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作者：伍锡栋南方医科大学

学位级别：硕士

指数级富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)是一种针对靶分子筛选得到高亲和力、特异性强的核酸配基的体外筛选技术,由美国的Gold和Ellington在1990年建立。以完整细胞为靶标的C... 详细信息

指数级富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)是一种针对靶分子筛选得到高亲和力、特异性强的核酸配基的体外筛选技术,由美国的Gold和Ellington在1990年建立。以完整细胞为靶标的Cell-SELEX技术可以在靶细胞的分子组成未知的情况下筛选得到适配子(aptamer)。Cell-SELEX技术是在SELEX技术的基础上发展来的,大大提高了筛选的效率和靶标的范围。目前这种技术在肿瘤研究中的应用日益广泛,可用于肿瘤的诊断和治疗。应用Cell-SELEX技术可以筛选出特异结合肿瘤细胞的适配子,因此Cell-SELEX技术在基础研究、临床诊断和疾病治疗等方面具有广泛的应用。胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤,由于肿瘤呈浸润性生长,传统治疗方法包括手术切除、放疗和化疗,其效果极为有限,神经胶质瘤在颅内各种肿瘤中最为多见。据报道胶质瘤发病率占所有脑肿瘤的70%,其中多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme, GBM)是最常见的脑肿瘤,其预后极差,5年存活率不到3%。胶质瘤很难根治,往往会复发。由于传统的外科手术切除、放射治疗和化疗等治疗方法,受到放化疗抗性、血脑屏障对药物不通透等多种因素的影响,疗效受到明显的限制,因此对胶质瘤的靶向治疗的研究具有重要意义。EGFRⅧ是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)胞外区2-7个外显子(EGFRA2-7)缺失导致的突变体,与肿瘤的侵袭性和致瘤性有关。EGFRvIII在正常细胞中不表达,仅存在于恶性的肿瘤细胞,在正常组织中不表达,因而是一个很好的肿瘤治疗靶标,用Cell-SELEX技术筛选针对过表达U87-EGFRvIII细胞的适配子对胶质瘤靶向治疗研究有重要意义,而且使用的Cell-SELEX技术具有简便、快速、经济等特点。适配子具有分子小、快速的血浆清除率、高组织穿透力、免疫原性低、稳定性好等特点,文献报道适配子可有效地应用于靶向治疗、检测和诊断等。2005年第一个适配子的药物"Mucagen"已经被美国FDA批准上市,另外针对核仁蛋白的AS1411等适配子也在临床试验中,这些都表明适配子在疾病治疗中作用。随着SELEX技术的进展,它已经成为了生命科学研究和医药研究中越来越重要的研究工具,因此应用Cell-SELEX技术对胶质瘤细胞的靶标筛选和研究对胶质瘤的临床诊断、治疗及肿瘤基础研究具有很大的应用价值和前景,通过筛选得到的特异性适配子也将成为基础研究和应用研究中有效的分子识别工具。本实验研究主要从三方面研究：一是在细胞水平上筛选针对U87-EGFRvIII细胞的适配子及其结合特异性鉴定;二是在裸鼠动物荷瘤模型上初步观察筛选得到的适配子U2对肿瘤生长的抑制作用;三是188Re标记适配子在体内的代谢情况和靶向性治疗研究。 (1)通过应用Cell-SELEX技术针对靶细胞U87-EGFRvIII筛选适配子。在第4轮开始引入反筛细胞U87MG,应用消减SELEX技术筛选适配子。在筛选适配子过程中严格地按照一定的比例投入文库的量,在每一次投入的次文库都要经过尿素胶鉴定。在洗涤细胞时随着筛选轮数的不断增加,洗涤时间和洗涤次数也逐渐的增加,文库与细胞的孵育时间也逐渐的减少。我们利用PCR技术扩增双链dsDNA,通过链霉亲和素磁珠分离法分离单链ssDNA,得到带FITC的单链ssDNA作为下次筛选的文库。PCR过程中需要对反应体系和各种试剂的反应量进行梯度摸索,最后确定为条带单一、纯度高、分子量为76bp的为目的条带,结果表明PCR扩增得到的双链dsDNA和磁珠分离法得到的单链ssDNA均为条带单一、纯度高的分子量为76bp目的条带,如此循环共进行11轮筛选,然后进行克隆和测序。利用在线软件分析序列同源性,找到了四条同源性一致的序列作为筛选得到的适配子,分别命名为适配子U2、U8、U19和U31。其次,通过公司合成5’端标记的FITC适配子U2、U8、U19和U31并对其鉴定,FITC标记的原库GN作为检测的对照适配子。通过流式细胞检测仪检测结合寡核苷酸的随着筛选轮数增加的富集情况;经过蛋白酶K分别3min和10min不同程度消化细胞后来观察适配子与靶细胞U87-EGFRvIII结合的强度变化。结果发现：随着筛选轮数的增加,结合的寡核苷酸有富集作用;流式细胞检测仪检测到适配子与靶细胞U87-EGFRvIII结合的峰位比空白对照和原库GN对照的峰往右偏移,表明有富集作用。由于蛋白酶K会破坏细胞膜表面,因此对细胞进行不同程度的蛋白酶K消化,蛋白酶K对细胞消化3min和10min的不同程度后,对适配子与靶细胞U87-

