葆辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳110179

目的制备奇异变形杆菌-金黄葡萄球菌-铜绿假单胞菌（Proteus mirabilis-Staphylococcus aureus-Pseudomonas aeruginosa,PSP）吸附联合疫苗,并检测其对小鼠的保护效果。方法通过不同生产工艺制备奇异变形杆菌胞膜抗原（Proteus mirabili... 详细信息

目的制备奇异变形杆菌-金黄葡萄球菌-铜绿假单胞菌（Proteus mirabilis-Staphylococcus aureus-Pseudomonas aeruginosa,PSP）吸附联合疫苗,并检测其对小鼠的保护效果。方法通过不同生产工艺制备奇异变形杆菌胞膜抗原（Proteus mirabilis membrane antigen,PMA）、金黄葡萄球菌胞质抗原（Staphylococcus aureus cytoplasmic antigen,SCA）金黄葡萄球菌类毒素抗原（Staphylococcus aureus toxoid antigen,SEA）及铜绿假单胞菌类毒素抗原（Pseudomonas aeruginosa toxoid antigen,PEA）,按照一定配伍方式与Al（OH）_3佐剂形成PSP吸附联合疫苗,经腹腔注射小鼠,测定其保护效果。结果 6价PMA抗原对奇异变形杆菌6株疫苗株保护率为50%-100%;PSP吸附联合疫苗对奇异变形杆菌PM104的保护率为80%,对铜绿假单胞菌PA101的保护率为100%,对2株金黄葡萄球菌SA79和CMCC26002的保护率分别为90%和60%,对金黄葡萄球菌CMCC26002 α-毒素的保护率为70%。PSP吸附联合疫苗对同群异源菌株交叉保护率达70%以上的比例为：奇异变形杆菌占61.11%;金黄色葡萄球菌占50%;铜绿假单胞菌保护率占92.86%。结论 PSP吸附联合疫苗对疫苗株具有保护性,也对同群菌株具有保护性,为进一步临床研究提供了理论基础和技术支持。

关键词：奇异变形杆菌金黄葡萄球菌铜绿假单胞菌吸附联合疫苗交叉保护

甲型肝炎灭活疫苗(MRC-5细胞)中乙二胺四乙酸二钠残留量HPLC检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2021年第1期34卷 84-88页

作者：樊雪王一平李璇修雪亮廖辉周荔葆辽宁成大生物股份有限公司研发部辽宁沈阳110179

目的建立检测甲型肝炎(hepatitis A,HA)灭活疫苗(MRC-5细胞)中乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)残留量的HPLC法,并进行验证。方法色谱条件:选用反相色谱柱;流动相为水相-有机相,水相为四丁基氢氧化铵的磷酸盐溶液,有机相为乙腈;流速为1.0 mL/... 详细信息

目的建立检测甲型肝炎(hepatitis A,HA)灭活疫苗(MRC-5细胞)中乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)残留量的HPLC法,并进行验证。方法色谱条件:选用反相色谱柱;流动相为水相-有机相,水相为四丁基氢氧化铵的磷酸盐溶液,有机相为乙腈;流速为1.0 mL/min;检测波长为257 nm;进样量为20μL;柱温为30℃;保留时间为10 min。筛选色谱柱并优化流动相条件(水相与有机相的比例、pH及磷酸盐)。验证方法的适用性、专属性、线性范围、准确度、精密度、耐用性、定量限和检测限。采用该方法检测3批HA灭活疫苗原液供试品中EDTA-2Na残留量。结果最适色谱条件:采用美国Thermo公司的C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),水相与有机相比例为9∶1,pH为2.4,磷酸盐为0.01 mol/L磷酸二氢铵。EDTA-2Na对照品色谱峰的理论塔板数大于10 000,分离度大于1.5;仅对照品有色谱峰,且无其他色谱峰干扰;对照品在0.2~20μg/mL范围内线性关系良好,回归方程为Y=20 482.18 X+0.512 6,R^(2)=0.999 9;准确性验证中,浓度为2、5、10μg/mL的加标样品平均回收率分别为97.44%、100.6%及100.4%,RSD为1.6%;5μg/mL的加标样品重复性及中间精密度的RSD分别为1.4%和1.6%;定量限及检测限分别为0.2和0.05μg/mL;不同pH(2.0、2.4、3.0)流动相的色谱峰面积的RSD分别为0.24%、0.31%及0.18%,相对误差(RE)分别为99.25%、99.12%及99.33%。3批供试品均未检出EDTA-2Na。结论成功建立了检测HA灭活疫苗中EDTA-2Na残留量的HPLC法,该方法具有良好的专属性、线性范围、准确度、精密度及耐用性,为HA灭活疫苗的质量控制研究奠定了基础。

