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免疫卡控点分子PD-1单抗联合细胞因子IL-33介导抗肿瘤免疫应答的效应机制的研究

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免疫卡控点分子PD-1单抗联合细胞因子IL-33介导抗肿瘤免疫应答的...

作者：何红红苏州大学

学位级别：硕士

肿瘤微环境是机体肿瘤细胞发生、生长及转移的内环境,由肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞、各种胶质细胞以及其邻近区域的细胞间质、新生血管和各种生物分子组成。错综复杂的肿瘤微环境产生的炎症特性有利于肿瘤细胞的生长、转移和新生... 详细信息

肿瘤微环境是机体肿瘤细胞发生、生长及转移的内环境,由肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞、各种胶质细胞以及其邻近区域的细胞间质、新生血管和各种生物分子组成。错综复杂的肿瘤微环境产生的炎症特性有利于肿瘤细胞的生长、转移和新生血管的生成等,促使恶性肿瘤的产生与发展。免疫细胞在肿瘤微环境的增殖、浸润及其功能的发挥是机体抗肿瘤免疫应答的基础,其中以CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),CD4+辅助性T淋巴细胞(Th)的浸润为主。浸润的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞通过分泌多种效应分子如IFN-γ、perforin等发挥抗肿瘤免疫应答,与患者的预后密切相关。但是机体肿瘤微环境中复杂的负性调控机制,如免疫卡控点分子PD-1、PD-L1、CTLA-4、Tim-3等分子在肿瘤细胞和微环境中免疫细胞的表达使肿瘤浸润CD4+Th1、CD8+CTLs功能耗竭,处于无能状态,不能很好地对肿瘤细胞实行免疫监视和杀伤效应。因此,改变肿瘤微环境的免疫抑制状态,重新活化浸润的免疫细胞,逆转耗竭无能的状态,成为当前肿瘤免疫治疗的热点话题。PD-1/PD-L1负性免疫卡控点分子在肿瘤免疫治疗的研究是国内外热点话题。在肿瘤微环境中,PD-1/PD-L1以受体/配体形式结合,通过抑制淋巴细胞的活化和增殖,使淋巴细胞功能耗竭,产生IL-10等免疫抑制性分子,并导致肿瘤特异性T淋巴细胞发生凋亡,诱导初始CD4+T细胞向Foxp3+Treg细胞方向分化,产生免疫抑制,从而使得肿瘤细胞逃避机体的免疫监视。因此,近年来,许多临床试验运用PD-1/PD-L1抗体抑制剂阻断性疗法,恢复耗竭淋巴细胞的效应功能,使其重新刺激活化产生抗肿瘤免疫应答疗效。目前,多项临床研究试验均已表明,抗PD-1/PD-L1疗法能够逆转处于晚期及转移性肿瘤的状态,显著提高肿瘤患者的生存率。该疗法效果持久,一旦有效不容易耐受,对多种实体瘤均有显著疗效。虽然PD-1/PD-L1抗体单一疗法已显示出比较显著的疗效,但是其仅对部分患者表现出临床效应,有效率在20%左右,部分患者对该疗法效果不显著甚至无效。因此,寻找一种PD-1抗体的联合疗法已成为至关重要的问题。细胞因子白细胞介素33(IL-33)是1999年被首次发现的分子量为30k Da的蛋白,起初被称为“高内皮微静脉核因子”,后于2005年经Schmitz等科学家发现并证实IL-33是IL-1家族的新型成员,其受体是ST2和IL-1受体辅助蛋白组成的二聚体。最初的文献报道,IL-33/ST2主要参与Th2型炎症、抗病毒免疫应答的过程。而后的研究表明,IL-33/ST2通路也可以促进Th1型免疫应答,增强抗原特异性CD8+T细胞的功能,在抗肿瘤应答过程中具有重要的效应功能。基于本课题组前期的研究,IL-33协同TCR信号和白介素12(IL-12),能够体外刺激活化CD4+/CD8+T淋巴细胞,促进其分泌IFN-γ,并且在荷瘤小鼠模型中,肿瘤微环境中IL-33的表达能够增加T淋巴细胞的浸润,增强其分泌IFN-γ的能力,显著抑制肿瘤的生长及转移。因此,本课题旨在借助荷瘤小鼠模型,探讨PD-1单克隆抗体与细胞因子IL-33联合应用,观察肿瘤的生长及小鼠的生存情况,进一步分析PD-1单克隆抗体联合细胞因子IL-33介导肿瘤微环境中抗肿瘤免疫应答的机制,以期为临床肿瘤免疫治疗提供新的策略和思路。【目的】探讨PD-1免疫卡控点分子阻断性疗法联合细胞因子白细胞介素33(IL-33)对荷瘤小鼠肿瘤的生长及小鼠生存期的影响及其可能的机制。【方法】1、于Humanized PD-1 KI/KO小鼠腹部外侧接种2×105 B16或B16-IL33肿瘤细胞,构建黑色素瘤小鼠模型,于肿瘤细胞接种的第5天开始,每隔4天在肿瘤生长对侧腹腔注射Ig G或人源化(Humanized)PD-1 m Ab 200?g/100?l,共治疗4次,观察荷瘤小鼠肿瘤生长与生存情况,绘制肿瘤的生长曲线与生存曲线;2、在肿瘤生长早期(二次治疗后)、中晚期(四次治疗后)、晚期,经免疫荧光标记技术、流式细胞术来检测肿瘤微环境CD45+细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的浸润以及各免疫细胞亚群IFN-γ、Foxp3、Ki-67等的表达与分泌;3、采用Real-time PCR在m RNA水平检测IFN-γ、GZ-B、perforin等的表达;4、经免疫荧光技术(immunofluorescence)观察肿瘤组织(frozen section)CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的浸润。【结果】1、PD-1 m Ab阻断联合细胞因子IL-33在B16小鼠肿瘤模型中显著抑制肿瘤生长,差异具有统计学意义,且与PD-1单抗单一疗法相比,差异更显著,P<0.05;2、PD-1 m Ab阻断联合细胞因子IL-

