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烟曲霉孢子侵染小鼠骨髓源巨噬细胞的转录组研究

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中国真菌学杂志 2022年第2期17卷 94-98页

作者：徐凤娇娄新宇王远舟韩子宇仲国维南京医科大学公共卫生学院南京211166 南京市雨花台区疾控中心检验科南京210012

目的揭示小鼠骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)被烟曲霉(Aspergillus fumigatus)A1160c孢子侵染之后与未处理对照组BMMs相比表达出现差异的免疫信号通路及孢子吞噬和清除等相关基因。方法提取小鼠原代骨髓细胞并... 详细信息

目的揭示小鼠骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)被烟曲霉(Aspergillus fumigatus)A1160c孢子侵染之后与未处理对照组BMMs相比表达出现差异的免疫信号通路及孢子吞噬和清除等相关基因。方法提取小鼠原代骨髓细胞并将其诱导分化成巨噬细胞。烟曲霉孢子感染并分别提取感染组和对照组BMMs的总RNA,进行RNA测序和分析比较。结果提取小鼠原代骨髓细胞并成功将其诱导分化成BMMs。BMMs在感染烟曲霉孢子后,表面受体Tlr2和C型凝集素受体Clec4e和Clec5a的转录被激活。NF-κB信号传导通路也被激活,如Il1b、Tnf、Nfkb1等炎症因子基因和Jun、Gsk3b、Tec、Cd83等相关基因转录上调。同时,Cxcl1、Cxcl2、Ccl4等多种趋化因子基因转录水平也上调。另外,活性氧产生相关基因Bax、Nos2、Glul、Nlrp3的转录水平明显升高。结论在感染烟曲霉A1160^(c)孢子过程中,BMMs通过上调Toll样受体和C型凝集素受体基因转录水平激活NF-κB等免疫信号传导通路,促进趋化因子及活性氧产生相关基因的表达,引发对烟曲霉孢子的免疫响应和清除。

关键词：烟曲霉小鼠骨髓源巨噬细胞转录组测序免疫激活活性氧

ε-多聚赖氨酸和谷胱甘肽影响抗真菌药物对烟曲霉作用效果

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微生物学杂志 2022年第3期42卷 67-73页

作者：仲国维娄新宇徐凤娇曹佳颐吕荟杰南京医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫学系江苏南京211166

为了解多肽ε-多聚赖氨酸和谷胱甘肽对常见抗真菌药物体外抗人类病原真菌烟曲霉效果的影响,利用平板点菌实验、最低抑菌浓度实验中的微量液基法和E-test法,以及ROS检测等方法研究ε-多聚赖氨酸和谷胱甘肽在抗真菌药物体外抗烟曲霉过程... 详细信息

为了解多肽ε-多聚赖氨酸和谷胱甘肽对常见抗真菌药物体外抗人类病原真菌烟曲霉效果的影响,利用平板点菌实验、最低抑菌浓度实验中的微量液基法和E-test法,以及ROS检测等方法研究ε-多聚赖氨酸和谷胱甘肽在抗真菌药物体外抗烟曲霉过程中的作用以及可能的作用机制。通过基因定点敲除谷胱甘肽合成酶基因gcsA和gshA观察细胞内谷胱甘肽对于烟曲霉生长的重要性。结果显示,ε-多聚赖氨酸与抗真菌药物尤其是卡泊芬净和伊曲康唑呈协同作用;而谷胱甘肽则能够明显地拮抗伊曲康唑和卡泊芬净的抗烟曲霉作用。ε-多聚赖氨酸与伊曲康唑联用时菌体内的ROS含量比单独使用伊曲康唑时显著增多,而谷胱甘肽与伊曲康唑联用时菌体内的ROS含量比伊曲康唑单独使用时减少。基因敲除实验结果显示γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶基因gcsA为烟曲霉生长必需基因,而谷胱甘肽合成酶基因gshA对生长没有明显影响。结果表明,ε-多聚赖氨酸与谷胱甘肽影响了伊曲康唑和卡泊芬净对烟曲霉的作用。ε-多聚赖氨酸通过促进伊曲康唑刺激细胞产生ROS诱导烟曲霉死亡从而实现协同作用。谷胱甘肽为细胞内必需还原型多肽,通过消除胞内伊曲康唑诱导产生的ROS从而产生拮抗作用。

