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原位PCR检测霍乱弧菌ctxAB基因

中华微生物学和免疫学杂志 2004年第9期24卷 751-754页

作者：朱利俞守义陈清蔡俊鹏第一军医大学热卫系流行病教研室广州510515 华南理工大学生物工程系

目的　为监测环境中的霍乱弧菌 ,建立原位PCR(insituPCR ,ISPCR)检测方法。方法纯培养的霍乱弧菌为实验材料 ,霍乱毒素基因 (ctxAB)为靶序列。 4 %多聚甲醛固定细胞 ,1mg/ml溶菌酶消化 2 0min ,PCR反应体系中加入 2 .5 %甘油 ,以荧光素... 详细信息

目的　为监测环境中的霍乱弧菌 ,建立原位PCR(insituPCR ,ISPCR)检测方法。方法纯培养的霍乱弧菌为实验材料 ,霍乱毒素基因 (ctxAB)为靶序列。 4 %多聚甲醛固定细胞 ,1mg/ml溶菌酶消化 2 0min ,PCR反应体系中加入 2 .5 %甘油 ,以荧光素标记的引物为标示物 ,在液相环境下 ,进行靶序列的ISPCR。结果　经蓝光激发 ,荧光显微镜下有扩增产物的细菌发出明亮的绿色荧光 ,阴性对照则无荧光。结论　由于ISPCR既能检测靶序列 ,又保护了细菌形态 ,可以在检测中省去细菌培养的过程 ,因此。

关键词：霍乱弧菌原位PCR 基因霍乱毒素细菌培养 AB 序列荧光素标记细胞扩增产物

逐步预测和统计学筛选人H5N1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

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科学通报 2008年第22期53卷 2748-2753页

作者：黄平俞守义柯昌文广东省疾病预防控制中心广东省应急病原学检测重点实验室广州510300 世界卫生组织新发传染病监测研究和培训合作中心广州510300 南方医科大学流行病学系广州510515

为了预测和筛选人禽流感H5N1毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位,检测了人禽流感H5N1毒株NA基因核苷酸序列.采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,并用SPSS1... 详细信息

为了预测和筛选人禽流感H5N1毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位,检测了人禽流感H5N1毒株NA基因核苷酸序列.采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,并用SPSS13.0进行聚类和相关分析,建立了一种统计学筛选程序,预测了H5N1病毒NA蛋白的B细胞表位,并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析.预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价.结果发现,预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120～137,81～84,408～415,273～282,429～432,356～368,46～55,146～155,341～350,198～209肽段,提示它们是B细胞表位的优势区段;含有糖基化位点NGT126～128的120～137肽段为首选的NA蛋白抗原表位;H5N1毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失,这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性,而且抗原表位扩大(VEP46～48→VEPISNTNFL46～55).采用SWISS-MODEL软件建立的N1蛋白模型有助于评价抗原表位预测.结果表明,用多参数预测以及用统计学筛选H5N1毒株NA蛋白的B细胞表位,可以为分子免疫学研究和药物筛选提供依据;广东GD-01-06毒株NA蛋白53位(Ⅰ)位点缺失可能增强该抗原表位的抗原性。

关键词： H5N1病毒神经氨酸酶(NA) B细胞表位预测筛选

用二种基因探针对肠毒性大肠杆菌腹泻的初步分子流行病学研究

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中华流行病学杂志 1990年第3期11卷 175-178页

作者：俞守义陈添弥

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汉坦病毒基因分型及其分子流行病学研究进展

中国人兽共患病杂志 2005年第3期21卷 252-255页

作者：杨占清俞守义南方医科大学流行病学教研室广州510515

汉坦病毒属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus,HV),为分节段的单股负链RNA病毒,病毒基因组有大(L)、中(M)、小(S)3个片段组成,分别编码病毒RNA依赖的RNA多聚酶、病毒糖蛋白G1和G2以及病毒的糖衣壳蛋白(NP)[1].已知人类感... 详细信息