关键词：免疫卡控点 PD-1 白细胞介素33(IL-33) 干扰素-γ 颗粒酶B Humanized PD-1KI/KO小鼠肿瘤免疫治疗

上海市《小学低年段英语学科基于课程标准评价指南》（试行稿）文本研究

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上海市《小学低年段英语学科基于课程标准评价指南》（试行稿）文...

作者：何红红上海师范大学

学位级别：硕士

在倡导素质教育的今天,教学越来越重视过程性的评价,随着我国与国际的接轨,英语已经日益受到重视,尤其是在发达地区。如上海市从小学一年级起就开设了英语课程,小学低年段的英语评价就更显重要,因此,上海市出台了《小学低年段英语学科... 详细信息

在倡导素质教育的今天,教学越来越重视过程性的评价,随着我国与国际的接轨,英语已经日益受到重视,尤其是在发达地区。如上海市从小学一年级起就开设了英语课程,小学低年段的英语评价就更显重要,因此,上海市出台了《小学低年段英语学科基于课程标准评价指南》(试行稿),以下简称《评价指南》。然而,并不是每一位教师都能正确地理解和应用该指南,其内容也存在着一些问题。鉴于其对教学的重要性及其目前存在的问题,本文通过对其文本的分析和对一线教师的实证调查来展开研究,旨在帮助一线教师更好地理解该指南的内容,进而更好的实施教学评价,同时也希望本文能给指南提出一些修改的建议,使《评价指南》更加完善,从而更好地指导教师。本文的主要内容包括五个部分。第一章是引言部分,介绍了本文的选题依据、论文的研究目的、研究意义、研究内容、研究思路和研究方法,并综合分析了国内外关于英语评价的研究现状,为本文的研究提供参考和借鉴。第二章是核心概念的界定和理论基础,对英语评价指南的设计提出了一些要求,具体体现在设计原则和各个评价维度与评价指标的分类及表述上。设计原则有针对性原则、一致性原则、发展性原则和可操作性原则。这些要求为英语评价指南内容的设计提供了理论依据。第三章是对《评价指南》的文本分析,先介绍了文件的出台背景,再用一张思维导图呈现了《评价指南》的内容概要。然后根据第二章的设计要求对指南的文本内容进行了具体分析。第四章是对《评价指南》实施现状的分析,首先说明了调查目的和方法以及调查对象的情况,然后基于英语评价的相关理论和研究现状,对问卷调查和访谈的结果进行分析研究,最终得出了《评价指南》在一线教师中的实施情况以及教师对该指南的看法和意见。第五章则是在分析该指南的文本及其实施情况的基础上,结合国内外研究现状,提出了对《评价指南》的修改建议:(1)具体地表述指标;(2)清晰地描述评价基准;(3)分层设计评价标准;(4)恰当地选择评价案例;(5)细致地说明评价方式;(6)提出评价的预期效果。