关键词： ε-多聚赖氨酸谷胱甘肽抗真菌药物协同与拮抗作用 ROS 烟曲霉

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新时期高校班主任预防干预大学生心理危机

科技风 2021年第26期 145-148页

作者：刘璐仲国维南京医科大学公共卫生学院江苏南京211166

研究显示现阶段我国大学生的心理问题日益突出,心理危机事件时有发生,成为影响学生成长和学校安稳的重要因素。通过分析当前我国所处社会背景、大学生心理危机根源和表现、兼职班主任在大学生心理危机预防和干预中的地位、优势和策略措... 详细信息

研究显示现阶段我国大学生的心理问题日益突出,心理危机事件时有发生,成为影响学生成长和学校安稳的重要因素。通过分析当前我国所处社会背景、大学生心理危机根源和表现、兼职班主任在大学生心理危机预防和干预中的地位、优势和策略措施等,提出了一系列科学有效的建议,为新时期兼职班主任如何在工作中有效地塑造健康积极向上的大学生心理稳态提供参考和依据。

关键词：兼职班主任大学生心理危机危机预防干预

烟曲霉batA基因在卡泊芬净抑菌“矛盾现象”中的调控功能研究

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烟曲霉batA基因在卡泊芬净抑菌“矛盾现象”中的调控功能研究

中国菌物学会2018年学术年会

作者：曾利平仲国维南京医科大学基础医学院病原生物学系江苏省现代病原生物学重点实验室南京医科大学公共卫生学院卫生检验学系现代毒理学教育部重点实验室

棘白菌素类抗真菌药物对念珠菌属是杀菌剂,对曲霉属是抑菌剂,在侵袭性真菌病治疗中发挥重要作用。近年来多项体内、体外研究证实,棘白菌素类抗真菌药物对念珠菌属和曲霉属均可产生"矛盾现象",即在低药物浓度时念珠菌或曲霉被杀死或抑制... 详细信息

棘白菌素类抗真菌药物对念珠菌属是杀菌剂,对曲霉属是抑菌剂,在侵袭性真菌病治疗中发挥重要作用。近年来多项体内、体外研究证实,棘白菌素类抗真菌药物对念珠菌属和曲霉属均可产生"矛盾现象",即在低药物浓度时念珠菌或曲霉被杀死或抑制,而在高药物浓度时出现菌落生长的现象。目前,此现象的产生机制尚未阐明。本项目从根癌农杆菌诱导的烟曲霉随机突变库2000株菌中筛选到2株卡泊芬净耐药菌,对其中1株分离鉴定并命名为基因batA,有研究显示其在人中的同源基因ABCC2负责从肝细胞转运胆汁酸/胆汁盐到胆小管,另外和肿瘤细胞耐药也有关系;在芽殖酵母中的同源基因Ybt1表达蛋白定位在空泡膜上与卵磷脂转运进入空泡内有关。目前在丝状真菌中该基因的同源基因还没有被研究和鉴定。通过构建荧光蛋白标记菌株我们确定了BatA-GFP是定位在菌丝细胞内的空泡上发挥功能的。通过构建基因敲除菌株和基因高表达菌株我们发现相比野生株,?batA敲除株和OEbatA对卡泊芬净最小抑菌浓度MIC值没有发生明显改变,但是出现抑菌"矛盾现象"的药物浓度分别出现提前和延迟（野生株:4μg/ml;?batA:8μg/ml;OEbatA:2μg/ml）。另外我们又将其分别在含有细胞壁抑制剂Congo Red和Calcofluor White,以及含有Na Cl的高渗透培养基上检测菌株的敏感性。结果发现相比野生型菌株,?batA对Congo Red,Calcofluor White和Na Cl具有轻微的抗性;OEbatA对三种所测试的试剂都表现出非常明显的敏感表型。由此推测batA基因在维持烟曲霉细胞壁几丁质和葡聚糖等多糖的结构组成上起重要作用。所以下一步我们将围绕batA如何通过空泡运输影响细胞壁结构组分差异进而影响卡泊芬净抑菌"矛盾现象"来解释batA参与调控该现象的机制。

关键词：烟曲霉 batA基因空泡转运矛盾现象

烟曲霉生物膜耐药反向调控基因Afssn3功能解析

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烟曲霉生物膜耐药反向调控基因Afssn3功能解析

中国菌物学会2018年学术年会

作者：龙南彪曾利平乔善磊李磊仲国维湖南邵阳学院医学检验学院南京医科大学基础医学院病原生物学系江苏省现代病原生物学重点实验室南京医科大学公共卫生学院卫生检验学系现代毒理学教育部重点实验室

