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广东番茄巨芽病植原体的分子鉴定

植物保护 2024年第1期50卷 203-210页

作者：汤亚飞李正刚佘小漫于琳蓝国兵何自福广东省农业科学院植物保护研究所农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

2022年,对在广东省湛江市廉江市田间发现的疑似番茄巨芽病病株,利用分子生物学方法对其相关植原体进行了鉴定。以番茄病株叶片总DNA为模板,利用植原体16S rRNA基因通用引物R16mF2/R16mR1进行PCR扩增,获得了广东番茄巨芽病植原体(TBB-GD-... 详细信息

2022年,对在广东省湛江市廉江市田间发现的疑似番茄巨芽病病株,利用分子生物学方法对其相关植原体进行了鉴定。以番茄病株叶片总DNA为模板,利用植原体16S rRNA基因通用引物R16mF2/R16mR1进行PCR扩增,获得了广东番茄巨芽病植原体(TBB-GD-2022)16S rRNA基因片段(1 430 bp, GenBank登录号为ON102780)。16S rRNA基因序列相似性分析显示,TBB-GD-2022与16SrⅡ组植原体菌株的相似性较高,为96.82%~100%,其中与隶属于16SrⅡ-V亚组的6个植原体株系相似性为100%。系统进化分析显示,TBB-GD-2022与16SrⅡ组各植原体株系聚类在一个大分支,并与16SrⅡ-V亚组成员聚类在一个小分支,亲缘关系较近。16S rRNA基因相似系数分析表明,TBB-GD-2022与16SrⅡ-V亚组的参照株系‘Praxelis clematidea’ phyllody phytoplasma (GenBank登录号:KY568717)的相似系数为1.00。上述研究结果表明,广东番茄巨芽病植原体隶属16SrⅡ-V亚组成员。本文首次报道在广东发现番茄巨芽病,通过其16S rRNA序列分析进一步确定了其相关植原体的分类地位,为该病害的防控提供了科学依据。

关键词：番茄巨芽病植原体 16S rRNA 分子鉴定

广东省番茄白尖曲叶病病原鉴定及其致病性分析

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中国农业科学 2024年第12期 2350-2363页

作者：王愿都梦丹李正刚佘小漫于琳蓝国兵丁善文何自福汤亚飞华南农业大学植物保护学院广东省农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】洋桔梗耳突曲叶病毒（lisianthus enation leaf curl virus,LELCV）是2015年发现的菜豆金色黄花叶病毒属（Begomovirus）病毒新种。论文旨在探究入侵中国大陆的首个LELCV分离物Tomato-2022的分子特征、亲缘关系、致病性及有效... 详细信息

