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作者：佟雪琪宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的为了研究长链非编码RNA是否参与了宿主免疫细胞分化的过程,本课题利用重组疫苗P29对动物具有较好免疫保护力的作用,制备了疫苗免疫-病原体感染动物模型。在此基础上研究在重组疫苗P29免疫诱导下及病原体感染后,长链非编码RNA差异表... 详细信息

目的为了研究长链非编码RNA是否参与了宿主免疫细胞分化的过程,本课题利用重组疫苗P29对动物具有较好免疫保护力的作用,制备了疫苗免疫-病原体感染动物模型。在此基础上研究在重组疫苗P29免疫诱导下及病原体感染后,长链非编码RNA差异表达的情况,为解决寄生虫病研究中存在的宿主与病原体间免疫相互作用及免疫逃逸等难题探索新的途径。方法1.纯化和制备细粒棘球绦虫重组疫苗P29。2.疫苗免疫-病原体感染动物模型的制备:将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、P29免疫+感染组和未免疫感染组。用重组疫苗免疫P29免疫+感染组小鼠(免疫3次),与第三次免疫间隔三个月后用细粒棘球绦虫原头蚴感染小鼠(空白对照组不感染)。分别在第一次免疫前、第三次免疫后2周、感染病原体后2周,小鼠眼球取血制备外周血淋巴细胞。感染6个月后处死P29免疫+感染组和未免疫感染组小鼠,统计包囊数,计算出重组疫苗P29所引起的免疫保护力。3.提取总RNA:利用TRIZOL法提取各组小鼠各个时间点的外周血淋巴细胞中总RNA。4.构建lnc RNA和m RNA序列文库:用Epicentre公司的Magnetic Core试剂盒进行lnc RNA的分离及建库,用KAPA公司的KAPA Strand m RNA-Seq Kit进行m RNA的分离及建库。用2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化后,用Agilent 2100检验文库质量。5.高通量测序:构建好的lnc RNA和m RNA序列文库用Illumina公司Hi Seq2000高通量测序仪进行测序分析。6.生物信息学方法对测序碎片进行拼接:用tophat2软件进行拼接,将高质量reads比对到小鼠基因组上,并构建各组、各时间点的lnc RNA和m RNA转录本。7.生物信息学方法筛选差异表达分子:用Cufflinks软件对全部reads正态分布化,获得可以相互比较的表达数据,用Cuffdiff软件按照P value≤0.05且fold change≥2标准对实验组及对照组免疫后2周、感染病原体后2周的lnc RNA及m RNA表达量进行差异分析。8.注释:使用lnc RNAdb数据库(http://*** ***/)、UCSC数据库(http://***/)注释差异表达的lnc RNA。*** RNA与对应m RNA的关联性分析:通过计算实验组及对照组各个时间点差异表达lnc RNA及m RNA表达量的皮尔森系数(r),以r的绝对值大于0.99为阈值,确定lnc RNA与m RNA的相关关系。10.对P29免疫+感染组及空白对照组免疫后差异表达lnc RNA及相关m RNA分子进行初步验证:将BALB/c小鼠随机分为空白组,免疫组,免疫组小鼠经重组疫苗P29免疫3次,空白组不做处理,分别在第一次免疫前、第三次免疫后两周眼球取血制备外周血淋巴细胞。TRIZOL法提取总RNA,构建c DNA文库。利用荧光定量PCR技术对差异表达的lnc RNA及相关m RNA分子进行初步验证。结果1.成功构建疫苗免疫-病原体感染动物模型,重组疫苗P29免疫小鼠获得了94.8%的免疫保护力。2.成功提取总RNA,经核酸蛋白微量分析仪测定各组总RNA OD260/OD280均在1.8-2.0之间,总量均超过5μg,满足建库要求。3.成功构建m RNA文库及lnc RNA文库,通过Agilent 2100检验,符合测序要求。4.m RNA文库测序结果:P29免疫+感染组免疫后m RNA文库获得19717433条reads,其中高质量reads共12375673条,比对率为94.2%。P29免疫+感染组感染后m RNA文库获得24908555条reads,其中高质量reads共14766919条,比对率为94.8%。空白对照组免疫后m RNA文库获得25555287条reads,其中高质量reads共15703026条,比对率为96.1%。空白对照组感染后m RNA文库获得23772436条reads,其中高质量reads共15251560条,比对率为96.3%。未免疫感染组感染后m RNA文库获得21539925条reads,其中高质量reads共13748866条,比对率为95.1%。各文库测序量均在4Gb以上。*** RNA文库测序结果:P29免疫+感染组免疫后lnc RNA文库获得23367854条reads,其中高质量reads共16756424条,比对率为85.1%。P29免疫+感染组感染后lnc RNA文库获得21803045条reads,其中高质量reads共16449971条,比对率为87.6%。空白对照组免疫后lnc RNA文库获得25501392条reads,其中高质量reads共1804