汉坦病毒属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus,HV),为分节段的单股负链RNA病毒,病毒基因组有大(L)、中(M)、小(S)3个片段组成,分别编码病毒RNA依赖的RNA多聚酶、病毒糖蛋白G1和G2以及病毒的糖衣壳蛋白(NP)[1].已知人类感染HV病毒主要引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS).该病毒自1978年韩国和1981年我国被发现并分离成功以来,已建立了许多的实验诊断技术和研究方法,并不断地改进和发展,极大的提高了相关实验技术的特异性和敏感性[2-3].近年来,随着分子生物学技术迅速发展,特别是PCR和序列分析技术的广泛应用,人们对HV病毒分子结构本质和特征的研究取得了突破性进展,新发现的HV病毒数目急剧增加,到目前为止至少有近30种HV病毒血清/基因型[4-5].现将近年基因分型及其分子流行病学研究综述如下.……

关键词：分子流行病学研究病毒基因分型汉坦病毒肺综合征负链RNA病毒肾综合征出血热汉坦病毒属 RNA多聚酶布尼亚病毒病毒基因组 RNA依赖 G1和G2 病毒糖蛋白衣壳蛋白人类感染

Mg^(2+)浓度在多基因PCR中关系的研究

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中国公共卫生 2003年第2期19卷 143-144页

作者：吴爱军王红俞守义第一军医大学流行病学教研室广州510515

目的　通过实验介绍游离性Mg2 + 在不同浓度情况下对Tag酶活性及MgCl2 作为一种盐对多基因PCR的影响过程。方法　利用不同Mg2 + 浓度的缓冲液及不含KCl的不同Mg2 + 浓度的缓冲液来研究其对多基因PCR的影响。结果　Mg2 + 是Tag酶活性所... 详细信息

目的　通过实验介绍游离性Mg2 + 在不同浓度情况下对Tag酶活性及MgCl2 作为一种盐对多基因PCR的影响过程。方法　利用不同Mg2 + 浓度的缓冲液及不含KCl的不同Mg2 + 浓度的缓冲液来研究其对多基因PCR的影响。结果　Mg2 + 是Tag酶活性所必需的 ,Mg2 + 浓度过低时 ,Tag酶活性显著下降 ,无特异条带扩增或特异条带扩增不明显。在Mg2 + 浓度高时 ,Tag酶活性增强 ,非特异条带扩增。随着Mg2 + 浓度的增加 ,在接近 10mmol/L时 ,扩增条带亮度减弱 ,非特异扩增条带减少。结论　在无KCl存在 ,单一Mg2 + 影响反应的情况下 ,随着Mg2 + 浓度的过度增加 ,高浓度的Mg2 + 抑制了Tag酶活性 ,从而减少了产物的数量 ,在 5 0mmol/LMg2 + 浓度时完全抑制了扩增。

关键词： Mg^2+ 多基因PCR 聚合酶链反应

霍乱弧菌4种新类型tcpA基因发现及序列分析

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中国公共卫生 2005年第12期21卷 1418-1420页

作者：芮勇宇阚飙高守一俞守义南方医科大学(原第一军医大学)南方医院检验科广州510515 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所南方医科大学流行病学教研室

目的研究中国霍乱弧菌(VC)毒力协同调节菌毛A亚单位基因(tcpA)的多态性.方法分别进行聚合酶链反应及限制性片段长度多态性分析、型特异引物PCR分型、基因测序及序列分析.结果 200株O1群埃尔托型(EVC)产毒株和100株O139群VC产毒株的tcpA... 详细信息

目的研究中国霍乱弧菌(VC)毒力协同调节菌毛A亚单位基因(tcpA)的多态性.方法分别进行聚合酶链反应及限制性片段长度多态性分析、型特异引物PCR分型、基因测序及序列分析.结果 200株O1群埃尔托型(EVC)产毒株和100株O139群VC产毒株的tcpA基因均与EVC国际标准株N16961株为同一类型(t2型).50株EVC非产毒株中只有3株携带tcpA基因,1株为t2型,另2株为2种新类型.20株O139群VC非产毒株均不携带tcpA基因.20株非O1非O139群VC中只有2株携带tcpA基因,且为2种新类型.4种新类型tcpA基因与国外发现的4种类型比较,基因序列及推测的氨基酸序列同源性分别为58.3%～77.5%和61.0%～85.5%;5′端约102bp基因序列基本一致,推测的氨基酸序列完全一致;3′端约210bp基因序列变异最大,推测的氨基酸序列变异也最大.抗原表位分析,C末端差异最大.结论建立快速准确区分不同类型tcpA基因的方法,并发现4种新类型.