【目的】洋桔梗耳突曲叶病毒（lisianthus enation leaf curl virus,LELCV）是2015年发现的菜豆金色黄花叶病毒属（Begomovirus）病毒新种。论文旨在探究入侵中国大陆的首个LELCV分离物Tomato-2022的分子特征、亲缘关系、致病性及有效传播介体，为防控该病毒病提供理论依据。【方法】2022年，在广东省广州市增城区发生一种番茄新病害，病株表现叶小、卷曲、叶尖白化症状，采集两份病样提取总DNA，利用Begomovirus通用引物AV494/CoPR进行PCR检测。选取PCR检测为阳性的样品进行RCA扩增、酶切、克隆及测序，获得分离物Tomato-2022的基因组全长序列。采用BLASTn程序对病毒序列进行相似性检索并下载相似性较高的代表分离物序列，进一步用SDTv1.2的MUSCLE alignment方法进行序列相似性比对；利用软件MEGA7.0对获得的Tomato-2022基因组序列及已报道的相似性较高的代表分离物进行系统发育分析。应用酶切连接法构建Tomato-2022的侵染性克隆pGreenII0229-1.6A，通过农杆菌介导注射接种本氏烟叶片和番茄茎秆，测定其致病性。采取室内人工传毒方法，测定烟粉虱MEAM1隐种对分离物Tomato-2022的传播效率。利用LELCV的PCR特异引物对2021—2023年采集于广东省番茄主产区的135份番茄病样进行检测，明确该病毒在广东省的分布。【结果】PCR检测结果表明，两份表现叶小、卷曲、叶尖白化症状的番茄病样感染了菜豆金色黄花叶病毒属病毒。基因克隆与序列分析显示，该病毒分离物Tomato-2022基因组仅含DNA-A，大小为2 757 nt，含有6个ORF。序列相似性比较表明，分离物Tomato-2022基因组序列与已登录GenBank的LELCV各分离物相似性较高，其中与LELCV中国台湾洋桔梗分离物（LC091539、LC091538）相似性最高，为98.33%。系统发育分析显示，Tomato-2022与LELCV的19个分离物聚在一个独立的分支，亲缘关系较近。利用构建的Tomato-2022侵染性克隆pGreenII0229-1.6A，农杆菌介导注射接种本氏烟和番茄，10 dpi，本氏烟上部叶叶缘轻微上卷，1株番茄的新叶轻微卷曲；18 dpi，本氏烟和番茄植株均表现较为明显的卷曲症状；随着接种时间的延长，接种植株的症状越来越明显，30 dpi，本氏烟表现叶脉肿大、叶片严重卷曲，番茄植株的叶片表现卷曲、叶尖白化；PCR检测表明，在接种发病本氏烟和番茄植株中均能检测到LELCV。室内传毒试验证明，烟粉虱MEAM1隐种能高效传播Tomato-2022，当每株番茄接1、5、10头饲毒48 h的烟粉虱时，MEAM1的平均传毒效率分别为26.67%、93.33%、96.67%。PCR检测结果表明，采集的135份番茄病样中，8份样品检测到LELCV，说明LELCV已在广东省定殖。【结论】Tomato-2022是洋桔梗耳突曲叶病毒的一个新分离物，也是在中国大陆发现的第一个分离物，其基因组为单链环状DNA，全长为2 757 nt，编码6个ORF；该病毒分离物是引起广东省番茄曲叶、叶尖白化病的病原，可被烟粉虱MEAM1隐种高效传播。

关键词：洋桔梗耳突曲叶病毒番茄侵染性克隆致病性介体传毒效率烟粉虱

侵染构树的菜豆金色黄花叶病毒属病毒的鉴定及基因组序列分析

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植物病理学报 2024年第1期54卷 59-68页

作者：汤亚飞李正刚佘小漫于琳蓝国兵丁善文何自福广东省农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

从广东省河源市连平县采集3份疑似双生病毒侵染引起的叶片表现黄花叶症状构树样品,提取总DNA,利用Bego-movirus通用引物AV494/CoPR进行PCR检测表明,疑似病样中均检测到菜豆金色黄花叶病毒属病毒。进一步选取PCR检测为阳性的样品进行RCA... 详细信息

从广东省河源市连平县采集3份疑似双生病毒侵染引起的叶片表现黄花叶症状构树样品,提取总DNA,利用Bego-movirus通用引物AV494/CoPR进行PCR检测表明,疑似病样中均检测到菜豆金色黄花叶病毒属病毒。进一步选取PCR检测为阳性的样品进行RCA扩增、酶切、克隆及测序,获得侵染广东构树的病毒分离物基因组全长序列。广东构树分离物(GS-2021)为一个双组分病毒,包含DNA-A和DNA-B两组分。DNA-A组分(GS-2021-A)全长为2777 nt,编码7个ORFs;DNA-B组分(GS-2021-B)为2742 nt,编码2个ORFs。GS-2021与已报道的中国大青金色花叶病毒(clerodendrum golden mosaic China virus,ClGMCNV)各分离物的DNA-A、DNA-B均有较高的一致性,全长序列的一致性分别为93.0%~93.9%和86.3%~89.6%,其中与福建Fz7分离物DNA-A(GenBank登录号:FJ011668)和DNA-B(GenBank登录号:FJ011669)的相一致性最高,为93.9%和89.6%。GS-2021与ClGMCNV福建、浙江、江苏和美国的5个分离物亲缘关系近,同属一个分支,其中与福建Fz7分离物聚集在一个小分支,亲缘关系最近。基因重组分析显示,GS-2021无明显的基因重组事件存在。根据ICTV对菜豆金色黄花叶病毒属病毒最新分类标准,GS-2021属ClGMCNV的一个新株系。本研究首次在构树上检测到菜豆金色花叶病毒属病毒,获得其病毒基因组全序列,明确其为ClGMCNV的新株系。因此,构树是菜豆金色黄花叶病毒属病毒的新自然寄主。