关键词： U87-EGFRvⅢ Cell-SELEX 适配子裸鼠荷瘤模型 188Re

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细胞酶联反应法(cell-ELA)测定特异结合U87-EGFRvⅢ细胞的适配子的亲和力

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生物工程学报 2013年第5期29卷 664-671页

作者：谭燕梁惠玉伍锡栋高宇博张兴梅南方医科大学基础医学院神经生物学教研室广东广州510515 南方医科大学第一临床医学院广东广州510515

通过细胞-指数级富集的配基系统进化(Cell based systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,cell-SELEX)方法从随机文库中筛选得到与稳定过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(Epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)的胶质瘤细胞U87细胞株(U87-EGFRvⅢ)特异结合的DNA适配子。以U87-EGFRvⅢ细胞作为检测对象,筛选到的适配子A15作为检测分子,建立一种细胞酶联反应(Cell enzyme-linked assay,cell-ELA)方法测定适配子的亲和力,并用EGFR抗体作为对照来比较此种DNA适配子的亲和力。结果显示,所测定的DNA适配子A15的解离平衡常数(Equilibrium dissociation constants,Kd)小于100 nmol/L,对U87-EGFRvⅢ细胞的结合能力与抗体相似。Cell-ELA法可较方便地用于cell-SELEX中适配子亲和力的测定。

关键词：细胞酶联反应法细胞-指数级富集的配基系统进化 DNA适配子解离平衡常数

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适配子在肿瘤研究中的应用进展

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重庆医学 2015年第7期44卷 979-981页

作者：甘晓云伍锡栋刘涛张五萍江西省人民医院药剂科南昌330006 江西省药物研究所药理室南昌330006

在20世纪90年代初,美国的Tuerk等在实验室中发明了一种叫做指数富集配基的系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术,由此技术筛选出来的寡核苷酸命名为适配子（aptamers）。适配子可以和抗体... 详细信息

在20世纪90年代初,美国的Tuerk等在实验室中发明了一种叫做指数富集配基的系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术,由此技术筛选出来的寡核苷酸命名为适配子（aptamers）。适配子可以和抗体媲美,甚至优于抗体。

关键词：适配子 Cell-SELEX 肿瘤应用

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1例心源性缺血性脑卒中患者个体化治疗方案的制订及分析

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中国药房 2018年第11期29卷 1555-1560页

作者：张五萍林玮玮伍锡栋江西省人民医院药学部南昌330006 福建医科大学附属第一医院药学部福州350005 江西省医疗器械检测中心第四检测室南昌330096

目的:为心源性缺血性脑卒中患者个体化治疗方案的制订提供参考。方法:针对1例心源性缺血性脑卒中患者,临床药师结合缺血性脑卒中、心源性缺血性脑卒中的治疗原则,依据患者病情进展调整降脂方案,依据患者个体情况推荐二级预防,并协助临... 详细信息

目的:为心源性缺血性脑卒中患者个体化治疗方案的制订提供参考。方法:针对1例心源性缺血性脑卒中患者,临床药师结合缺血性脑卒中、心源性缺血性脑卒中的治疗原则,依据患者病情进展调整降脂方案,依据患者个体情况推荐二级预防,并协助临床医师调整抗感染治疗方案;当患者出现肝功能损伤时,建议停用可能引起肝功能减退的药物;及早发现肾功能损伤,并分析出是因液体循环不足所引起的肾功能损伤,建议及时补液,从抗凝、降脂、抗感染治疗等多方面全程实施药学监护。结果:临床医师采纳药师建议,共同为该心源性缺血性脑卒中患者制订了其个体化治疗方案,患者病情好转,肝、肾功能恢复正常,出院时国际标准化比值(INR)为1.8,控制较好,同时临床药师对其进行出院教育。结论:临床药师参与心源性缺血性脑卒中患者治疗全过程,可依据患者病情变化情况协助医师优化治疗方案,当发生不良反应时,及时更改方案,保证了患者用药的安全性和有效性。

关键词：心源性缺血性脑卒中个体化治疗方案药学监护肝功能肾功能

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乌骨藤皂苷类成分提取及体内抗肿瘤作用

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南昌大学学报（理科版） 2015年第1期39卷 88-90 95,95页

