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松子蛋白调控Nrf2信号通路保护神经元作用及其机制研究

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松子蛋白调控Nrf2信号通路保护神经元作用及其机制研究

作者：修志儒长春中医药大学

学位级别：硕士

目的:探讨松子蛋白保护神经元作用及机制。方法:(1)利用盐析法提取松子蛋白,利用SDS-PAGE检测松子蛋白的分子量范围,利用全自动氨基酸分析仪分析松子蛋白氨基酸组成与含量;(2)体外实验:利用过氧化氢(HO)建立SH-SY5Y细胞氧化损伤模型。... 详细信息

目的:探讨松子蛋白保护神经元作用及机制。方法:(1)利用盐析法提取松子蛋白,利用SDS-PAGE检测松子蛋白的分子量范围,利用全自动氨基酸分析仪分析松子蛋白氨基酸组成与含量;(2)体外实验:利用过氧化氢(HO)建立SH-SY5Y细胞氧化损伤模型。分为空白对照组,模型对照组,松子蛋白低剂量给药组、松子蛋白中剂量给药组、松子蛋白高剂量给药组通过MTT比色法检测松子蛋白对SH-SY5Y细胞存活率的影响,利用流式细胞术检测松子蛋白对SH-SY5Y细胞凋亡的影响,利用Western blotting技术检测SH-SY5Y细胞内Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、Keap1、Aβ蛋白的表达水平,利用RT-PCR技术检测小鼠神经细胞中中Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、Keap1基因的表达水平;(3)体内实验:选取ICR种小鼠,采用血管性痴呆模型小鼠,分为假手术对照组、模型对照组、阳性给药组、松子蛋白低剂量给药组、松子蛋白中剂量给药组、松子蛋白高剂量给药组,利用Morris水迷宫与跳台实验对小鼠进行行为学检测,采用SOD、MDA、GSH生化试剂盒检测松子蛋白对小鼠海马抗氧化能力影响,HE染色观察松子蛋白对小鼠海马神经元形态的影响,TUNEL染色法检测松子蛋白对小鼠海马神经元凋亡的影响,采用Western blotting技术检测小鼠脑组织中Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、Keap1、Aβ蛋白的表达水平。结果:(1)松子蛋白主要分布在3.34.4KDa和20.15KDa,松子蛋白含有7种必需氨基酸、10种非必需氨基酸;(2)松子蛋白能提高HO所致SH-SY5Y细胞损伤的存活率(P<0.05),抑制SH-SY5Y细胞的细胞凋亡(P<0.05);(3)松子蛋白能减少血管性痴呆模型小鼠逃避潜伏期和逃避路程(P<0.05),增加其脑组织中GSH和SOD的水平(P<0.05),降低脑组织中MDA的含量(P<0.05),松子蛋白能维持小鼠海马神经元的完整性和排列紧密度,抑制核固缩,减少小鼠海马区神经元的凋亡,体外与体内实验均证明松子蛋白可上调神经细胞内Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白的表达水平(P<0.05),下调神经细胞内Aβ、Keap1和Bax蛋白的表达水平(P<0.05)。结论:松子蛋白可能通过促进Nrf2信号通路的传导,上调Nrf2、HO-1、Bcl-2的表达水平,下调Aβ、Bax的表达水平,抑制氧化损伤和神经元的凋亡,从而起到神经元的保护作用。

关键词：松子蛋白血管性痴呆氧化应激神经元保护

新补骨脂异黄酮通过caspase-3/GSDME通路诱导肝细胞癌Huh-7细胞焦亡

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中国肿瘤生物治疗杂志 2023年第4期30卷 318-323页

作者：李雅茹杨霞赵仁双修志儒朱羿龙韩继成李善智李一权金宁一延边大学医学院、病理学与病理生理学教研室吉林延边133002 长春中医药大学院士工作站吉林长春130117 中国农业科学院、长春兽医研究所吉林长春130122

目的:探讨新补骨脂异黄酮(NBIF)对肝细胞癌(HCC)Huh-7细胞焦亡的影响及其分子机制。方法:体外培养Huh-7细胞,用CCK-8法检测不同浓度的NBIF处理48 h时对细胞存活率的影响,光学显微镜下观察NBIF处理后Huh-7细胞的形态变化,乳酸脱氢酶(LDH... 详细信息

