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基于多重PCR-质谱的冠状病毒高通量检测方法的建立与应用

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基于多重PCR-质谱的冠状病毒高通量检测方法的建立与应用

作者：修乐山北京协和医学院

学位级别：硕士

冠状病毒(CoVs)属于冠状病毒科,是自然界广泛存在能够感染人和动物的一大类病毒家族。基于系统发育树分析,国际病毒分类学会(International committee on taxonomy of viruses,ICTV)将 CoVs 分为 alpha-CoV(α 属),beta-CoV(β 属),gamm... 详细信息

冠状病毒(CoVs)属于冠状病毒科,是自然界广泛存在能够感染人和动物的一大类病毒家族。基于系统发育树分析,国际病毒分类学会(International committee on taxonomy of viruses,ICTV)将 CoVs 分为 alpha-CoV(α 属),beta-CoV(β 属),gamma-CoV(γ属)和delta-CoV(δ属)。目前已知的六种人冠状病毒(HCoV):HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKUl 和 MERS-CoV 均属于α属和β属。人冠状病毒通常引起轻微的上呼吸道感染症状,而2003中国暴发的SARS-CoV引起的严重急性呼吸综合征(SARS)和2012年中东地区流行的MERS-CoV引起中东呼吸综合征(MERS),分别造成高达10%和40%的死亡率。SARS和MERS的暴发,表明高致病性的人冠状病毒严重地威胁着人类的生命健康,因此建立快速、灵敏的检测方法对于及时实施有效的预防控制措施、阻止疾病的进一步传.播至关重要。一方面,大量来自全球各地的朝圣者和游客前往中东地区,增加了 MERS-CoV传播的风险,急需建立一种高通量的冠状病毒检测手段,实时监测冠状病毒在人群中的分布,尤其是MERS-CoV;另一方面,一系列研究表明冠状病毒能通过重组变异产生新的病毒,通过跨物种传播给人类。因此,理想的检测方法不仅能够准确鉴定已知的人冠状病毒,同样也能够为发现新型人冠状病毒提供线索。本课题的研究旨在建立一种基于多重PCR与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)联用的冠状病毒高通量检测方法(mCoV-MS),不仅能准确监测已知的6种人冠状病毒,还能为发现新型人冠状病毒提供线索。该检测方法包两个部分:Panel A和Panel B。Panel A对已知的6种人冠状病毒进行多靶向的17重检测,PanelB完成几乎覆盖自然界已知α属和β属冠状病毒的17重筛查。结果表明,所有检测用引物和探针特异性良好,与其他常见呼吸道病毒无交叉反应。为了验证该方法的检测能力,实验中筛查了包含384份啮齿类动物或蝙蝠的咽拭子和肛拭子样本,以及131份呼吸道感染患者的鼻腔拭子和咽喉拭子样本。结果显示本方法与宏基因组学分析及PCR-测序的结果有很好的一致性。该方法操作简便易行,灵敏度高,可以检测α属和β属的冠状病毒,为动态监测冠状病毒的感染和流行情况提供强有力的手段。因此,该方法能够与下一代测序技术结合用于大规模样本的筛查研究,为预警新型冠状病毒引发的新发传染病做好应对准备,同时也为新发传染病监测提供新模式。

关键词：冠状病毒人冠状病毒 MALDI-TOF质谱呼吸道感染检测监测

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鲨烯合酶基因的密码子偏性分析

基因组学与应用生物学 2013年第2期32卷 232-239页

作者：何闪张淑杰修乐山邢朝斌河北联合大学生命科学学院唐山063000

为了分析鲨烯合酶（squalenesynthase，ss）基因密码子的使用方式及其影响因素，利用codonW和SPSS16．0软件对47条来自不同物种的嬲基因进行多元统计分析、对应性分析。髂基因密码子1～3位碱基的GC含量（GC1，GC2和GC3）依次为51．33％... 详细信息

为了分析鲨烯合酶（squalenesynthase，ss）基因密码子的使用方式及其影响因素，利用codonW和SPSS16．0软件对47条来自不同物种的嬲基因进行多元统计分析、对应性分析。髂基因密码子1～3位碱基的GC含量（GC1，GC2和GC3）依次为51．33％、34．65％和54．37％，3个位点的GC含量均呈极显著相关关系（p〈0．01），对应性分析的结果表明，第1轴显示30．71％的差异，有效密码子数和GC3、GC1和GC2的均值与GC3之间的相关性均达极显著水平（p〈0．01）。筛选出的26个最优密码子的第3位碱基均为G或C。以MEGA5．0构建的基于SS蛋白质序列的进化树比基于RSCU的聚类更符合传统的系统发育观点。SS基因密码子偏好以G／C结尾，使用模式受选择和突变影响，突变对密码子偏好影响较大。