作者：姚闽肖草茂李玉云伍锡栋江西省药物研究所江西南昌330029

分离纯化乌骨藤提取物成分,通过建立荷人宫颈腺癌裸鼠模型,研究其抗肿瘤生物活性作用。采用硅胶色谱方法从乌骨藤提取物中分离纯化得到两个皂苷晶体,利用光谱方法进行了结构确定。通过裸鼠灌胃方法检测乌骨藤皂苷晶体Ⅰ、Ⅱ对荷人宫颈... 详细信息

分离纯化乌骨藤提取物成分,通过建立荷人宫颈腺癌裸鼠模型,研究其抗肿瘤生物活性作用。采用硅胶色谱方法从乌骨藤提取物中分离纯化得到两个皂苷晶体,利用光谱方法进行了结构确定。通过裸鼠灌胃方法检测乌骨藤皂苷晶体Ⅰ、Ⅱ对荷人宫颈腺癌裸鼠肿瘤抑制作用。乌骨藤晶体Ⅰ、Ⅱ分别被鉴定为11α-O-顺芷酰-12β-O-乙酰通关藤苷元B-3-β-O-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-D-夹竹桃吡喃糖苷(Ⅰ)、11α-O-顺芷酰-12β-O-乙酰通关藤苷元B-3-β-O-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-β-O-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-D-夹竹桃吡喃糖苷(Ⅱ)。通过荷人宫颈腺癌裸鼠的肿瘤抑制实验,显示乌骨藤皂苷Ⅰ、Ⅱ对肿瘤生长具有明显抑制作用(P<0.01)。皂苷类成分具有抑制肿瘤生长功效,该类成分在乌骨藤植物中含量高,具有重要的开发研究价值。

关键词：乌骨藤皂苷人宫颈腺癌

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紫茉莉根醇提物对实验性2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响

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中国实验方剂学杂志 2013年第7期19卷 217-220页

作者：江明金周吉银曾圣雅伍锡栋莫志贤南方医科大学中医药学院广州510515 第三军医大学新桥医院国家药物临床试验机构重庆400037

目的:观察紫茉莉根醇提物对实验性2型糖尿病大鼠血糖、血脂及胰岛素水平的影响。方法:注射链脲佐菌素(STZ,40 ***-1,ip)加高糖高脂饲料喂养建立2型糖尿病大鼠模型,大鼠分为正常组、模型组、低中高剂量紫茉莉根醇提物(1,2,4 ***-1)和罗... 详细信息

目的:观察紫茉莉根醇提物对实验性2型糖尿病大鼠血糖、血脂及胰岛素水平的影响。方法:注射链脲佐菌素(STZ,40 ***-1,ip)加高糖高脂饲料喂养建立2型糖尿病大鼠模型,大鼠分为正常组、模型组、低中高剂量紫茉莉根醇提物(1,2,4 ***-1)和罗格列酮组(4 ***-1),连续给药8周。给药后每2周测1次空腹血糖(FBG),试剂盒检测糖化血红蛋白(HbAlC)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、肝糖原及肌糖原含量,放射免疫法测血清胰岛素(FINS)。结果:给药8周后,糖尿病模型组大鼠FBG,HbAlC,TC,TG,FINS显著升高,胰岛素敏感指数(ISI)、肝糖原、肌糖原水平均显著下降(P<0.01);与糖尿病模型组相比,紫茉莉根醇提物中、高剂量组大鼠FBG,HbAlC,TC,TG,FINS水平下降,ISI,肝糖原及肌糖原水平均上升,均有显著差异(P<0.01)。结论:紫茉莉根醇提物对实验性2型糖尿病大鼠具降糖调脂作用。

关键词：紫茉莉根糖尿病高血糖胰岛素高血脂

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c-Met siRNA对U87-EGFRvⅢ胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响

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实用医学杂志 2013年第6期29卷 854-856页

作者：石玉生谭燕伍锡栋张兴梅南方医科大学南方医院放疗科广州市510515 南方医科大学基础医学院神经生物学教研室广州市510515

目的:合成针对c-Met的小干扰RNA(siRNA),研究其对U87-EGFRvⅢ(表皮生长因子受体Ⅲ型突变体)胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响。方法:用脂质体转染合成的c-Met siRNA入U87-EGFRvⅢ细胞,未转染组为对照组,荧光实时定量PCR和Western blotting分... 详细信息