关键词：甲型肝炎灭活疫苗高效液相色谱法乙二胺四乙酸二钠残留量

微针应用后皮肤孔道形成与闭合的影响因素及评价方法

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药学学报 2021年第5期56卷 1293-1300页

作者：李蓉蓉王缘刘哲修雪亮刘勇王延妮马凤森浙江工业大学药学院生物制剂与材料实验室浙江杭州310014

微针作为一种微创、安全和高效的新型经皮给药技术,受到越来越多的关注。微针在皮肤表面形成的孔道是该技术递送药物的前提和关键,但目前缺少对皮肤孔道的系统性评价。本文综述了有关微针致皮肤孔道形成与闭合的影响因素及评价方法,涉... 详细信息

微针作为一种微创、安全和高效的新型经皮给药技术,受到越来越多的关注。微针在皮肤表面形成的孔道是该技术递送药物的前提和关键,但目前缺少对皮肤孔道的系统性评价。本文综述了有关微针致皮肤孔道形成与闭合的影响因素及评价方法,涉及微针几何参数、制备材料、药物、刺入参数、受试者皮肤差异和有无闭塞等方面因素,为微针应用的有效性和安全性提供参考和借鉴。

关键词：经皮给药微针评价方法孔道影响因素

鼻黏膜递送温敏凝胶的组织残留量体外检测方法研究

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药物分析杂志 2021年第11期41卷 2007-2016页

作者：修雪亮傅姝婷刘勇李志勇马凤森浙江工业大学药学院生物制剂与材料实验室杭州310014 浙江大学医学院附属第四医院药剂科金华322023 浙江省量子精密测量协同创新中心杭州310023

目的:改进组织残留量法冲洗装置,建立更适宜测定鼻黏膜递送凝胶制剂组织粘附性的方法。方法:根据鼻黏液的流变学性质,筛选适宜模拟鼻黏液为黏膜冲洗液,以1.0 mL·min^(-1)的流速冲洗模拟鼻黏液进行组织残留量实验。设计自制冲洗装置并... 详细信息

目的:改进组织残留量法冲洗装置,建立更适宜测定鼻黏膜递送凝胶制剂组织粘附性的方法。方法:根据鼻黏液的流变学性质,筛选适宜模拟鼻黏液为黏膜冲洗液,以1.0 mL·min^(-1)的流速冲洗模拟鼻黏液进行组织残留量实验。设计自制冲洗装置并与溶出仪进行比较。同时对比称重法和荧光示踪法对凝胶定量的精密度。结果:以新鲜鸡蛋壳膜为模拟鼻黏膜,在与真实鼻黏液固形物相同的情况下,比较多种模拟黏液剪切速率与黏度的变化趋势后发现,羟乙基纤维素(HEC)-溶菌酶溶液具有剪切变稀的性质,但黏度约为20 mPa·s,比真实鼻黏液偏高,且该溶液不稳定,久置后出现大量絮状沉淀。黏蛋白-溶菌酶各1%溶液和HEC-明胶各1%溶液的黏度接近(约13 mPa·s),即与健康的人鼻黏液黏度一致。但只有HEC-明胶溶液久置后稳定无沉淀生成,具有与健康人鼻黏液最相似的流变学性能,且溶液的荧光强度在测定时间段内稳定(21~22 a.u.),符合试验要求。在对组织残留量测定的方法中,以异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)为探针的荧光探针法定量测定的RSD在5%~10%,不仅小于称重法结果,也满足《中华人民共和国药典》要求。使用实验自制装置进行冲洗和荧光示踪法时,组内组织残留量的RSD在5%~10%,重复性好。结论:使用自制冲洗装置,以HEC-明胶溶液作为黏膜冲洗液,荧光示踪法定量测定温敏凝胶在用于药物鼻黏膜递送过程中的组织残留量,这一方法简便可靠。