目的:探讨新补骨脂异黄酮(NBIF)对肝细胞癌(HCC)Huh-7细胞焦亡的影响及其分子机制。方法:体外培养Huh-7细胞,用CCK-8法检测不同浓度的NBIF处理48 h时对细胞存活率的影响,光学显微镜下观察NBIF处理后Huh-7细胞的形态变化,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞的LDH释放量,WB实验检测细胞中GSDME、caspase-3的蛋白水平变化。采用si RNA干扰Huh-7细胞中caspase-3、GSDME表达后,CCK-8法检测NBIF处理对细胞存活率的影响,WB实验检测GSDME蛋白表达水平,观察NBIF处理对细胞形态的影响,并检测细胞LDH释放量。结果:60μmol/L以上的NBIF均能显著抑制Huh-7细胞的增殖(均P<0.01),光学显微镜下观察到NBIF处理后的细胞出现肿胀、吐泡现象,且LDH释放增加(P<0.01);WB实验结果表明,NBIF能够激活caspase-3蛋白并切割GSDME蛋白,增加GSDME-N的表达(均P<0.01)。干扰caspase-3、GSDME表达后,NBIF对细胞的抑制作用减弱(均P<0.01),GSDME-N蛋白表达受到抑制(P<0.01),显微镜下细胞肿胀、吐泡现象几乎消失,LDH释放明显减少(P<0.05)。结论:NBIF能够通过caspase-3/GSDME途径诱导Huh-7细胞发生焦亡,从而抑制HCC细胞的增殖,为HCC的治疗提供一种新思路。

关键词：新补骨脂异黄酮肝细胞癌 Huh-7细胞细胞焦亡 GSDME

SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗的构建、筛选、安全性和免疫原性研究

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中国病原生物学杂志 2023年第3期18卷 271-275页

作者：毛泓月李一权丛佳南杨霞李玥刘子睿李善智修志儒李亚茹李霄尚超朱羿龙金宁一西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 长春中医药大学中国农业科学院长春兽医研究所延边大学

目的利用穿梭质粒通过同源重组构建表达SARS-CoV-2 RBDEPI蛋白重组痘苗病毒,并对其进行筛选、鉴定和免疫原性检测。方法参照SARS-CoV-2全基因组序列设计合成目的基因RBDEPI,通过PCR、测序、酶切连接将目的基因插入到痘苗病毒穿梭载体pS... 详细信息

目的利用穿梭质粒通过同源重组构建表达SARS-CoV-2 RBDEPI蛋白重组痘苗病毒,并对其进行筛选、鉴定和免疫原性检测。方法参照SARS-CoV-2全基因组序列设计合成目的基因RBDEPI,通过PCR、测序、酶切连接将目的基因插入到痘苗病毒穿梭载体pSTKE中,构建pSTKE-RBDEP。将pSTKE-RBDEPI与天坛株痘苗病毒VTT共转染鼠肾细胞BHK-21中,通过同源重组,并以增强型绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记,通过多次绿色荧光噬斑筛选获得重组病毒rVTT△TK-RBDEPI。利用RT-PCR和Western blot检测rVTT△TK-RBDEPI目的基因的转录和目的蛋白的表达情况;通过ELISA和ELISPOT检测rVTT△TK-RBDEPI免疫小鼠SARS-CoV-2与痘苗病毒载体特异性抗体水平和特异性淋巴细胞IL-4与IFN-γ的表达情况,确定rVTT△TK-RBDEPI的免疫原性。结果经过10次绿色荧光噬斑筛选、RT-PCR与Western blot鉴定获得1株能够表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒rVTT△TK-RBDEPI,且rVTT△TK-RBDEPI具备良好的免疫原性。结论获得能够表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒,该疫苗具有免疫原性,为以痘苗病毒为载体的SARS-CoV-2疫苗的进一步研究和临床治疗奠定了基础。

关键词： SARS-CoV-2 RBDEPI 重组痘苗病毒同源重组免疫原性

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三叶木通中酚醇和酚醇苷的生物活性研究

中国民族民间医药 2015年第23期24卷 12-13页

作者：关树光於文博潘文君修志儒长春中医药大学药学院吉林长春130117

目的：研究三叶木通茎中的四种酚醇和两种酚醇苷的抗氧化活性及抑制脂多糖诱导生成一氧化氮的活性。方法：通过对氧化自由基吸收能力（ORAC）荧光检测法测定化合物的抗氧化活性。利用脂多糖（LPS）诱导小鼠单核细胞RAW267.4产生一氧化氮... 详细信息

