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miR-134通过下调叉头盒蛋白M1抑制肝细胞癌细胞增殖

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第三军医大学学报 2017年第1期39卷 1-8页

作者：姜珊熊浩君何家琳李波杨帆杨腾张艳何凤田第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室重庆400038

目的探讨miR-134下调叉头盒蛋白M1(forkhead box M1,FOXM1)的机制及其影响肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞增殖的作用。方法应用CCK-8法检测miR-134对HCC细胞增殖的作用;经Western blot和Real-time PCR检测人正常肝细胞L02和5种HCC细胞系中FOXM1和miR-134的表达;用miR-134模拟物(miR-134 mimic)或miR-134抑制剂(miR-134 inhibitor)转染HCC细胞后,经Western blot和Real-time PCR检测FOXM1及其下游靶基因Cyclin D1的表达;应用生物信息学分析miR-134在人FOXM1 3'-UTR的可能结合位点,通过报告基因检测实验分析miR-134与FOXM1的3'-UTR的特异性结合;将miR-134 mimic和FOXM1表达质粒(无3'-UTR)共转染于HCC细胞后,经CCK-8法检测细胞的增殖情况。结果 miR-134可显著抑制HCC细胞增殖(P<0.05);与人正常肝细胞L02相比,miR-134在HCC细胞中的表达明显降低(P<0.05),而FOXM1蛋白表达明显增强,二者存在负相关(R2=0.705,P<0.05);miR-134可显著下调FOXM1蛋白及其下游靶基因Cyclin D1的表达(P<0.05);报告基因检测实验证实miR-134可特异性结合于FOXM1 mRNA的3'-UTR(P<0.01);细胞增殖实验检测结果显示,过表达缺失3'-UTR的FOXM1可显著减弱miR-134对HCC细胞增殖的抑制效应(P<0.05)。结论 miR-134通过靶向结合于FOXM1的3'-UTR而下调FOXM1蛋白的表达,从而抑制HCC细胞的增殖。

关键词：癌细胞增殖蛋白表达肝细胞癌 CyclinD1 HCC细胞 carcinoma CCK-8法人正常肝细胞

人可溶性增殖诱导配体cDNA突变体的设计与构建

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第三军医大学学报 2005年第10期27卷 948-950页

作者：高全胜黄复生何凤田第三军医大学基础医学部病原生物学教研室重庆400038 第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室重庆400038

目的　构建6种人可溶性增殖诱导配体(solubleaproliferation inducingligand ,sAPRIL)cDNA突变体。方法　采用PCR将可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)cDNA进行突变,并分别在其N端和C端连接TELTh表位序列,插入到pQE80表达载体上,最后转化至DH5... 详细信息

目的　构建6种人可溶性增殖诱导配体(solubleaproliferation inducingligand ,sAPRIL)cDNA突变体。方法　采用PCR将可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)cDNA进行突变,并分别在其N端和C端连接TELTh表位序列,插入到pQE80表达载体上,最后转化至DH5α感受态细胞。重组质粒经酶切鉴定后进行测序。结果　经PCR扩增分别得到了对应于6种突变体的sAPRIL序列,酶切和测序证实成功构建了含HELTh表位的sAPRILcDNA突变体表达质粒。结论　成功构建了6种sAPRILcDNA突变体的表达质粒,为进一步进行sAPRIL突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。

关键词： sAPRIL 突变体

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人TRAIL分子胞外区的纯化及活性检测

中国免疫学杂志 2003年第8期19卷 554-557页

作者：唐蓓何凤田蔡绍皙李蓉芬高会广陈姗周度金重庆大学生物力学与组织工程教育部重点实验室重庆400038 第三军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室重庆400038

目的 :利用大肠杆菌表达hTRAIL4 1～ 2 81 蛋白 ,并纯化复性成生物活性形式。方法 :以IPTG诱导表达 ,使用Ni NTA层析柱分离纯化蛋白 ,透析法复性 ,SDS PAGE和Westernblot法进行鉴定 ,DNA断裂实验检测hTRAIL4 1～ 2 81 蛋白的凋亡诱导活... 详细信息

目的 :利用大肠杆菌表达hTRAIL4 1～ 2 81 蛋白 ,并纯化复性成生物活性形式。方法 :以IPTG诱导表达 ,使用Ni NTA层析柱分离纯化蛋白 ,透析法复性 ,SDS PAGE和Westernblot法进行鉴定 ,DNA断裂实验检测hTRAIL4 1～ 2 81 蛋白的凋亡诱导活性。结果 :表达的蛋白以包涵体的形式存在 ,纯化后得到分子量为 30 5kD、纯度在 90 %以上的蛋白 ,Westernblot证实为hTRAIL4 1～ 2 81 分子。经复性 ,DNA断裂实验检测出该蛋白有较好的诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论 :成功地利用大肠杆菌表达、Ni NTA层析柱分离纯化、透析法复性hTRAIL4 1～ 2 81 蛋白 ,并证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性。