关键词：小学低年段英语评价指南实施现状改进建议

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分治法重建数字地形的子网凸包合并算法

清华大学学报（自然科学版） 2015年第8期55卷 895-899,905页

作者：郑辑涛何红红张涛朱纪洪清华大学计算机科学与技术系北京100084 北京航空气象研究所北京100085

该文深入研究了以往基于分治策略的数字地形重建方法,在实践基础上分析了参与合并的两个子网凸包的各种可能情况,针对传统合并算法的局限性和弊端,给出了一个子网凸包合并算法。该算法根据公共支撑线的性质,通过判断凸包顶点投影位置的... 详细信息

该文深入研究了以往基于分治策略的数字地形重建方法,在实践基础上分析了参与合并的两个子网凸包的各种可能情况,针对传统合并算法的局限性和弊端,给出了一个子网凸包合并算法。该算法根据公共支撑线的性质,通过判断凸包顶点投影位置的关系确定公共支撑线和支撑点,然后在确保合理的前提下,在两个凸包之间交替生成新三角形完成两子网凸包的合并。实验结果表明:该算法稳定可靠,能够实现各种复杂情况下两子网凸包的成功合并。

关键词：子网凸包合并数字地形重建

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不规则三角网中约束线嵌入

清华大学学报（自然科学版） 2014年第12期54卷 1555-1559页

作者：郑辑涛张涛何红红朱纪洪清华大学计算机科学与技术系北京100084 空军装备研究院航空气象防化研究所北京100085

该文针对有约束情况下的不规则三角网重建,分析了约束线影响域的各种典型情况,在此基础上提出了一种约束线嵌入方法。该方法首先搜索约束线影响域,提取影响域的边界,根据凹凸性判断找到影响域边界上的凸角,并在凸角处生成新的三角形,通... 详细信息

该文针对有约束情况下的不规则三角网重建,分析了约束线影响域的各种典型情况,在此基础上提出了一种约束线嵌入方法。该方法首先搜索约束线影响域,提取影响域的边界,根据凹凸性判断找到影响域边界上的凸角,并在凸角处生成新的三角形,通过对影响域的重剖分完成约束线的嵌入。同时给出了详细算法流程并进行了实验,结果表明:该算法鲁棒稳定,能够实现各种复杂约束情况下的不规则三角网重建。

关键词：不规则三角网约束线嵌入凹凸性

氟尿嘧啶代谢相关酶（TS、DPD及TP）在小肠腺癌中的表达及预后分析

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氟尿嘧啶代谢相关酶（TS、DPD及TP）在小肠腺癌中的表达及预后分析