关键词：细粒棘球蚴 lncRNA 二代测序差异表达免疫调节

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细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2016年第3期34卷 208-213页

作者：赵殷奇李子华王浩朱明星牛楠王娅娜赵嘉庆李娜佟雪琪宋佳卉赵巍宁夏医科大学基础医学院银川750004 宁夏医科大学包虫病实验室银川750004 宁夏医科大学科技中心银川750004 宁夏医科大学基础医学院病原与免疫教研室银川750004 宁夏医科大学临床学院检验系银川750004 宁夏医科大学基础医学院遗传与细胞生物教研室银川750004

目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘... 详细信息

目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体p ET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白r Eg-01883。ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射r Eg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10μg,100μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理。分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血。用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性Ig G抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白r Eg-01883的免疫原性。结果筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白r Eg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性Ig G抗体,免疫组小鼠的血清Ig G抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到最高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1±0.006)和空白对照组(0.241±0.01)(P<0.01)。首次免疫后6周,血清中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平,免疫组分别为43.23 pg/ml和24.88 pg/ml,均显著高于佐剂组(21.77 pg/ml,13.27 pg/ml)和空白对照组(17.40 pg/ml,12.25 pg/ml)(P<0.05)。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白r Eg-01883抗原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别。结论筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫ICR小鼠具有较好的免疫原性。

关键词：细粒棘球绦虫原头节重组蛋白rEg-01883 原核表达免疫原性

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缺氧对大鼠心肌细胞损伤的影响及机制

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中国老年学杂志 2017年第5期37卷 1044-1047页

作者：宋佳卉牛楠朱明星佟雪琪赵殷奇徐士梅宋熔赵巍宁夏医科大学基础医学院宁夏银川750004 宁夏医科大学科技中心宁夏医科大学临床医学院中国人民解放军第五医院重症医学科

目的探讨缺氧对大鼠心肌细胞系H9C2的损伤及机制。方法在1%O_2+5%CO_2+94%N_2条件下培养大鼠心肌细胞株H9C2 3、6、12、24、48 h,并以正常大鼠心肌细胞株作对照,使用台盼蓝进行细胞计数;CCK-8法检测细胞存活率;实时监测心肌细胞生长状态... 详细信息

目的探讨缺氧对大鼠心肌细胞系H9C2的损伤及机制。方法在1%O_2+5%CO_2+94%N_2条件下培养大鼠心肌细胞株H9C2 3、6、12、24、48 h,并以正常大鼠心肌细胞株作对照,使用台盼蓝进行细胞计数;CCK-8法检测细胞存活率;实时监测心肌细胞生长状态;透射电镜观察细胞内部结构;活性氧检测试剂盒检测胞内活性氧(ROS);Western印迹法检测线粒体色素C蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞坏死程度。结果缺氧状态下,随着缺氧时间的不断增加,大鼠心肌细胞株H9C2的细胞生长、存活率均明显降低、细胞形态明显改变,细胞器结构明显损伤,ROS水平升高,线粒体细胞色素释放增加,细胞凋亡率明显增加,LDH的释放率明显增高。结论缺氧会造成大鼠心肌细胞的生长速度减慢、形态改变及心肌线粒体损伤,最终导致细胞凋亡和细胞坏死。

关键词：缺氧线粒体损伤凋亡坏死

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缺氧培养下NRF-1基因对大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响

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宁夏医科大学学报 2016年第6期38卷 648-652,656,前插1页

作者：牛楠宋佳卉赵殷奇王浩朱明星佟雪琪李娜赵巍宋熔宁夏医科大学银川750004 宁夏医科大学基础医学院银川750004 中国人民解放军第五医院重症医学科银川750004

目的通过建立NRF-1基因过表达及shRNA干扰大鼠心肌细胞系探究NRF-1基因在缺氧条件下对线粒体膜电位的影响。方法采用RT-PCR克隆大鼠心肌细胞中的NRF-1基因并将其连接至p CDHMCS-EF1-Puro慢病毒载体,以p CDH-MCS-EF1-Puro空质粒作为对照... 详细信息