关键词： TRAIL 纯化活性检测大肠杆菌生物学活性

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IL－2Rγ研究现状

国外医学（免疫学分册） 1996年第2期19卷 65-69页

作者：何凤田重庆第三军医大学免疫学教研室

ＩＬ－２受体γ链（ＩＬ－２Ｒγ）为细胞因子受体超家族成员，是一分子量为６４ＫＤａ的膜蛋白。它是多种细胞因子受体的功能性组成单位，参与调控淋巴细胞的分化发育和成熟、Ｔ细胞致敏以及自身免疫耐受的形成等多种免疫学功能。ＩＬ... 详细信息

ＩＬ－２受体γ链（ＩＬ－２Ｒγ）为细胞因子受体超家族成员，是一分子量为６４ＫＤａ的膜蛋白。它是多种细胞因子受体的功能性组成单位，参与调控淋巴细胞的分化发育和成熟、Ｔ细胞致敏以及自身免疫耐受的形成等多种免疫学功能。ＩＬ－２Ｒγ基因突变可导致Ｘ染色休连锁的重症联合免疫缺陷（ＸＳＣＩＤ）等疾病。本文深入探讨了γ链的功能机制，这将有助于多种相关疾病的诊断与治疗。

关键词：白细胞介素 γ链分子特性 X-连锁联合免疫缺陷

α/β干扰素通过上调SARI表达抑制淋巴瘤细胞的增殖

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第三军医大学学报 2012年第24期34卷 2465-2468页

作者：黄英辉张立黄艳黄刚杨朝辉何谐钟丹何凤田第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室重庆400038

目的初步探讨α/β干扰素抑制淋巴瘤细胞增殖的分子机制。方法用IFN-α/β处理淋巴瘤细胞(Namalwa、JeKo-1)和白血病细胞(Jurkat、THP-1)24 h,CCK-8法检测IFN-α/β对上述细胞的增殖抑制效果;RT-PCR、real-time PCR、Western blot检测其... 详细信息

目的初步探讨α/β干扰素抑制淋巴瘤细胞增殖的分子机制。方法用IFN-α/β处理淋巴瘤细胞(Namalwa、JeKo-1)和白血病细胞(Jurkat、THP-1)24 h,CCK-8法检测IFN-α/β对上述细胞的增殖抑制效果;RT-PCR、real-time PCR、Western blot检测其SARI mRNA和蛋白水平的变化;对SARI基因启动子区的转录因子结合位点进行生物信息学预测。结果 IFN-α和IFN-β均可有效杀伤Namalwa和JeKo-1淋巴瘤细胞(P0.05);生物信息学分析显示,SARI启动子区含有转录因子STAT的结合位点。结论上调SARI表达可能是IFN-α/β抑制淋巴瘤细胞增殖的机制之一,而SARI的上调可能是由STAT介导的。

关键词：干扰素 SARI 淋巴瘤 STAT

层黏连蛋白α4链中αvβ3整合素结合肽的精细鉴定与功能分析

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第三军医大学学报 2010年第22期32卷 2370-2373页

作者：连继勤戴旭芳黄刚王喆何凤田第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室重庆400038 重庆师范大学教育科学学院重庆400038

目的利用点突变、缺失突变及功能实验确定αvβ3整合素在已鉴定人层黏连蛋白α4链(human laminin alpha4,LNα4)G19肽段中的最小结合位点及关键氨基酸残基。方法采用同源序列比较确定G19肽中的保守氨基酸残基,点突变确定其中的关键氨基... 详细信息

目的利用点突变、缺失突变及功能实验确定αvβ3整合素在已鉴定人层黏连蛋白α4链(human laminin alpha4,LNα4)G19肽段中的最小结合位点及关键氨基酸残基。方法采用同源序列比较确定G19肽中的保守氨基酸残基,点突变确定其中的关键氨基酸残基,缺失突变确定αvβ3整合素结合的最小肽段,并通过人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cells,HUVEC)管样结构形成实验及鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)实验验证鉴定肽的生物学功能。结果同源性比较分析发现,G19肽中共存在10个保守性氨基酸残基位点。点突变分析发现第4位的I、第10位的H及第16位的Y是αvβ3整合素结合的关键位点,缺失突变分析确定G1124-1137肽段(G14肽)是αvβ3整合素结合的最小肽段,合成的G14肽可以浓度依赖性地促进HUVEC管样结构的形成及CAM的血管生成。结论成功鉴定了αvβ3整合素在LNα4中的最小结合位点及关键氨基酸残基。所鉴定的肽段具有促HUVEC成管样结构及促CAM血管生成的生物学功能。