作者：何红红南昌大学

学位级别：硕士

目的:1.探讨不同部位原发性小肠腺癌(十二指肠腺癌、空回肠腺癌)的临床病理学特征及预后。2.探讨胸苷酸合成酶(Thymidiylate synthase,TS)、二氢嘧啶脱氢酶(Dihydropyrimidine dehydrogenase,DPD)及胸苷酸磷酸化酶(Thymidine phosphorylase,TP)在小肠腺癌中的表达及其与临床病理学特征及预后的关系。方法:1.收集2007年8月至2010年12月在我院行根治性外科切除术、术后接受以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)为基础方案的辅助化疗、并具有完整随访资料的II-III期小肠腺癌患者66例;分析十二指肠腺癌、空回肠腺癌的临床病理学特征差异及预后差异。2.获得术后蜡块组织,选择15例癌旁正常粘膜组织作为阴性对照,应用免疫组化法检测癌组织及癌旁正常粘膜组织中TS、DPD、TP的表达。采用卡方检验分析:TS、DPD及TP在癌组织与癌旁组织中的表达差异;TS、DPD及TP在十二指肠腺癌与空回肠腺癌组织中的表达差异;肿瘤组织TS、DPD及TP的表达与临床病理学特征的关系。3.采用Kaplan-Meier法描绘生存曲线。单因素分析各临床病理学特征、5-FU代谢相关酶与小肠腺癌根治术后5年无病生存期(Disease free survival,DFS)、5年总生存期(Overall survival,OS)的关系;COX比例风险模型纳入有意义的单因素,获得小肠腺癌根治术后5年DFS及5年OS的独立预后因子。结果:1、共入组小肠腺癌患者66例,其中十二指肠腺癌比例最高,腹痛、腹胀为最常见的临床表现(84.8%),但误诊率高达68.2%,其中误诊为胆总管结石者最常见(34.8%)。十二指肠腺癌、空回肠腺癌的病理分化程度及大体类型存在统计学差异:低分化的空回肠腺癌比例高于十二指肠腺癌(88.9%vs29.8%,p=0.001);大体类型为溃疡型、浸润型、缩窄型的空回肠腺癌比例高于十二指肠腺癌(分别为44.4%vs 33.3%、33.3%vs 8.8%、22.2%vs 7.1%,p=0.023)。十二指肠腺癌与空回肠腺癌的5年DFS及5年OS均存在统计学差异,十二指肠腺癌的5年DFS、5年OS均优于空回肠腺癌(5年DFS:38.6%vs 11.1%,p=0.028;5年OS:47.4%vs 22.2%,p=0.032)。2、TS、DPD及TP表达在癌组织与癌旁正常粘膜组织间的差异均存在统计学意义,小肠腺癌组织中TS、DPD及TP的阳性率均高于癌旁正常肠粘膜组织(TS:53.0%vs 20.0%,p=0.024;DPD:72.7%vs 26.7%,p=0.002;TP:59.1%vs 26.7%,p=0.042)。TP表达在十二指肠腺癌组织与空回肠腺癌组织间存在统计学差异,前者的TP阳性率高于后者(66.7%vs 22.2%,p=0.026);而TS及DPD表达在两者间的差异无统计学意义(p>0.05)。TS表达与是否伴神经脉管浸润有关,伴有神经脉管浸润的小肠腺癌TS阳性率高于无神经脉管浸润组(100%vs36.7%,p=0.000)。DPD表达与组织分化程度有关,低分化小肠腺癌的DPD阳性率高于高、中分化组(88%vs 63.4%,p=0.045)。3、单因素生存分析结果显示,年龄、分化程度、大体类型、淋巴结转移、TNM分期、TS表达与5年DFS均存在统计学差异:年龄≥55岁的患者5年DFS劣于年龄<55岁患者(14.3%vs 32.7%,p=0.000);低分化患者的5年DFS劣于高、中分化患者(8%vs 51.2%,p=0.000);肿瘤大体类型为隆起型的患者5年DFS最优(p=0.006);无淋巴结转移患者的5年DFS优于伴淋巴结转移患者(48.6%vs 17.2%,p=0.002);II期小肠腺癌患者的5年DFS优于III期患者(48.6%vs 17.2%,p=0.002);TS阴性表达患者的5年DFS优于TS阳性表达患者(41.9%vs 28.6%,p=0.017)。多因素回归分析结果显示:高龄及TS阳性表达为小肠腺癌根治术后5年DFS的独立预后不良因素(年龄:p=0.000,HR=0.251;TS:p=0.003,HR=2.660)。年龄、分化程度、大体类型、淋巴结转移、TNM分期、TS表达与5年OS亦存在统计学差异:年龄≥55岁的患者5年OS劣于年龄<55岁患者(17.1%vs41.8%,p=0.000);低分化患者的5年OS劣于高、中分化患者(20%vs 58.5%,p=0.000);肿瘤大体类型为隆起型的患者5年OS最优(p=0.007);无淋巴结转移患者的5年OS优于伴淋巴结转移患者(51.4%vs 34.5%,p=0.005);II期小肠

关键词：腺癌小肠肿瘤氟尿嘧啶 TS DPD TP 预后

葡萄赤霉素氧化酶基因GA2ox、GA3ox和GA20ox家族的鉴定与GA2ox7的耐盐性功能分析

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葡萄赤霉素氧化酶基因GA2ox、GA3ox和GA20ox家族的鉴定与GA2ox7的...

