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猪链球菌2型毒力相关因子lin0523基因的克隆表达与功能研究

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猪链球菌2型毒力相关因子lin0523基因的克隆表达与功能研究

作者：何永聚吉林大学

学位级别：硕士

猪链球菌是一种有荚膜的、革兰氏阳性球菌。按照荚膜多糖可将其分成35个荚膜血清型，即1-34和1/2型，其中猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2，***2）流行最广，致病力最强，主要引起猪心内膜炎、关节炎、脑膜炎、败血症和突然... 详细信息

猪链球菌是一种有荚膜的、革兰氏阳性球菌。按照荚膜多糖可将其分成35个荚膜血清型，即1-34和1/2型，其中猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2，***2）流行最广，致病力最强，主要引起猪心内膜炎、关节炎、脑膜炎、败血症和突然死亡等，还可以感染人并导致死亡，它是一种重要的人兽共患传染病病原体。 ***2已知的假定毒力因子主要包括荚膜多糖、黏附素、溶血素、溶菌酶释放蛋白、细胞外因子、IgG结合蛋白、谷氨酸脱氢酶、透明质酸酶以及细菌样抑制性物质等。然而研究发现，一些强毒菌株缺失掉这些毒力因子后，2型猪链球菌仍有毒力，或者一些无毒或弱毒菌株中也能检测到这些毒力因子的存在。因此有理由认为，在***2中可能还存在着很多结构与功能未知的毒力因子。为对***2的致病机理有更加深入的认识，很多实验室都对***2新毒力因子的研究给予很大的关注。在以往的研究中我们发现lin0523基因与***2的毒力密切相关，推测可能在***2的遗传衍化中起关键作用，进而影响***2的致病能力。迄今为止，关于lin0523基因在***2致病过程中的具体作用还不清楚。本研究首先对lin0523基因克隆表达，利用直链淀粉亲和层析的方法纯化重组蛋白，然后对LIN0523蛋白蛋白进行生物信息学分析、免疫学功能及免疫原性进行了初步研究。本研究通过PCR扩增了lin0523基因，并成功构建了重组表达质粒pMAL-p2x::lin0523;对蛋白表达条件进行了系统的优化，当OD600为0.5时、加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，28℃下诱导10h，可溶蛋白表达量最高，薄层扫描分析显示MBP-LIN0523占全菌可溶蛋白的27.4%。生物信息学预测显示，LIN0523蛋白的基本理化性质比较稳定，共有401个氨基酸组成，分子量为45.189KDa，理论等电点（PI）为9.06，理论分子式为C2057H3218N534O598S6;该蛋白在猪链球菌内的半衰期大于10h。平均疏水性分析显示约有一个峰值，位于100-150个氨基酸之间，预测LIN0523蛋白不含有跨膜区，有可能含有信号肽，亚细胞定位尚不清楚。二级结构预测显示180-220位、335-355位、380-399位氨基酸之间存在明显的α螺旋区。蛋白功能研究中发现，LIN0523蛋白的过表达对大肠杆菌重组菌的生长有明显的抑制作用，同时用***2ZY458（pAT18::sao-gfp-spc）与***2ZY458::△lin0523（pAT18::sao-gfp-spc）感染BALB/c小鼠，结果表明LIN0523蛋白的缺失，使***2在BALB/c小鼠体内的定居时间明显减短，在心、肝、脾、肺、肾等器官的载菌量减少。实验也研究了LIN0523蛋白对***2ZY458半数致死量的影响，***2ZY458缺少了LIN0523蛋白，***2ZY458的半数致死剂量明显增加，对体重13gBALB/c小鼠的LD50提高约了10倍。免疫保护性实验证明，LIN0523蛋白对致死剂量的***2有一定的保护作用。

关键词：猪链球菌2型 lin0523基因克隆表达功能研究

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猪链球菌2型新毒力相关基因的研究进展

中国生物制品学杂志 2011年第3期24卷 362-365,371页

作者：李鹏何永聚冯书章军事医学科学院军事兽医研究所长春130062

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,*** 2)是一种重要的人兽共患病原菌,其毒力因子在*** 2致病中的作用机制仍不明确,越来越多的学者开始寻找其他相关的毒力基因。本文对近几年来*** ***新毒力基因的研究进展作一综述。