侵袭性曲霉病（Invasive Aspergillosis, IA）感染的发生呈现上升趋势,仅次于假丝酵母（Candida）引起的真菌感染,病死率达60%-100%。烟曲霉是所有曲霉引起的感染中最常见的致病菌。治疗深部曲霉感染的临床应用一线药物是三唑类抗真菌药... 详细信息

侵袭性曲霉病（Invasive Aspergillosis, IA）感染的发生呈现上升趋势,仅次于假丝酵母（Candida）引起的真菌感染,病死率达60%-100%。烟曲霉是所有曲霉引起的感染中最常见的致病菌。治疗深部曲霉感染的临床应用一线药物是三唑类抗真菌药物,然而已经发现越来越多的临床分离菌对唑类药物产生耐药性,还有高比例的菌株出现多药耐药性。本项目从根癌农杆菌诱导的烟曲霉随机突变库2000株菌中筛选到8株三唑类药物耐药菌,对其中1株分离鉴定到基因Afssn3,该基因在烟曲霉中被预测作为RNA聚合酶II的转录辅因子并对基因的转录起负调控作用。通过构建荧光蛋白标记菌株我们确定了AfSSN3-GFP是定位在细胞核中发挥功能的。通过基因敲除我们发现相比野生株,?Afssn3敲除株最小抑菌浓度MIC值有2倍升高,生物量和扫描电镜的检测发现是生物膜增多导致的,所以我们设计了一系列实验检测生物膜相关成分的改变以解析其造成耐药的机制。首先通过气质联用GC-MS的方法对敲除株和野生株进行早期代谢差异物质进行普筛,发现相比于野生型,?Afssn3细胞内葡萄糖和各种氨基酸都大量减少。其次我们通过液质联用LC-MS的方法对敲除菌株和野生株进行晚期期代谢差异物质进行了普筛,分析发现相比于野生型,?Afssn3细胞内主要有两大类物质积累量增多:（1）鞘脂代谢中间产物的积累量增多;（2）葡萄糖和半乳糖组成的多糖结构增多。由此我们推测:（1）?Afssn3利用了大量葡萄糖半乳糖等单糖参与合成了胞外多糖物质;（2）消耗利用的氨基酸中丝氨酸+辅酶a参与了合成积累了鞘脂中间产物。进一步通过葡萄糖添加和氨基酸添加验证了该推测。最后我们通过转录组测序发现?Afssn3细胞中有4个药物外排泵基因有上调趋势。综上,我们推测?Afssn3通过大量合成并胞外多糖、鞘脂合成通路中间物质的累积和药泵基因上调而实现的生物膜耐药。

关键词：烟曲霉 Afssn3基因生物膜胞外多糖鞘脂合成中间产物药物外排泵

PRS1蛋白作为SEPH的反向调节子参与构巢曲霉胞质分裂的时空准确性调节

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PRS1蛋白作为SEPH的反向调节子参与构巢曲霉胞质分裂的时空准确性...

中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会

作者：仲国维魏雯帆管祁马兆飞陆玲江苏省微生物与功能基因组学重点实验室江苏省微生物工程中心南京师范大学生命科学学院

胞质分裂（cytokinesis）能够产生隔膜并将母细胞分成两个子细胞,它是有丝分裂的最后一步,不正常的细胞分裂会导致细胞的死亡甚至癌变,所以该过程需要许多细胞分裂相关基因在时间和空间上准确的调控。这些基因形成一个网络,共同调控着... 详细信息