目的：研究三叶木通茎中的四种酚醇和两种酚醇苷的抗氧化活性及抑制脂多糖诱导生成一氧化氮的活性。方法：通过对氧化自由基吸收能力（ORAC）荧光检测法测定化合物的抗氧化活性。利用脂多糖（LPS）诱导小鼠单核细胞RAW267.4产生一氧化氮（NO）的含量和细胞增殖检测法（MTT法）,确定化合物抑制NO生成的作用。结果：三叶木通中的酚醇及酚醇苷类化合物（1-6）与阳性对照药维生素C（Vitamin C）相比,具有很强的抗氧化活性,其中酚醇类化合物（1-4）比酚醇苷类化合物（5-6）的抗氧化活性更强;化合物（1-6）均没有细胞毒作用;与阳性对照药N-单甲基-L-精氨酸（L-NMMAa）相比,化合物（1-6）显示了中等抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的活性。结论：三叶木通茎中四个酚醇类和两个酚醇苷类化合物具有明显的抗氧化活性和对LPS诱导RAW264.7细胞生成NO的中等抑制活性。

关键词：三叶木通酚醇和酚醇苷 NO抑制活性抗氧化活性

五味子乙素靶向调节Aβ及下游NF-κB/TNF-α信号通路保护受损神经元的分子机制

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中华中医药杂志 2017年第5期32卷 2064-2069页

作者：杨擎李娜隋欣李晓华石晓征刘英娜林嘉楠张慧媛阚默修志儒曲晓波长春中医药大学长春130117

目的:基于β-淀粉样蛋白(Aβ)靶点探讨五味子乙素(Sch B)对受损神经元的保护作用及下游核因子κB(NF-κB)/肿瘤坏死因子(TNF-α)信号通路调节的分子机制。方法:本研究通过Open SPR技术检测Sch B在体外对Aβ配体的结合常数、解离常数及... 详细信息

目的:基于β-淀粉样蛋白(Aβ)靶点探讨五味子乙素(Sch B)对受损神经元的保护作用及下游核因子κB(NF-κB)/肿瘤坏死因子(TNF-α)信号通路调节的分子机制。方法:本研究通过Open SPR技术检测Sch B在体外对Aβ配体的结合常数、解离常数及解离平衡常数;SDS-PAGE实验检测Sch B对Aβ寡聚体解聚的影响。在细胞水平检测Sch B对Aβ损伤SH-SY5Y细胞增殖率的影响,FACS检测受损神经元凋亡情况。蛋白水平通过Western blot检测线粒体凋亡途径相关蛋白Bcl-XL、Caspase-3的表达情况,并检测阿尔茨海默症病理特征性蛋白Aβ1-42、p-Tau表达及其下游NF-κB/TNF-α信号通路蛋白表达的水平。结果:Sch B能促进Aβ的解聚,增加Aβ损伤SHSY5Y细胞的增殖率,抑制受损SH-SY5Y细胞凋亡,增加Bcl-XL的表达和降低Caspase-3的表达,抑制Aβ1-42和p-Tau的表达水平,下调NF-κB/TNF-α信号通路的表达水平。结论:Sch B能靶向与Aβ配体亲和并有效促进Aβ寡聚体解聚,抑制神经元的凋亡,其机制可能与靶向亲和Aβ配体使其寡聚体解聚并下调神经元Aβ的表达,抑制Tau蛋白高度磷酸化,进而下调NF-κB/TNF-α通路有关。

关键词：五味子乙素 β-淀粉样蛋白 NF-κB/TNF-α信号通路凋亡受损神经元

松子蛋白对过氧化氢致SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用及其机制

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中华中医药杂志 2019年第4期34卷 1776-1779页

作者：修志儒阚默于澎宋凤媛许天阳杨擎李辉刘士坤陈锡俊兰兴成李娜曲晓波长春中医药大学长春130117 吉林省前卫医院长春130000 梅河口冠林土特产品有限公司梅河口135002