关键词：链球菌,猪毒力因子类

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PRRSV对仔猪免疫力的影响

黑龙江畜牧兽医 2009年第1期 67-68页

作者：李玉保马飞孟喜龙王守山何永聚罗秀刚聊城大学农学院山东聊城252059

为了研究PRRSV对仔猪免疫力的影响,试验将13头46日龄的健康仔猪随机分A、B、C 3组,48日龄时A组猪进行滴鼻接种PRRSV LC毒株(TCID50为1×10-5.25/0.1 mL)3 mL头/,B组猪滴鼻接种未接毒正常细胞培养物3 mL头/;50日龄时A组、B组猪免疫猪瘟疫... 详细信息

为了研究PRRSV对仔猪免疫力的影响,试验将13头46日龄的健康仔猪随机分A、B、C 3组,48日龄时A组猪进行滴鼻接种PRRSV LC毒株(TCID50为1×10-5.25/0.1 mL)3 mL头/,B组猪滴鼻接种未接毒正常细胞培养物3 mL头/;50日龄时A组、B组猪免疫猪瘟疫苗4头份,C组猪肌肉注射生理盐水4 mL;免疫后1,7,14,21,28,35天利用ELISA和MTT等方法检测试验组猪猪瘟抗体水平和外周血T淋巴细胞转化率。结果表明,A组猪瘟抗体水平和T淋巴细胞转化率显著低于B组(P<0.05)有极显著的,说明PRRSV对仔猪免疫力有一定的抑制作用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 体液免疫细胞免疫

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CD4^+T细胞表位预测及其应用

安徽农业科学 2011年第17期39卷 10192-10193页

作者：李向阳张嘉保何永聚王景龙吉林大学农学部畜牧兽医学院吉林长春130062 内蒙古民族大学成人教育学院内蒙古通辽028043 吉林大学农学部实验动物中心吉林长春130062

目前,运用生物软件预测CD4+T细胞表位的技术越来越成熟,为表位疫苗的研究提供了有利的条件。对T细胞表位预测技术及其应用进行了综述。

关键词：生物信息学表位预测 CD4+T细胞

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猪链球菌2型新毒力基因研究进展

猪链球菌2型新毒力基因研究进展

中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会（第三届中国兽药大会学术论坛）

作者：李鹏刘军何永聚冯书章吉林大学畜牧兽医学院军事医学科学院军事兽医研究所

猪链球菌2型是一种重要的人兽共患病原菌,其毒力因子在*** 2致病中的作用机制仍不能确定,越来越多的学者开始寻找其他相关的毒力基因。本文对近几年来在发掘*** 2毒力基因方面的研究作一综述。

关键词：猪链球菌2型毒力基因

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猪链球菌2型新毒力基因研究进展

猪链球菌2型新毒力基因研究进展

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：李鹏刘军何永聚冯书章吉林大学畜牧兽医学院军事医学科学院军事兽医研究所

猪链球菌2型是一种重要的人兽共患病原菌,其毒力因子在***2致病中的作用机制仍不能确定,越来越多的学者开始寻找其他相关的毒力基因。本文对近几年来在发掘***2毒力基因方面的研究作一综述。

关键词：猪链球菌2型毒力基因

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布鲁氏菌S2株菌壳的制备研究

中国人兽共患病学报 2012年第7期28卷 679-682页

作者：刘爽刘军何永聚祝令伟孙洋周博纪雪冯书章军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130062

目的利用温控表达调节系统在布鲁氏菌中诱导表达裂解基因E,制备布鲁氏菌S2株菌壳,监测其裂解效率,并观察菌壳形态。方法从pBV220∶∶E中PCR扩增温控裂解盒和裂解基因E融合片段,克隆至pBBR1MCS-2载体上,构建重组裂解质粒pBBR1MCS-E,并将... 详细信息