目的通过建立NRF-1基因过表达及shRNA干扰大鼠心肌细胞系探究NRF-1基因在缺氧条件下对线粒体膜电位的影响。方法采用RT-PCR克隆大鼠心肌细胞中的NRF-1基因并将其连接至p CDHMCS-EF1-Puro慢病毒载体,以p CDH-MCS-EF1-Puro空质粒作为对照,同时设计并合成干扰慢病毒载体;将重组质粒与包装质粒一同转染293T细胞,收集病毒颗粒后感染H9c2细胞并通过嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株;在1%O2、5%CO2、94%N2条件下培养转染的细胞株48h,使用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测线粒体膜电位。结果获得NRF-1过表达细胞株、空载体细胞株及shRNA干扰细胞株;缺氧条件下三组细胞存活率均减弱,与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达组细胞活力较高,shRNA干扰组的细胞活力最弱;另外,流式细胞术检测线粒体膜电位发现缺氧培养后线粒体膜电位下降。与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达细胞株线粒体膜电位下降较轻,shRNA干扰细胞株线粒体膜电位下降最明显。结论说明大鼠心肌细胞通过NRF-1基因的过表达可以减缓由缺氧造成的线粒体膜电位的下降,提高细胞在缺氧条件下的存活能力。

关键词：核呼吸因子-1 大鼠心肌细胞缺氧细胞活力线粒体膜电位

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重组抗原p29免疫保护小鼠细粒棘球蚴感染的差异长链非编码RNA的筛选研究

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宁夏医学杂志 2020年第2期42卷 97-100页

作者：王浩佟雪琪朱明星赵嘉庆赵巍宁夏医科大学基础医学院宁夏银川750004 宁夏医科大学科技中心宁夏银川750004 宁夏包虫病创新团队宁夏银川750004

目的研究在筛选重组抗原p29诱导的免疫保护下细粒棘球蚴感染宿主后长链非编码RNA(lncRNA)差异分子的意义。方法将45只BALB/c小鼠随机分为空白对照组、感染组和p29免疫+感染组。p29免疫+感染组小鼠重组抗原p29免疫3次,末次免疫7周后,采... 详细信息

目的研究在筛选重组抗原p29诱导的免疫保护下细粒棘球蚴感染宿主后长链非编码RNA(lncRNA)差异分子的意义。方法将45只BALB/c小鼠随机分为空白对照组、感染组和p29免疫+感染组。p29免疫+感染组小鼠重组抗原p29免疫3次,末次免疫7周后,采用细粒棘球蚴原头蚴腹腔感染小鼠(包括感染组、p29+感染组);感染24周后,采集小鼠血液,密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(PBMCs)。经Trizol提取总RNA后,采用Magnetic Core试剂盒构建lncRNA文库,通过HiSeq 2 000高通量测序与生物信息学方法筛选差异表达的lncRNA。最后,采用qRT-PCR验证候选lncRNA分子。结果高通量测序及生物信息学分析结果表明,与空白对照组相比,感染组小鼠PBMCs中有14个lncRNA显著差异分子(P<0.05);与感染组相比,p29+感染组外周血PBMCs细胞中有30个差异表达的lncRNA(P<0.05);进一步经qRT-PCR验证,确定XLOC-012763、INTE-015204与INTE-028446是p29+感染组的候选差异lncRNA。结论此研究筛选出p29免疫保护细粒棘球蚴感染小鼠PBMCs中的3个lncRNA差异分子,丰富了p29免疫保护理论机制,为其后续作为疫苗应用开发奠定了基础。

关键词：细粒棘球蚴感染重组抗原p29 LncRNA 高通量测序

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重组抗原P29免疫小鼠感染细粒棘球蚴后mRNA表达差异分析

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中国病原生物学杂志 2021年第4期16卷 433-437页

作者：张婷瑞佟雪琪杜先才吕咏雪赵殷奇朱明星赵嘉庆王亚娜赵巍宁夏医科大学基础医学院宁夏银川750004 吉林市中心医院检验科宁夏医学科学研究所

目的对重组蛋白P29免疫并感染细粒棘球蚴的小鼠产生差异表达的mRNA进行分析,为重组蛋白P29分子的转化和应用研究奠定基础。方法将BALB/c小鼠随机分为3组,分别为P29免疫+感染组、感染对照组和空白对照组。P29免疫+感染组小鼠用10μg/只... 详细信息