目的:合成针对c-Met的小干扰RNA(siRNA),研究其对U87-EGFRvⅢ(表皮生长因子受体Ⅲ型突变体)胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响。方法:用脂质体转染合成的c-Met siRNA入U87-EGFRvⅢ细胞,未转染组为对照组,荧光实时定量PCR和Western blotting分别检测c-Met基因和蛋白的表达,MTT和Annexin V-FITC/PI法检测细胞增殖和凋亡情况。结果:c-Met siRNA明显抑制c-Met表达(P<0.05);明显增加细胞凋亡率(P<0.05)。同时,c-Met siRNA单独或协同EGFRvⅢsiRNA可抑制胶质瘤细胞增殖(P<0.05)。结论:c-Met siRNA可抑制U87-EGFRvⅢ胶质瘤细胞增殖、诱导其凋亡,为研究c-Met基因在胶质瘤中的作用及其靶向联合治疗提供了理论基础。

关键词： siRNA c—Met 表皮生长因子受体 Ⅲ型突变体

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关于聚氯乙烯材质医疗器械细胞毒性可能风险点及检测方法的几点思考

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中国医疗器械信息 2022年第21期28卷 24-26,66页

作者：伍锡栋林引花江西省医疗器械检测中心江西南昌330000 南昌大学药学院江西南昌330000

聚氯乙烯(Polyvinyl Chloride,PVC)因为性能稳定、价格低廉而广泛应用于医疗器械领域。PVC需要根据使用的需求不同而加入不同比例的增塑剂、热稳定剂、色素等添加剂,但是因为添加剂的使用会造成一定的生物毒性,对人体健康造成危害。在PV... 详细信息

聚氯乙烯(Polyvinyl Chloride,PVC)因为性能稳定、价格低廉而广泛应用于医疗器械领域。PVC需要根据使用的需求不同而加入不同比例的增塑剂、热稳定剂、色素等添加剂,但是因为添加剂的使用会造成一定的生物毒性,对人体健康造成危害。在PVC材料加工时增塑剂和热稳定剂的使用量最大。文章主要分析PVC材质中增塑剂、热稳定剂的生物毒性,概述PVC材质医疗器械的生物安全性评价及检测方法,医疗器械的材质、状态、组成及添加物质均决定了生物毒性检测方法的选择,在实际检测过程中细胞毒性的检测应尽可能综合2种以上方法的结果进行评价。

关键词：聚氯乙烯(PVC) 增塑剂热稳定剂琼脂扩散法 MTT法

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BFE系统评价医用外科口罩细菌过滤效率

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中国医疗器械信息 2019年第1期25卷 31-32,35页

作者：伍锡栋丁琦张芸张五萍江西省医疗器械检测中心第四检测室江西南昌330000 江西省人民医院药学部江西南昌330000

不同企业生产的医用外科口罩的细菌过滤效率质量参差不齐。文章应用BFE系统对不同企业的医用外科细菌过滤效率进行检测,评价其对金黄色葡萄球菌气溶胶颗粒的阻留效果。结果提示,2017年6～12月与2017年6-12月的检测结果比较,细菌过滤效... 详细信息

不同企业生产的医用外科口罩的细菌过滤效率质量参差不齐。文章应用BFE系统对不同企业的医用外科细菌过滤效率进行检测,评价其对金黄色葡萄球菌气溶胶颗粒的阻留效果。结果提示,2017年6～12月与2017年6-12月的检测结果比较,细菌过滤效率合格率呈上升趋势;BFE系统评价医用外科口罩细菌过滤效率性能稳定,筛选出了不合格产品,检测部门加强抽查监管和规范检测方法对规范医用外科口罩的生产及质量的提高有帮助。

关键词：外科口罩细菌气溶胶过滤效率

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临床药师对颅内结核患者的药学监护

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海峡药学 2019年第10期31卷 234-237页

作者：张五萍林玮玮伍锡栋江西省人民医院药学部江西南昌330006 福建医科大学附属第一医院药学部福建福州350005 江西省医疗器械检测中心检测四室江西南昌330000

目的探讨临床药师在颅内结核患者个体化治疗中的作用。方法临床药师参与1例结核性脑膜脑炎并引起脑梗死的老年患者药物治疗,参与抗感染方案,结合患者病情变化调整抗结核治疗方案,密切监护治疗过程中对血糖血脂、白细胞、肝肾功能的影响... 详细信息

目的探讨临床药师在颅内结核患者个体化治疗中的作用。方法临床药师参与1例结核性脑膜脑炎并引起脑梗死的老年患者药物治疗,参与抗感染方案,结合患者病情变化调整抗结核治疗方案,密切监护治疗过程中对血糖血脂、白细胞、肝肾功能的影响,同时对患者进行用药教育。结果临床医师采纳药师建议,患者各种指标良好,未出现明显的肝肾功能减退,病情好转出院。结论临床药师参与结核性脑膜患者治疗全过程,依据患者病情变化情况协助医师优化治疗方案。当发生不良反应时,及时协助医师制定最佳方案,及早逆转了不良反应的进展,保证了颅内结核患者用药的安全性和有效性。

关键词：结核性脑膜脑炎颅内结核类固醇性糖尿病肝功能肾功能

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