目的利用温控表达调节系统在布鲁氏菌中诱导表达裂解基因E,制备布鲁氏菌S2株菌壳,监测其裂解效率,并观察菌壳形态。方法从pBV220∶∶E中PCR扩增温控裂解盒和裂解基因E融合片段,克隆至pBBR1MCS-2载体上,构建重组裂解质粒pBBR1MCS-E,并将其电转化至布鲁氏菌S2株,构建重组菌S2(pBBR1MCS-E)。通过28℃至42℃升温诱导培养制备布鲁氏菌菌壳,绘制生长曲线和裂解曲线,计算裂解率,并电镜观察菌壳形态。结果成功构建了重组裂解质粒pB-BR1MCS-E并制备了布鲁氏菌菌壳。绘制出了布鲁氏菌裂解曲线,布鲁氏菌菌壳的裂解率达99.99%,经高渗溶液冻融后可完全消除其中残存的活菌。电镜观察表明布鲁氏菌菌壳保持有细胞的基本形态,但由于细胞内容物外流而使细胞发生变形和皱缩。结论本研究成功制备出了布鲁氏菌菌壳,为进一步研究布鲁氏菌菌壳的特性奠定了基础。

关键词：布鲁氏菌菌壳裂解质粒

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猪链球菌2型毒力相关蛋白E的研究

猪链球菌2型毒力相关蛋白E的研究

中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会

作者：纪雪孙洋刘军祝令伟何永聚冯书章军事医学科学院军事兽医研究所

猪链球菌2型是一种重要的人兽共患病原菌,目前对其致病机理尚不清楚,且发现的毒力相关因子也为数甚少。本研究通过对*** 2强毒菌株和无毒菌株的生物信息学分析,发现了一个新的毒力相关基因,vapE（virulence-associated protein E）。为... 详细信息

猪链球菌2型是一种重要的人兽共患病原菌,目前对其致病机理尚不清楚,且发现的毒力相关因子也为数甚少。本研究通过对*** 2强毒菌株和无毒菌株的生物信息学分析,发现了一个新的毒力相关基因,vapE（virulence-associated protein E）。为研究其与毒力的相关性,我们利用温度敏感型穿梭自杀质粒pSET4s定点敲除*** 2野生型强毒株ZY458的vapE基因,构建了vapE基因缺失突变菌株458ΔvapE,并通过穿梭载体pAT18构建毒力回复互补菌株458ΔvapE（pvapE）。结果显示,接种野生株ZY458和毒力回复互补菌株458ΔvapE（pvapE）的BALB/c小鼠都出现明显的临床症状,ZY458感染组小鼠6/6死亡,458ΔvapE（pvapE）感染组小鼠5/6死亡,并且都能从各器官分离到细菌。而458ΔvapE感染组小鼠仅在感染初期出现少数临床症状,随后即恢复健康,在恢复小鼠各脏器分中分离不到细菌。试验证实,vapE基因缺失菌株毒力减弱,互补菌株的毒力恢复到野生菌株的水平。结果表明vapE基因是*** 2中新发现的一种毒力相关基因,可能在猪链球菌2型的分子衍化与毒力形成中起关键作用。

关键词：猪链球菌2型 vapE基因毒力因子

农牧副产物集成化快速处理与高值化利用新技术

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农牧副产物集成化快速处理与高值化利用新技术

2017第二届中国畜牧生物科技大会

作者：季伟峰何永聚韩文立李俐山东百德生物科技有限公司潍坊市农牧废弃物无害化处理及高值化利用技术研究中心

目前,我国农牧产业的可持续发展面临三大危机:资源短缺、环境污染、食品安全。我国每年畜禽粪污、病害动物尸体、屠宰下脚料、农副糟渣等农牧废弃物产生量巨大,因缺乏安全可靠的利用途径,在造成资源浪费的同时,导致了养殖面源污染问题...

目前,我国农牧产业的可持续发展面临三大危机:资源短缺、环境污染、食品安全。我国每年畜禽粪污、病害动物尸体、屠宰下脚料、农副糟渣等农牧废弃物产生量巨大,因缺乏安全可靠的利用途径,在造成资源浪费的同时,导致了养殖面源污染问题加剧和食品安全事故的频发。我国饲料原料,特别是蛋白质资源日益短缺。2010012年,我国饲料生产的增长幅度达到8%,远高于全球水平的1%。我国蛋白饲料资

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