目的对重组蛋白P29免疫并感染细粒棘球蚴的小鼠产生差异表达的mRNA进行分析,为重组蛋白P29分子的转化和应用研究奠定基础。方法将BALB/c小鼠随机分为3组,分别为P29免疫+感染组、感染对照组和空白对照组。P29免疫+感染组小鼠用10μg/只重组蛋白P29进行皮下多点免疫,并在3个月后用细粒棘球蚴腹腔感染小鼠,感染对照组只感染细粒棘球蚴,空白对照组不免疫P29蛋白也不感染细粒棘球蚴。在不同时间点制备外周血淋巴细胞,提取出总RNA,再利用KAPA Strand mRNA-Seq试剂盒进行mRNA建库,利用二代测序技术测序后采用生物信息学方法分析转录组表达差异并对其进行功能和通路注释。结果利用mRNA文库测序P29免疫+感染组免疫后获得19 717 433条reads, P29免疫+感染组感染后获得24 908 555条reads,空白对照组免疫后获得25 555 287条reads,空白对照组感染后获得23 772 436条reads,感染对照组感染后获得21 539 925条reads。各文库测序量均在4Gb以上。通过生物信息学分析筛选出疫苗诱导组差异表达mRNA共473个,病原体感染组差异表达mRNA共85个,疫苗诱导+病原体感染差异表达mRNA共192个。通过GO富集分析,免疫后的P29免疫+感染组与空白对照组比较,差异表达的mRNA主要富集在蛋白二聚体活动,高尔基体及翻译等过程中;感染后的感染对照组与空白对照组比较,差异表达的mRNA主要富集在转录因子活动细胞质,免疫反应等过程;免疫感染后的P29免疫+感染组与感染对照组比较,差异表达的mRNA主要富集在蛋白二聚体活动,质膜,细胞运动等过程。KEGG通路分析中差异表达的mRNA主要富集在核糖体,趋化因子信号通路,紧密连接等通路。结论重组抗原P29免疫小鼠攻击感染细粒棘球蚴后存在mRNA的差异表达,这些分子与多种生物学过程密切相关。

关键词：细粒棘球蚴 mRNA 差异表达基因生物信息学

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自动胶囊充填机充填质量影响因素分析

自动胶囊充填机充填质量影响因素分析

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第八届沈阳科学学术年会

作者：郭楠孟繁娜葛彦杰佟雪琪安斯泰来制药(中国)有限公司沈阳红旗制药有限公司

目的探讨、分析影响间歇式自动胶囊充填机充填质量的因素。方法通过对间歇式自动胶囊充填机工作原理的阐述,对第一工位、第四工位、第五工位和第七工位等进行分析,阐明影响间歇式自动胶囊充填机充填质量的因素。结果间歇式自动胶囊充填... 详细信息

目的探讨、分析影响间歇式自动胶囊充填机充填质量的因素。方法通过对间歇式自动胶囊充填机工作原理的阐述,对第一工位、第四工位、第五工位和第七工位等进行分析,阐明影响间歇式自动胶囊充填机充填质量的因素。结果间歇式自动胶囊充填机各工位对充填质量均有不同程度的影响,第一工位中分离不良和胶囊飞帽、第四工位中废胶囊剔除的不适宜、第五工位中充填内容物重量不稳定、第七工位中胶囊插皮和锁合状态不良等均影响胶囊充填质量。结论在使用间歇式自动胶囊充填机过程中,应从安装、调试、维修、使用和管理等多方面进行及时合理地调整和维护,改善充填机的充填性能,使其达到最稳定的运行状态,从而生产出品质合格、质量稳定的产品。

关键词：自动胶囊充填机充填质量影响因素

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盐酸吡硫醇无痛型冻干粉针的研制

盐酸吡硫醇无痛型冻干粉针的研制

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第七届沈阳科学学术年会暨浑南高新技术产业发展论坛

作者：郭楠孟繁娜葛艳杰佟雪琪安斯泰来制药(中国)有限公司沈阳红旗制药有限公司

目的:研制盐酸吡硫醇无痛型冻干粉针。方法:利用二价金属离子对盐酸吡硫醇的结构有掩蔽作用,通过动物试验筛选优化,制备盐酸吡硫醇无痛型冻干粉针。优选工艺参数:冻干体积为1ml;甘露醇(与pH的比例为0.5:1)作为本品冻干支持剂时,外观和... 详细信息