目的:观察松子蛋白(PE)对过氧化氢(H_2O_2)致SH-SY5Y细胞损伤的影响及其机制。方法:取对数生长期细胞,分为对照组,模型组,PE低、中、高剂量组(0.1、1、10μg/mL),对照组加入等体积细胞1640培养液,然后加入H_2O_2(终浓度400μmol/L)且孵... 详细信息

目的:观察松子蛋白(PE)对过氧化氢(H_2O_2)致SH-SY5Y细胞损伤的影响及其机制。方法:取对数生长期细胞,分为对照组,模型组,PE低、中、高剂量组(0.1、1、10μg/mL),对照组加入等体积细胞1640培养液,然后加入H_2O_2(终浓度400μmol/L)且孵育4h造成细胞氧化应激损伤模型,采用MTT比色法检测细胞活力,利用流式细胞技术检测PE对氧化损伤SH-SY5Y细胞凋亡程度的影响,Western blot检测Bcl-2、Nrf-2、HO-1蛋白表达的情况。结果:与对照组比较,模型组SH-SY5Y细胞存活率显著降低(P<0.05),凋亡率显著升高(P<0.05),SH-SY5Y中Nrf-2、Bcl-2、HO-1蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,PE低、中、高剂量组细胞存活率均显著升高(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.05),SH-SY5Y中Nrf-2、Bcl-2、HO-1蛋白水平均显著升高(P<0.05)。结论:PE对H_2O_2致SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,其机制可能与通过激活神经细胞内Nrf-2通路抑制其氧化应激,降低凋亡发生有关。

关键词：松子蛋白氧化损伤过氧化氢神经母瘤细胞

基于Nrf2/Keap1信号通路人参皂苷CK靶向调节Aβ分子机制研究

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中华中医药杂志 2018年第5期33卷 1840-1845页

作者：杨擎隋欣石晓征李晓华韩冬林嘉楠刘英娜张慧媛阚默修志儒李娜曲晓波长春中医药大学长春130117

目的:基于β-淀粉样蛋白(Aβ)靶点探讨人参皂苷Compound K(CK)对受损神经元保护作用及下游Nrf2/Keap1信号通路调控作用。方法:通过Open SPR技术检测CK在体外对Aβ配体的结合常数、解离常数及解离平衡常数;SDS-PAGE实验检测CK对Aβ寡聚... 详细信息

目的:基于β-淀粉样蛋白(Aβ)靶点探讨人参皂苷Compound K(CK)对受损神经元保护作用及下游Nrf2/Keap1信号通路调控作用。方法:通过Open SPR技术检测CK在体外对Aβ配体的结合常数、解离常数及解离平衡常数;SDS-PAGE实验检测CK对Aβ寡聚体解聚的影响。在细胞水平检测CK对Aβ损伤SH-SY5Y细胞存活率的影响,利用DCFH-DA探针检测受损神经元活性氧簇(ROS)表达水平。蛋白水平通过Western blot检测与调节Aβ相关激酶BACE1、PS1、IDE的表达情况,并检测阿尔茨海默病病理特征性蛋白Aβ1-42表达及其下游Nrf2/Keap1信号通路蛋白表达的水平。结果:CK能增加Aβ的解聚能力,提高Aβ损伤SH-SY5Y细胞存活率(P<0.05),降低ROS产生(P<0.05),抑制Aβ、BACE1、PS1的表达(P<0.05),促进IDE的表达(P<0.05),激活Nrf2/Keap1信号通路的表达(P<0.05)。结论:CK能靶向调节Aβ并促进Aβ寡聚体解聚,抑制ROS的产生,减轻氧化应激反应,其机制可能与靶向亲和Aβ寡聚体使其解聚并减少ROS的表达,进而激活Nrf2/Keap1通路有关。

关键词：人参皂苷compound K β-淀粉样蛋白 Nrf2/Keap1 氧化应激阿尔茨海默病

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E3L基因缺失型痘苗病毒的构建

中国病原生物学杂志 2020年第11期15卷 1314-1319页

作者：丛佳南朱羿龙李一权尚超李文杰刘子睿宋高杰李善智修志儒李亭玉李霄金宁一吉林大学动物医学学院吉林长春130062 长春中医药大学军事科学院军事兽医研究所

目的构建E3L基因缺失型痘苗病毒,并评价其毒力和安全性。方法根据天坛株痘苗病毒全基因组设计合成以E3L基因为重组臂,并含有Loxp序列、早晚期复合强启动子(PE/L)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、终止信号(T5nT)的重组痘苗病毒穿梭质粒pVTT... 详细信息