关键词：鲨烯合酶密码子偏性多元分析聚类分析

刺五加糖基转移酶基因的表达及其对皂苷含量的影响

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基因组学与应用生物学 2014年第1期33卷 128-132页

作者：修乐山李非非周秘邢朝斌河北联合大学生命科学学院唐山063000

为了探明刺五加糖基转移酶基因(glycosyltransferase,GT)的表达特点及其对刺五加总皂苷含量的影响。以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术分析了不同产地、不同生长发育时期、不同器官刺五加中GT基因的表达规律及茉莉酸甲酯(Me... 详细信息

为了探明刺五加糖基转移酶基因(glycosyltransferase,GT)的表达特点及其对刺五加总皂苷含量的影响。以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术分析了不同产地、不同生长发育时期、不同器官刺五加中GT基因的表达规律及茉莉酸甲酯(MeJA)对其表达的影响。并采用浓硫酸-香草醛比色法测定刺五加总皂苷的含量,利用SPPS17.0软件进行相关性分析。结果表明,GT基因在根、幼茎、叶片和叶柄中均有表达,但表达量差异不显著。刺五加的GT基因在叶片完全展开期的表达量最高,盛花期和果实基本成熟期的表达量最低,仅为叶片完全展开期表达量的66.9%。MeJA处理可显著提高GT基因的表达量(p<0.05)。不同产地刺五加的GT基因表达量和总皂苷含量差异显著,但GT基因的表达量与总皂苷含量同升同降,存在极显著的正相关关系(p<0.01)。初步判定,GT基因的表达量决定了刺五加中总皂苷的含量,GT是决定刺五加中总皂苷含量的关键酶。

关键词：刺五加糖基转移酶基因表达皂苷含量

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刺五加功能基因密码子偏好性的分析

中草药 2013年第5期44卷 598-603页

作者：邢朝斌吴鹏修乐山周秘河北联合大学生命科学学院河北唐山063000

目的分析刺五加功能基因密码子的使用方式及其影响因素。方法以刺五加的17条功能基因为材料,利用CodonW和SPSS软件进行多元统计分析和对应性分析。结果刺五加功能基因密码子3个位置的GC量依次为51.03%、41.23%和40.04%,三者均与整个编... 详细信息

目的分析刺五加功能基因密码子的使用方式及其影响因素。方法以刺五加的17条功能基因为材料,利用CodonW和SPSS软件进行多元统计分析和对应性分析。结果刺五加功能基因密码子3个位置的GC量依次为51.03%、41.23%和40.04%,三者均与整个编码区的GC量显著相关(P<0.05),GC12与GC3的相关系数为0.262,未达到显著水平。同义密码子的相对使用频率大于1的密码子共27个,其中22个以A或T碱基结尾。对应性分析的结果表明,第1轴显示了22.78%的差异,与GC3、密码子适应指数和密码子偏好指数均极显著相关(P<0.01),相关系数分别为0.786、0.686和0.617,与有效密码子数的相关性未达显著水平。第2轴显示了19.28%的差异,且仅与有效密码子数极显著相关(r=0.635)。确定了刺五加功能基因的17个最优密码子。结论刺五加的功能基因偏好使用以A或T碱基结尾的密码子,其使用模式受选择和突变的共同影响。

关键词：刺五加密码子用法功能基因最优密码子 GC量偏好指数

刺五加鲨烯环氧酶基因的表达及其与刺五加皂苷含量的相关性分析

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中药材 2013年第7期36卷 1063-1066页

作者：李宝财修乐山周秘朱金丽邢朝斌河北联合大学生命科学学院河北唐山063000

目的:应用实时定量PCR技术对刺五加鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因进行表达分析,探讨其与刺五加皂苷含量的关系。方法:以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因为内参照基因,通过实时定量PC... 详细信息

目的:应用实时定量PCR技术对刺五加鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因进行表达分析,探讨其与刺五加皂苷含量的关系。方法:以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因为内参照基因,通过实时定量PCR检测SE基因的相对表达量,分光光度法测定刺五加皂苷含量。结果:不同产地、器官中的SE表达量存在显著差异(P<0.05),其中,雾灵山产地的表达量最大,达最小值(伊通产地)的4.81倍,各器官中,叶的表达量最大,为根的1.92倍。从叶片萌芽期到衰老期,SE的表达呈先升后降趋势,各发育期之间差异显著(P<0.05),其中盛花期的表达量最高,达萌芽期的3.71倍;茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)可提高SE的表达量,但未达显著水平。刺五加叶的皂苷含量与SE的表达量之间存在显著的正相关关系(P<0.05)。结论:不同产地、器官及生长发育时期刺五加SE的表达量间差异显著,且SE的表达与刺五加的皂苷含量显著相关。