关键词：组织残留量鼻黏膜鼻黏液温敏凝胶组织粘附性

碱性羟胺、弱碱和乙酸水解奇异变形杆菌LPS抗原及其活性的影响

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微生物学杂志 2016年第6期36卷 88-92页

作者：杨文腰王瀛王琦修雪亮戴泽文张建周荔葆辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳110179

采用碱性羟胺、弱碱、乙酸水解奇异变形杆菌LPS抗原，研究不同方式对小鼠活性的影响。检测结果表明，与水解前对比三种方式均能降低LPS抗原内毒素含量，即从2500×10^4 EU／mL降低至（250～2．5）×10^4EU／mL；热源性检测表明对家兔体... 详细信息

采用碱性羟胺、弱碱、乙酸水解奇异变形杆菌LPS抗原，研究不同方式对小鼠活性的影响。检测结果表明，与水解前对比三种方式均能降低LPS抗原内毒素含量，即从2500×10^4 EU／mL降低至（250～2．5）×10^4EU／mL；热源性检测表明对家兔体温几乎无影响；但免疫原性结果表明ED50 LPS〈ED50 Acid-LPS＋Al（OH）3〈ED50 Alkaline-LPS＋Al（OH）3〈ED50 HA-LPS＋Al（OH）3，毒性结果为LD50 HA-LPS〈LD50 Alkaline-LPS〈LD50 LPS〈LD50 Acid-LPS。因此，经过乙酸（体积分数2％）或0．1mol／L弱碱（体积分数2％）水解，能够显著降低内毒素含量及热源性，并保持其生物活性，使之成为有效的候选疫苗组分，用于预防或治疗大面积烧伤及术前或术后感染。

关键词：奇异变形杆菌 LPS抗原内毒素热源性免疫原性毒性

铜绿假单胞菌疫苗候选株筛选及其类毒素对小鼠交叉保护性的初步评估

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微生物学免疫学进展 2020年第6期48卷 1-7页

作者：杨文腰韩镌竹廖辉修雪亮侯雅丹张建周荔葆辽宁成大生物股份有限公司研发部辽宁沈阳110179 辽宁省检验检测认证中心微生物室辽宁沈阳110016

目的筛选多株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)菌株,提供可作为疫苗研发使用的备选菌株,并对其进行小鼠交叉保护性的初步评估。方法通过抗生素耐药性、毒力试验筛选铜绿假单胞菌疫苗候选株,采用不同孔径膜包(相对分子质量分别为... 详细信息