关键词：构树菜豆金色黄花叶病毒属中国大青金色花叶病毒病毒基因组新寄主

创新植保科技,服务南粤大地——广东省农业科学院植物保护研究所建所五十周年记

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植物保护学报 2023年第5期50卷 1109-1112页

作者：何自福高燕隋晶晶广东省农业科学院植物保护研究所农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

广东省农业科学院植物保护研究所成立于1973年8月,是广东省农业科学院下属15个研究机构之一,为省属公益一类事业单位。前身可追溯到1950年1月成立的华南区农业推广繁殖站石牌试验场病虫害组及1960年1月成立的广东省农业科学院植物保护... 详细信息

广东省农业科学院植物保护研究所成立于1973年8月,是广东省农业科学院下属15个研究机构之一,为省属公益一类事业单位。前身可追溯到1950年1月成立的华南区农业推广繁殖站石牌试验场病虫害组及1960年1月成立的广东省农业科学院植物保护系。在50年的发展历程中,研究所持续为广东省农业生产安全和农作物健康保驾护航。

关键词：植物保护研究植保科技农业推广农业生产安全广东省农业科学院华南区发展历程

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广东香葱炭疽病病原菌鉴定

园艺学报 2022年第1期49卷 129-140页

作者：于琳佘小漫汤亚飞蓝国兵李正刚何自福广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

为明确广东香葱炭疽病的病原菌种类,在广东省香葱主要产区惠州市和韶关市采集香葱炭疽病疑似病株,分离、纯化病原菌;通过病原菌分生孢子悬液接种活体香葱植株和离体植株叶片,柯赫氏法则验证,明确病原菌的致病性;通过观察病原菌的形态特... 详细信息

为明确广东香葱炭疽病的病原菌种类,在广东省香葱主要产区惠州市和韶关市采集香葱炭疽病疑似病株,分离、纯化病原菌;通过病原菌分生孢子悬液接种活体香葱植株和离体植株叶片,柯赫氏法则验证,明确病原菌的致病性;通过观察病原菌的形态特征,结合其核糖体内转录间隔区(ITS)、肌动蛋白(ACT)、几丁质合成酶1 (CHS1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和β微管蛋白(TUB2)基因部分序列的多基因分子系统学分析等方法,确定病原菌的分类地位。从病样中分离获得23个形态特征相似的单分生孢子分离物。致病性人工接种结果表明,供试菌株分生孢子在20和25℃下均可侵染香葱产生与田间相似的炭疽病症状,老叶较嫩叶更易感病。20℃在PDA培养基上,供试菌株菌落呈灰色,菌丝生长速度较快;25和28℃菌丝生长较慢,菌落呈花瓣状;后期在菌落表面形成橘红色分生孢子堆。分生孢子梗透明,顶端簇生分生孢子;分生孢子透明,单细胞,微弯,大小13.1~19.6μm×3.2~3.9μm。附着胞深棕色,形状不规则,大小11.7~25.5μm×5.0~14.3μm;刚毛深棕色至浅棕色,基部膨大,顶端尖或圆滑,长为44.5μm×106.4μm。这些形态特征与白蜡树刺盘孢(Colletotrichum spaethianum)基本一致。供试菌株的ITS、ACT、CHS1、GAPDH和TUB2基因序列与白蜡树刺盘孢模式菌株CBS167.49对应基因序列的一致性为99.46%~100%。系统发育树显示,该菌株与白蜡树刺盘孢的3个菌株单独聚成一支。明确了广东香葱炭疽病的病原菌为白蜡树刺盘孢,这是白蜡树刺盘孢侵染香葱引起香葱炭疽病的首次报道。

关键词：香葱炭疽病白蜡树刺盘孢病原鉴定

侵染萝卜的油菜花叶病毒广东分离物分子特征及其致病性分析

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中国农业科学 2022年第14期55卷 2752-2761页