关键词：鲨烯环氧酶基因实时定量PCR 表达刺五加皂苷相关性

刺五加鲨烯合酶基因的表达及其对皂苷含量的影响

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经济林研究 2013年第1期31卷 25-29页

作者：邢朝斌龙月红劳凤云庄鹏宇修乐山河北联合大学生命科学学院河北唐山063000 河北联合大学药学院河北唐山063000

为了了解刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)的表达特点及其对刺五加中皂苷含量的影响情况,以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术,分析了SS基因在刺五加不同生长发育时期不同器官中的表达量及茉莉酸甲酯对其表达的影响情... 详细信息

为了了解刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)的表达特点及其对刺五加中皂苷含量的影响情况,以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术,分析了SS基因在刺五加不同生长发育时期不同器官中的表达量及茉莉酸甲酯对其表达的影响情况;还利用SPSS 17.0软件分析了SS基因的表达量与刺五加中皂苷总含量的相关性。结果表明,在刺五加的整个生长期中,SS基因的表达量呈现出"低—高—低—高—低"的变化趋势:萌芽期(4月26日)该基因的表达量最低,而盛花期(6月26日)该基因的表达量最高,为萌芽期的3.11倍;SS基因在刺五加根中的表达量显著高于茎、叶和叶柄中的表达量(P<0.05),其在茎中的表达量最低,仅为根中表达量的51.88%。茉莉酸甲酯可提高SS基因的表达量,但其与对照组的差异未达到显著水平。刺五加中的皂苷总含量与SS基因的表达量间呈现出同升同降的变化趋势,存在极显著的正相关关系(P<0.01)。文中初步判定,鲨烯合酶是刺五加皂苷生物合成的关键酶。

关键词：刺五加鲨烯合酶基因表达皂苷实时定量PCR

刺五加细胞色素P450基因的克隆与表达分析

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生物技术通报 2014年第1期30卷 112-115页

作者：邢朝斌吴鹏李非非刘岩周秘修乐山河北联合大学生命科学学院唐山063000

根据已报道的人参、三七等植物的细胞色素P450(Cytochrome P450,P450)基因的cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加P450基因的cDNA全长序列,并分析其在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果显示,克隆了全长为1 410 bp的刺五加P... 详细信息

根据已报道的人参、三七等植物的细胞色素P450(Cytochrome P450,P450)基因的cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加P450基因的cDNA全长序列,并分析其在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果显示,克隆了全长为1 410 bp的刺五加P450基因的cDNA序列,该基因编码469个氨基酸残基组成的蛋白质。GenBank登录号为KF498590,与人参、三七的P450氨基酸序列一致性分别为91.5%和90.4%。刺五加的P450基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。最大表达量出现在盛花期,为最低表达量(萌芽期)的1.26倍。各器官中,叶片的表达量最高,是最低量幼茎的1.49倍。

关键词：刺五加细胞色素P450 克隆表达分析

刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

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西北植物学报 2012年第10期32卷 1950-1956页

作者：邢朝斌龙月红何闪周秘修乐山河北联合大学生命科学学院河北唐山063000

利用RACE技术克隆刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的全长cDNA序列,运用生物信息学方法对该基因进行分析,并通过RT-PCR法检测MDD在刺五加不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果表明:... 详细信息

利用RACE技术克隆刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的全长cDNA序列,运用生物信息学方法对该基因进行分析,并通过RT-PCR法检测MDD在刺五加不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果表明:(1)刺五加MDD基因cDNA序列全长1 769bp(GenBank登录号为JQ905594),开放阅读框全长1 263bp,编码420个氨基酸残基,包含GHMP激酶超家族的特异性识别序列;刺五加MDD蛋白的二级结构中含有161个α螺旋,占38.33%;68个延伸链,占16.19%;19个β折叠,占4.52%;172个无规则卷曲,占40.95%;刺五加MDD蛋白无跨膜区域,定位于膜外。(2)刺五加MDD基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。在整个生长期中,MDD的表达呈现高-低-高-低的变化趋势,第一个表达高峰出现在萌芽期至叶片完全展开时,第二个高峰出现在果实体积快速增长期,最高表达量(叶片完全展开期)为最低表达量(叶片衰老期)的4.51倍;不同器官中,幼茎的表达量最高,为最低表达量(叶片)的7.22倍,但叶片、叶柄和根中的表达量差异不显著。研究结果为阐明刺五加皂苷的生物合成及对其进行表达调控奠定了基础。

关键词：刺五加 MDD基因克隆 RT-PCR

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实施国家大学生创新性实验计划的实践与思考

河南科技 2014年第4X期33卷 254-255页

作者：修乐山河北联合大学生命科学学院河北唐山063000

国家大学生创新性实验计划为学生提供了参与科学研究的机会,是培养综合素质优秀创新性人才的一种重要手段。本文结合国家大学生创新性实验计划,简要阐述了对国家大学生创新性实验计划实施的目的、过程、作用等的思考和认识。

关键词：国家大学生创新性实验计划大学生创新综合素质