作者：何红红甘肃农业大学

学位级别：硕士

盐胁迫对我国西北地区的农作物栽培和生产造成的影响很大。对于植物耐盐机理的研究在不断的深入,尤其是鉴定和挖掘耐盐性相关基因的研究已经成为目前生物学研究的重点之一。赤霉素参与植物的各种非生物胁迫响应,并且外源施加GA能够提高... 详细信息

盐胁迫对我国西北地区的农作物栽培和生产造成的影响很大。对于植物耐盐机理的研究在不断的深入,尤其是鉴定和挖掘耐盐性相关基因的研究已经成为目前生物学研究的重点之一。赤霉素参与植物的各种非生物胁迫响应,并且外源施加GA能够提高植株对盐胁迫的耐受性。赤霉素氧化酶基因GA2ox、GA3ox和GA20ox已经在一些模式植物中被研究具有提高植株的耐盐胁迫能力,因此本文以葡萄为研究对象,通过生物信息学方法对葡萄赤霉素氧化酶基因GA2ox、GA3ox和GA20ox进行鉴定和定量表达分析。对筛选得到的耐盐性基因GA2ox7进行拟南芥异源转化,并分析该基因的耐盐性功能。主要取得以下研究结果:1.本文通过生物信息学方法鉴定出24个葡萄赤霉素氧化酶家族成员,根据其基因识别号(ID)的先后顺序被命名为Vv GA2ox1-Vv GA2ox11、Vv GA3ox1-Vv GA3ox6和Vv GA20ox1-Vv GA20ox7。理化性质分析发现,葡萄GA2ox、GA3ox和GA20ox基因分子量、等电点、CDS序列大小都存在较大差异,该家族成员在细胞核、细胞质和叶绿体中定位数量最多。根据系统发育树、基因结构和motif基序可将该家族成员分为7个亚组。2.葡萄GA2ox、GA3ox和GA20ox基因家族启动子分子结果发现,该家族基因的启动子元件主要有各种激素响应元件,如ABA,GA,Me JA响应元件。此外,还有许多基因含有非生物胁迫元件,如低温、干旱、盐分等胁迫响应元件。葡萄转录组数据中该家族基因在非生物胁迫下的表达分析结果发现,不同时长的ABA、Na Cl、PEG和5℃处理下,大多数Vv GA2ox、Vv GA3ox和Vv GA20ox基因都有较高的表达。葡萄组织表达分析表明,Vv GA2ox和Vv GA20ox在葡萄不同发育阶段的不同组织中的表达水平均高于Vv GA3ox。最后,通过q RT-PCR检测GA和烯效唑处理下GA2ox、GA3ox和GA20ox基因家族的相对表达量,发现GA处理下部分Vv GA2oxs基因被上调表达。同时,烯效唑使得部分Vv GA3ox和Vv GA20ox基因被上调表达。其中,在盐胁迫和外源GA处理下,Vv GA2ox7的表达量最高。3.克隆获得葡萄GA2ox7基因,CDS长度为100 2 bp,对应氨基酸数目为334,是亲水性蛋白。构建亚细胞定位载体p BI221-GA2ox7-EGFP来验证亚细胞预测结果,结果表明GA2ox7蛋白定位在细胞核和细胞质中。成功构建过表达载体p CAM-GA2ox7-FLAG,并将该基因成功转化到拟南芥中。通过测定Na Cl或Na Cl+GA处理后转基因拟南芥叶片中各种生理指标和抗氧化酶活性,发现转基因拟南芥叶片中电导率、丙二醛、HO呈现出先保持不变或下降后上升的趋势,叶绿素和脯氨酸含量先上升后下降的趋势,POD、SOD、CAT活性呈现出先上升后下降的趋势,8 h处理时间是一个重要的转折点,并且在Na Cl+GA共同处理下这些生理指标变化更明显。测定耐盐性相关基因和开花调控基因的表达量,结果表明在转基因拟南芥中,耐盐相关基因KAT1、APX1、LEA、P5CS1、AVP1、CBF1均被上调表达;此外,转基因拟南芥中抑花基因FLC被上调表达,而促花基因FT被下调表达。盐胁迫条件下,测定转基因拟南芥中GA和ABA含量,结果表明在转基因拟南芥中GA含量明显减少,而ABA含量明显增加。这些研究结果表明GA2ox7的异源表达能够增强转基因拟南芥的耐盐性。

关键词：葡萄 GAoxs基因家族基因复制 qRT-PCR 功能分析