目的筛选多株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)菌株,提供可作为疫苗研发使用的备选菌株,并对其进行小鼠交叉保护性的初步评估。方法通过抗生素耐药性、毒力试验筛选铜绿假单胞菌疫苗候选株,采用不同孔径膜包(相对分子质量分别为300000、500000及1000000)对类毒素(toxoid)进行纯化工艺研究,并对其免疫原性及同源交叉保护性进行研究,评估候选株是否适用于疫苗研发。结果铜绿假单胞菌疫苗候选株均具有多重耐药性,尤其对四环素和氯霉素耐药性较高,分别为96.30%和88.89%,但对亚胺培南、环丙沙星敏感,耐药性仅为14.81%和18.52%。其中,耐受5种以上的占83.33%;毒力较强的菌株分别为PA101和PA36。类毒素经相对分子质量分别为300000、500000及1000000的孔径膜包处理后,与对照组相比类毒素收率分别为89.95%、95.52%及97.99%;内毒素残留量分别为≤107.39 EU/μg蛋白、≤101.13 EU/μg蛋白和98.58~985.80 EU/μg蛋白;与对照组相比,500000组类毒素热原检测为阴性;免疫原性结果表明500000组、1000000组与对照组一致,均≥70%。与PA36比较,PA101类毒素对疫苗候选株免疫原性均≥70%。除PA15和PA46外,13株同源菌株交叉保护性在50%~100%之间,其中保护性≥70%的占92.31%。结论铜绿假单胞菌PA101类毒素抗原对候选菌株具有保护性,对同源其他菌株也具有一定的保护性作用,为后续铜绿假单胞菌医院获得性感染性的预防研究提供了数据支持。

关键词：铜绿假单胞菌耐药性毒力类毒素内毒素免疫原性交叉保护性

金黄色葡萄球菌多组分疫苗制备及对小鼠的保护性评价

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微生物学免疫学进展 2021年第4期49卷 7-13页

作者：杨文腰韩镌竹修雪亮廖辉侯雅丹张建周荔葆辽宁成大生物股份有限公司研发部辽宁沈阳110179 辽宁省检验检测认证中心辽宁沈阳110016

目的筛选多株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)菌株,为疫苗研发提供备选菌株,并对多组分金黄色葡萄球菌疫苗进行小鼠交叉保护性初步评估。方法通过菌株耐药性、毒力试验筛选获得金黄色葡萄球菌候选菌株;优化菌体破碎和酶解条... 详细信息

目的筛选多株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)菌株,为疫苗研发提供备选菌株,并对多组分金黄色葡萄球菌疫苗进行小鼠交叉保护性初步评估。方法通过菌株耐药性、毒力试验筛选获得金黄色葡萄球菌候选菌株;优化菌体破碎和酶解条件获得胞质抗原,并对胞质抗原进行免疫保护性研究以确定最佳免疫剂量;采用抗体中和滴度方法评价类毒素抗原免疫效果;采用多组分疫苗对候选株免疫保护性及同种属其他菌株的交叉保护性进行试验研究。结果 12株金黄色葡萄球菌候选菌株均具有多重耐药性,且对庆大霉素、环丙沙星及苯唑西林的耐药性都比较高,均为83.33%,但都对万古霉素敏感;菌株SA59和SA79毒力分别为34.19 LD50和11.96 LD50;菌体破碎最佳条件为3~4次,破碎率达到90%以上,胞质抗原酶解的最佳条件为600 mg胞质抗原在2~4 mg胰蛋白酶条件下,消化至少2 h,抗原含量基本保持不变;SA79胞质抗原免疫剂量不低于1.0 mg/mL时,保护率均>70%。类毒素抗原5 EC/mL (A组)、8 EC/mL(B组)和10 EC/mL(C组)免疫小鼠后,血清中抗体中和效价均值分别为2.13、3.13和3.50 AE/mL,B组和C组免疫后的抗体中和效价差异无统计学意义(PBC=0.224,P>0.05),但均高于A组,具有统计学意义(PAB=0.008,PAC=0.001,P<0.05)。多组分疫苗对候选菌株SA79、SA59的保护率分别为80%和70%,对外毒素的保护率为60%;多组分疫苗对同种属其他菌株的交叉保护率在50%~100%之间,保护率均≥50%。结论多组分金黄色葡萄球菌疫苗对候选株具有保护性,也对同种属其他菌株具有保护性,为后续预防用金黄色葡萄球菌疫苗的工艺开发提供数据支持。

关键词：金黄色葡萄球菌耐药性半数致死率多组分疫苗交叉保护