作者：李正刚汤亚飞佘小漫于琳蓝国兵何自福广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】病毒病是萝卜（Raphanus sativus）生产上的主要病害之一，严重危害萝卜生产安全及产业发展。本研究旨在鉴定侵染广东萝卜的病毒种类，探究侵染萝卜的油菜花叶病毒（youcai mosaic virus,YoMV）分子特征及致病性，为萝卜病毒病... 详细信息

【目的】病毒病是萝卜（Raphanus sativus）生产上的主要病害之一，严重危害萝卜生产安全及产业发展。本研究旨在鉴定侵染广东萝卜的病毒种类，探究侵染萝卜的油菜花叶病毒（youcai mosaic virus,YoMV）分子特征及致病性，为萝卜病毒病的防控提供科学依据。【方法】从广东省惠州市萝卜种植基地采集了3个疑似病毒病侵染的萝卜病样及1个无症状样品，提取样品总RNA，利用小RNA深度测序初步探明病毒种类，然后根据测序结果设计病毒特异引物进行RT-PCR验证。应用分段克隆方法扩增病原病毒YoMV基因组1—3 405 nt片段和3 194—6 304 nt片段，然后通过同源重组克隆到p CB301双元载体上，得到YoMV-GD分离物基因组全长序列，同时构建该病毒分离物的侵染性克隆。利用MEGA7软件对YoMV-GD及其他分离物全长核苷酸序列进行系统进化分析。通过侵染性克隆人工注射接种本生烟和普通烟，检验pCB301-YoMV-GD的侵染性，然后再注射接种萝卜和菜心，测定YoMV-GD分离物的致病性。【结果】侵染广东萝卜的病毒包含萝卜隐状病毒3(Raphanus sativus cryptic virus 3,RsCV3)、萝卜黄病毒1(Raphanus sativus chrysovirus 1,RasCV1)、芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus,TuMV）、YoMV 4种；YoMV-GD分离物全长序列为6 304 nt，编码4个蛋白，分别为124.7 kD复制相关蛋白、183 kD复制酶、30 kD运动蛋白MP、17.7 kD外壳蛋白CP，与YoMV英国分离物（GenBank登录号：AY318866）核苷酸相似性最高，为99.18%;YoMV-GD分离物与英国、德国及我国上海、重庆分离物的亲缘关系较近；构建的侵染性克隆pCB301-YoMV-GD可以系统侵染本生烟和普通烟，引起严重的坏死、枯斑等症状，具有较强的侵染性；YoMV-GD可以系统侵染萝卜和菜心，引起轻微的黄化和花叶等症状，致病力较弱。【结论】侵染广东萝卜的病毒包含RsCV3、RasCV1、TuMV和YoMV，且以复合侵染形式存在；YoMV遗传进化并没有明显的地域性；YoMV-GD对烟草致病力较强，而对萝卜和菜心致病力较弱。

关键词：萝卜病毒病油菜花叶病毒分子特征侵染性克隆致病性

假茄科雷尔氏菌菌株RSCM的全基因组测序及基因组比较分析

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植物保护学报 2023年第5期50卷 1137-1149页

作者：丁善文马紫君蓝国兵汤亚飞何自福佘小漫广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室广州510640

为丰富假茄科雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum基因组数据库并探索其致病机理,以前期从南瓜上分离的菌株RSCM为研究对象,采用第二代Illumina平台与第三代PacBio平台相结合的测序技术对其进行全基因组测序,利用SMRT Link、Arrow和eg... 详细信息