目的构建E3L基因缺失型痘苗病毒,并评价其毒力和安全性。方法根据天坛株痘苗病毒全基因组设计合成以E3L基因为重组臂,并含有Loxp序列、早晚期复合强启动子(PE/L)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、终止信号(T5nT)的重组痘苗病毒穿梭质粒pVTTΔE3L-EGFP,然后利用同源重组和Cre/Loxp系统构建E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L。检测VTTΔE3L对BHK-21、HEK-293、OA3.TS、Marc-145和DF-1细胞存活率的影响并测定其在上述细胞中的一步生长曲线,初步明确VTTΔE3L的毒力和复制能力;连续传代40代,检测VTTΔE3L的遗传稳定性;滴鼻感染BALB/c小鼠,检测其对小鼠体重变化的影响,初步明确VTTΔE3L的安全性。结果利用EGFP筛选标记和Cre/Loxp特异性敲除系统,通过多次挑斑筛选获得了E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L,且PCR鉴定VTT目的条带大小为359bp,rVTTΔE3L-EGFP目的条带大小为1206bp。结晶紫染色图表明VTTΔE3L对BHK-21细胞的抑制作用明显弱于VTT,通过连续传代40代,PCR没有检测到重组痘苗病毒VTTΔE3L的目的条带,确定了VTTΔE3L具备良好的遗传稳定性。细胞生存率检测表明随作用时间的延长VTTΔE3L对不同株细胞的杀伤作用显著低于VTT,在48h和72h时VTTΔE3L与VTT对不同细胞的抑制作用存在显著性差异(P0.05)。结论成功获得E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L,其安全性良好,为以痘苗病毒为载体的疫苗研究和临床应用奠定了基础。

关键词：天坛株痘苗病毒 E3L基因同源重组毒力安全性

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重组腺病毒Ad-VT对肝癌的抑制作用

中国病原生物学杂志 2021年第12期16卷 1398-1403页

作者：李雅茹杨霞朱羿龙李文杰刘子睿尚超宋高杰李善智修志儒葛晨晨李霄李一权金宁一蔡锦顺延边大学农学院吉林延边133002 中国农业科学院长春兽医研究所吉林长春130122 长春中医药大学吉林省院士工作站吉林长春130117

目的探讨重组腺病毒Ad-VT对人原发性肝癌HepG-2细胞的体内外抑制作用。方法使用重组腺病毒Ad-VT、Ad-T、Ad-vp3以及Ad-mock感染HepG-2细胞,通过MTS检测重组腺病毒对HepG-2细胞的杀伤抑制作用;通过Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI以及JC-... 详细信息

目的探讨重组腺病毒Ad-VT对人原发性肝癌HepG-2细胞的体内外抑制作用。方法使用重组腺病毒Ad-VT、Ad-T、Ad-vp3以及Ad-mock感染HepG-2细胞,通过MTS检测重组腺病毒对HepG-2细胞的杀伤抑制作用;通过Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI以及JC-1染色对重组腺病毒抑制HepG-2细胞的主要途径进行分析;通过构建体内裸鼠荷瘤模型,分析重组腺病毒对HepG-2细胞的体内抑瘤作用。结果Ad-VT可抑制HepG-2细胞的增殖,并呈时效和剂效关系,在100 MOI的剂量下,72 h时抑制率达最高值64.22%,与对照病毒Ad-T的50.52%和Ad-vp3的43.17%比较差异有统计学意义(P<0.05)。Ad-VT通过内源性凋亡途径引起HepG-2细胞的死亡。体内抑瘤试验中Ad-VT能够抑制肿瘤的生长,且能够延长小鼠的存活时间并提高存活率。结论Ad-VT能够诱导肝癌细胞凋亡,改变肝癌细胞线粒体膜电位,有效地抑制肝癌细胞增殖和肿瘤生长。

关键词：人肝癌细胞重组腺病毒凋亡素 HepG-2