关键词： LNα4 αvβ3整合素结合肽鉴定

过表达长链非编码RNA H19促进miR-124-3p表达抑制肝癌细胞增殖

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第三军医大学学报 2016年第6期38卷 554-559页

作者：吕细林黄刚肖曼刘孟刚陈玥琦张楠张艳何凤田第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室重庆400038 海南医学院理学院生物化学与分子生物学教研室海口570102 第三军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆外科重庆400042 第三军医大学学员旅15营重庆400038

目的探讨长链非编码RNA H19(long non-coding RNA H19,lncRNA H19)对miR-124-3p表达的影响及在肝癌细胞增殖中的作用。方法 Real-time PCR检测肝癌细胞系及临床标本中lncRNA H19和miR-124-3p的表达;在肝癌细胞系Hep G2和SMMC7721中过表达lncRNA H19,Real-time PCR检测miR-124-3p及其靶基因cyclin D1的表达;Western blot检测cyclin D1蛋白表达水平;CCK-8法检测lncRNA H19对细胞增殖的影响;过表达lncRNA H19同时加入antagomiR-124-3p后,检测miR-124-3p及其靶基因表达情况及细胞增殖情况。结果 lncRNA H19和miR-124-3p在肝癌细胞系及肝癌组织中均低表达(P<0.05);过表达lncRNA H19后miR-124-3p表达显著增加(P<0.05),miR-124-3p的靶基因cyclin D1蛋白和mRNA表达明显下降(P<0.05),细胞增殖受到抑制(P<0.05);过表达lncRNA H19同时干扰miR-124-3p后,细胞增殖抑制作用减弱(P<0.05)。结论长链非编码RNA H19通过促进miR-124-3p表达,进而抑制其靶基因cyclin D1表达而抑制肝癌细胞增殖。

关键词： lncRNA H19 miR-124-3p cyclin D1 肝癌细胞增殖

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包涵体复性的研究进展

国外医学（临床生物化学与检验学分册） 2004年第6期25卷 516-518页

作者：吉清何凤田第三军医大学生物化学与分子生物学教研室重庆400038

大肠杆菌表达的外源基因产物通常是不可溶的包涵体。包涵体需要经过溶解和复性才能得到有活性的蛋白质。复性是蛋白质从未折叠到折叠形式的过程 ,受到许多因素的影响 ,包括变性剂对包涵体的溶解度、变性剂的去除、一些小分子对复性的帮... 详细信息

大肠杆菌表达的外源基因产物通常是不可溶的包涵体。包涵体需要经过溶解和复性才能得到有活性的蛋白质。复性是蛋白质从未折叠到折叠形式的过程 ,受到许多因素的影响 ,包括变性剂对包涵体的溶解度、变性剂的去除、一些小分子对复性的帮助等等。

关键词：包涵体蛋白复性大肠杆菌表达研究进展相关因素影响蛋白质变性剂外源基因小分子

人BAFF cDNA的克隆及原核表达载体的构建

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第三军医大学学报 2003年第6期25卷 498-500页

作者：高会广何凤田李蓉芬陈珊唐蓓彭家和陈敏周度金第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室重庆400038

目的　克隆人BAFF(BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily)全长及 12 8～ 2 85片段的cDNA并构建其原核表达载体 ,为表达和检测其生物学活性做准备。方法　提取HL 60细胞总RNA ,经RT PCR扩增编码人BAFF全长及12 8～ 2 85氨基酸... 详细信息

目的　克隆人BAFF(BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily)全长及 12 8～ 2 85片段的cDNA并构建其原核表达载体 ,为表达和检测其生物学活性做准备。方法　提取HL 60细胞总RNA ,经RT PCR扩增编码人BAFF全长及12 8～ 2 85氨基酸残基的cDNA序列 ,并将其克隆至载体pUC18和pUC19进行序列测定 ,然后构建于新型原核表达载体pQE 80L中。结果　RT PCR扩增得到了 85 8bp和 477bp的DNA片段 ,序列分析与GenBank中报道的编码BAFF全长及 12 8～2 85氨基酸残基的cDNA序列完全一致。结论　BAFFcDNA的克隆及其原核表达载体的构建。

关键词： BAFF RT-PCR 克隆序列分析