为丰富假茄科雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum基因组数据库并探索其致病机理,以前期从南瓜上分离的菌株RSCM为研究对象,采用第二代Illumina平台与第三代PacBio平台相结合的测序技术对其进行全基因组测序,利用SMRT Link、Arrow和eggNOG等软件对测序得到的原始数据进行组装、拼接和注释,并通过比较基因组方法分析其与菌株GMI1000的差异。结果表明,菌株RSCM基因组大小约为6000712 bp,由3788542 bp的环形染色体和2212170 bp的环形宏质粒组成,含有5047个编码基因,其中分别有3579、4240、3171个基因获得GO、COG和KEGG数据库的注释;在菌株RSCM基因组中预测到58个tRNA、4个5S rRNA、4个16S rRNA、4个23S r RNA和4个ncRNA,含有5个前噬菌体序列和35个基因组岛。ANI分析发现研究对象与菌株GMI1000的亲缘性最近,ANI值为99.0%;基因组对比分析结果显示,与菌株GMI1000相比,菌株RSCM中存在易位、倒置、易位兼倒置的基因有571个;缺失1个Ⅱ型分泌系统的基因簇Cluster-3;且包含RipS8、RipAL、RipAP、RipAT、RipBA、RipBE、RipBM和RS_T3E_Hyp14八个特有的Ⅲ型效应蛋白。对RipBA效应蛋白进行鉴定分析,发现其具有1个糖基化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点和2个豆蔻酰化位点;RT-qPCR检测发现,在菌株RSCM侵染寄主过程中RipBA基因显著上调表达。表明菌株RSCM与菌株GMI1000的基因组存在差异,推测其可能与假茄科雷尔氏菌的寄主适应性和致病性有关。

关键词：假茄科雷尔氏菌全基因组测序比较基因组分析特异基因

木尔坦棉花曲叶病毒RPA快速检测方法的建立

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植物保护 2022年第1期48卷 163-167,197页

作者：汤亚飞李正刚佘小漫于琳蓝国兵何自福广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

木尔坦棉花曲叶病毒Cotton leaf curl Multan virus(CLCuMuV)引起的病害是世界棉花生产上的毁灭性灾害,也是我国进境植物检疫性有害生物之一。因此,建立快速检测技术对CLCuMuV的检疫和防控具有重要意义。本研究根据CLCuMuV外壳蛋白(CP)... 详细信息

木尔坦棉花曲叶病毒Cotton leaf curl Multan virus(CLCuMuV)引起的病害是世界棉花生产上的毁灭性灾害,也是我国进境植物检疫性有害生物之一。因此,建立快速检测技术对CLCuMuV的检疫和防控具有重要意义。本研究根据CLCuMuV外壳蛋白(CP)基因序列设计引物,建立了该病毒的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法,并评价了该方法的灵敏度和特异性,进一步测定了对田间疑似病样的检测准确性。结果表明,建立的RPA检测方法仅能从感染CLCuMuV的样品中扩增出目的条带,而感染同属的其他5种病毒的样品中未扩增出目的条带。该方法检测灵敏度是常规PCR的10倍,且对田间疑似病样的检出结果与PCR试验结果一致。因此,本研究所建立的CLCuMuV RPA快速检测方法具有特异、灵敏、准确、操作简便、无需特殊设备等优点,这些为CLCuMuV的快速检测提供了一种新技术。

关键词：木尔坦棉花曲叶病毒 RPA 快速检测

假茄科雷尔氏菌引起向日葵青枯病在中国的首次报道

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植物保护 2023年第2期49卷 243-249页

作者：佘小漫李萍蓝国兵于琳李正刚汤亚飞何自福广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

茄科雷尔氏菌复合种侵染引起的青枯病是众多作物上的毁灭性病害。2020年笔者首次在广东省东莞市发现向日葵青枯病,并对其病原菌进行了鉴定。室内人工接种试验、16S rDNA序列比对和演化型鉴定结果表明,引起向日葵青枯病的病原菌为假茄科... 详细信息

茄科雷尔氏菌复合种侵染引起的青枯病是众多作物上的毁灭性病害。2020年笔者首次在广东省东莞市发现向日葵青枯病,并对其病原菌进行了鉴定。室内人工接种试验、16S rDNA序列比对和演化型鉴定结果表明,引起向日葵青枯病的病原菌为假茄科雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum。生理生化特性和致病性鉴定结果表明,分离自向日葵的15株假茄科雷尔氏菌为1号生理小种和生化变种3。egl基因部分序列系统进化分析表明,15株假茄科雷尔氏菌分属4个序列变种,其中8株菌株为序列变种17,5株菌株为序列变种13,其余2株菌株分别为序列变种14和序列变种54。本文是我国首次报道假茄科雷尔氏菌侵染引起向日葵青枯病。

关键词：向日葵假茄科雷尔氏菌致病性分子鉴定序列变种