关键词：霍乱弧菌毒力协同调节菌毛A亚单位聚合酶链反应限制性片段长度多态性序列分析

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鼠疫耶尔森氏菌外膜蛋白研究进展

中国公共卫生 2003年第10期19卷 1268-1270页

作者：江凌晓俞守义第一军医大学流行病学教研室广州510515

耶尔森氏菌属包括11个菌种,其中只有鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌对人致病,而其余8个菌种只对动物致病.致病性耶尔森氏菌的外膜蛋白(yersinia outer-membrance proteins,Yops)一直是研究的热点.现将其研究... 详细信息

耶尔森氏菌属包括11个菌种,其中只有鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌对人致病,而其余8个菌种只对动物致病.致病性耶尔森氏菌的外膜蛋白(yersinia outer-membrance proteins,Yops)一直是研究的热点.现将其研究进展综述如下.

关键词：鼠疫耶尔森氏菌外膜蛋白研究进展

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体外筛选炭疽芽孢适配子

Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第5期34卷 635-642页

作者：甄蓓宋亚军郭兆彪王津张敏丽俞守义杨瑞馥第一军医大学流行病学教研室军事医学科学院微生物流行病研究所广州510515 北京100071 军事医学科学院微生物流行病研究所

用SELEX技术 ,寻获炭疽芽孢适配子 ,研究其亲和功能及是否作为炭疽芽孢的检测分子。化学合成长度为 35mer的随机DNA库 ,以炭疽杆菌疫苗株A .16R芽孢为靶标进行 18轮的筛选 ,筛选产物克隆、测序 ,利用生物素亲和素辣根过氧化物酶显色... 详细信息

用SELEX技术 ,寻获炭疽芽孢适配子 ,研究其亲和功能及是否作为炭疽芽孢的检测分子。化学合成长度为 35mer的随机DNA库 ,以炭疽杆菌疫苗株A .16R芽孢为靶标进行 18轮的筛选 ,筛选产物克隆、测序 ,利用生物素亲和素辣根过氧化物酶显色系统判断适配子与芽孢的结合活性 ;计算机软件分析测序适配子保守序列和二级结构 ;以兔抗炭疽芽孢抗体为捕获分子 ,适配子为检测分子混合夹心法检测炭疽芽孢。第 18轮筛选的适配子与芽孢结合后A值比第 1轮的提高了 3733 .33 %以上 ;测序 79个序列中 ,A值最高为 1.2 0 ,最低为 0 .2 0 ;混合夹心法检测表明 ,适配子量为 16 μg ,芽孢为 4× 10 7个时 ,显色信号强度最强。结果提示 ,其 5′端茎环及发夹结构是与芽孢结合的基础 ,远程高级结构对其结合功能有一定的影响 ;寡核苷酸适配子可以作为炭疽芽孢的检测分子

关键词： SELEX 炭疽芽孢适配子亲和性混合夹心法

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金黄色葡萄球菌肠毒素D产毒基因的序列分析

中国公共卫生 2004年第3期20卷 274-275页

作者：龙军陈清俞守义第一军医大学热卫系流行病教研室广州510515

目的　构建金黄色葡萄球菌肠素D(SED)毒力蛋白基因重组表达质粒。方法　根据SED已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从金黄色葡萄球菌毒力质粒上扩增出基因片段 ,克隆到原核表达质粒PET3 2中 ,转化大肠埃希菌JM 10 9感受态细胞 ,经... 详细信息

目的　构建金黄色葡萄球菌肠素D(SED)毒力蛋白基因重组表达质粒。方法　根据SED已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从金黄色葡萄球菌毒力质粒上扩增出基因片段 ,克隆到原核表达质粒PET3 2中 ,转化大肠埃希菌JM 10 9感受态细胞 ,经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。结果　PCR扩增产物大小为 3 17bp ;重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明已正确重组 ;测序结果与己知序列基本吻合。结论　国内首次克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素D产毒基因。

关键词：葡萄球菌金黄色肠毒素克隆 PCR 序列分析