目的:研制盐酸吡硫醇无痛型冻干粉针。方法:利用二价金属离子对盐酸吡硫醇的结构有掩蔽作用,通过动物试验筛选优化,制备盐酸吡硫醇无痛型冻干粉针。优选工艺参数:冻干体积为1ml;甘露醇(与pH的比例为0.5:1)作为本品冻干支持剂时,外观和复溶均较好,含水量为2.63%;预冻温度应选择较低的-50℃,预冻时间不少于8hr;干燥总时间定为24h;注射用盐酸吡硫醇冻干粉针与生理盐水注射液和5%葡萄糖注射液输液配伍相容性良好。结果采用CaCl或MgSO为掩蔽剂,且当CaCl或MgSO与盐酸吡硫醇的质量比为1:8时,刺激性最小,减痛效果最好。结论选择合适的二价金属盐(例如CaCl或MgSO)对盐酸吡硫醇的结构有很好的掩蔽作用。

关键词：盐酸吡硫醇无痛型冻干粉针二价金属盐掩蔽剂

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附子中乌头类生物碱的提取与含量测定

附子中乌头类生物碱的提取与含量测定

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第八届沈阳科学学术年会

作者：孟繁娜郭楠葛彦杰佟雪琪沈阳红旗制药有限公司安斯泰来制药(中国)有限公司

目的建立附子中乌头类生物碱的提取方法和纯化方法以及含量测定方法。方法采用醇水法提取附子中乌头类生物碱,以提取液碱化后氯仿萃取纯化,采用指示剂滴定法测定含量。结果以稀盐酸溶液、75%乙醇和85%乙醇为提取溶剂时,总生物碱提取率... 详细信息

目的建立附子中乌头类生物碱的提取方法和纯化方法以及含量测定方法。方法采用醇水法提取附子中乌头类生物碱,以提取液碱化后氯仿萃取纯化,采用指示剂滴定法测定含量。结果以稀盐酸溶液、75%乙醇和85%乙醇为提取溶剂时,总生物碱提取率分别为21.8%、75.4%和93.6%,提取物生物碱含量分别为1.62%、5.87%和7.98%;提取原料为饮片、粗粉和中粉时总生物碱提取率为别为62.3%、70.6%和93.6%,提取物生物碱含量分别为5.81%、6.18%和7.98%;纯化后提取液的含量分别为80.25%、80.37%和80.79%。结论醇水法适宜提取附子中乌头类生物碱,有机溶剂氯仿直接萃取方法适宜纯化提取液。

关键词：附子乌头类生物碱提取纯化

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烟酸洛伐他汀缓释胶囊的制备及释放度测定

烟酸洛伐他汀缓释胶囊的制备及释放度测定

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第七届沈阳科学学术年会暨浑南高新技术产业发展论坛

作者：孟繁娜郭楠佟雪琪葛艳杰沈阳红旗制药有限公司安斯泰来制药(中国)有限公司

目的制备烟酸洛伐他汀缓释胶囊和建立释放度测定方法。方法采用离心造粒法制备烟酸洛伐他汀缓释胶囊,优选工艺参数粘合剂为5%羟丙甲基纤维素水溶液,抛光时间为2～4分钟,供粉速度为25～45rpm,供浆速度为20～30rpm,烟酸微丸的包衣量为14.5... 详细信息

目的制备烟酸洛伐他汀缓释胶囊和建立释放度测定方法。方法采用离心造粒法制备烟酸洛伐他汀缓释胶囊,优选工艺参数粘合剂为5%羟丙甲基纤维素水溶液,抛光时间为2～4分钟,供粉速度为25～45rpm,供浆速度为20～30rpm,烟酸微丸的包衣量为14.5%。释放度方法学烟酸浓度在2 56～51.2?g/m1范围内与吸收度线性关系良好,平均回收率为100.6%,RSD为0.97%,在12小时内样品溶液稳定,RSD为0.30%。结果释放度的结果为:2小时,26.8%;4小时,60.9%;8小时,96.4%。结论采用离心造粒法制备烟酸和洛伐他汀素丸,圆整度好,收率较高,生产工艺比较稳定,重现性较好,能达到较好的缓释效果,易于工业化大生产。

关键词：烟酸洛伐他汀缓释胶囊离心造粒法释放度

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