胞质分裂（cytokinesis）能够产生隔膜并将母细胞分成两个子细胞,它是有丝分裂的最后一步,不正常的细胞分裂会导致细胞的死亡甚至癌变,所以该过程需要许多细胞分裂相关基因在时间和空间上准确的调控。这些基因形成一个网络,共同调控着细胞有丝分裂的退出和细胞隔膜形成的开始。在芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中,这一套控制有丝分裂退出的信号途径被称为有丝分裂退出途径（Mitotic Exit Network,MEN）;同样的,在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中则被命名为细胞隔膜开始网络（Septum Initiation Network,SIN）。作为一种优良的模式生物,丝状真菌构巢曲霉（Aspergillusnidulans）的有丝分裂过程同样也是受到许多基因的调节,但是关于构巢曲霉胞质分裂的调节途径尚不完善。在构巢曲霉中,温度敏感型菌株筛选发现的SEPH蛋白与裂殖酵母SIN信号途径中的丝-苏氨酸激酶Cdc7p有42%的同源性,它是胞质分裂早期所必须的组分,当sepH基因缺失时,会导致细胞不能进行胞质分裂,而当过表达sepH时,会导致多个隔膜的出现。由于生物体中每一条调节途径都是由多个基因相互作用完成的,既含有正调节子也存在负调节子（suppressors）,因此推测在A.nidulans中也必然存在一个或数个与sepH基因相互作用的反向调节子。为了进一步研究在构巢曲霉中sepH基因参与的胞质分裂调节途径,本研究中通过紫外诱变、突变筛选、杂交分离和回交验证等遗传学方法得到了能够反向调节sepH基因的反向调节子突变菌株Sin110,它能使sepH突变菌株在限制温度下胞质分裂部分恢复正常,同时具有低温生长受到抑制,产隔过早过多的表型。根据Sin110菌株低温下的表型,我们进行了互补实验（complementation test）,通过转入Sin110菌株携带基因组文库片段的自主复制质粒载体prg3-AMA-NotⅠ,筛选得到了使突变株恢复功能表型的转化子菌株T2,抽提转入的相应质粒,测序比对插入序列从而确定sepH的反向调节基因AnPRS1（AN6711.4）。对该基因单独设计引物扩增连接入质粒Prg3-AMA1-NotⅠ进行克隆,再次和菌株Sin110共转化来验证是否是sepH的反向调节子,得到了相同的结果。这说明该基因确实能够恢复由AnPRS1基因突变造成的菌株生长缓慢,产隔异常的缺陷。为了从正向验证AnPRS1基因是否是sepH的反向调节子,我们构建了乙醇启动子控制的GFP标记的AnPRS1同源整合菌株ZGA01,诱导表达的情况下,该蛋白只定位在胞质中,无核定位,在某些菌丝细胞的隔膜上有微弱的聚集信号,推测其在胞质近隔膜的位置参与隔膜形成。抑制表达情况下,菌株表现出生长缓慢,菌丝产生隔膜明显过早过多的表型,和AnPRS1的点突变菌株Sin110菌株表型一致,电镜结果显示dnPRS1基因受到抑制时相比野生型隔膜呈不规则表形。进一步的实验表明构巢曲霉中存在AnPRS1,AnPRS2和AnPRS3共同完成PRPP的合成。当AnPRS1完全敲除时,可以由AnPRS2和AnPRS3蛋白产生补救效应,进一步深入的工作还在继续中。本课题涉及的生物学问题的解决将有助了解胞质分裂调控的分子机理,这将对医学上控制细胞分裂以及肿瘤治疗的药理学都提供强有力的理论依据,具有极其重要意义。

关键词：胞质分裂隔膜突变 sepH AnPRS1 反向调节子

钙信号系统参与曲霉形态建成和生长发育的分子调控机制

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钙信号系统参与曲霉形态建成和生长发育的分子调控机制

2012年中国菌物学会学术年会

作者：张石柱王莎陈培英仲国维魏雯帆陆玲江苏省微生物与功能基因组重点实验室南京师范大学生命科学学院

真菌中存在着与动、植物具有保守性和独特性的钙信号系统,但对其参与调控的生理功能还没有足够的认识。本课题组以构巢曲霉为真核模式生物研究钙信号系统在曲霉形态建成和生长发育中的分子调控机制。在菌丝极性生长方面,我们已经对控制... 详细信息

真菌中存在着与动、植物具有保守性和独特性的钙信号系统,但对其参与调控的生理功能还没有足够的认识。本课题组以构巢曲霉为真核模式生物研究钙信号系统在曲霉形态建成和生长发育中的分子调控机制。在菌丝极性生长方面,我们已经对控制极性生长的重要基因mobB,cotA,camA,acnA,cchA,midA,pcpA进行了系列功能研究,证明了两个新蛋白MobB和CotA在形态建成调节网RAM（Regulates both Ace2pactivity and cellular Morphogenesis）信号通路中调节极性生长中的功能和相互作用的特征。这两个蛋白缺失的突变体将呈现出极性生长缺失表型,但是这种极性缺失的表型可以通过向培养基中加入引起渗透胁迫的PEG、NaCl或Sorbitol而恢复,同时这种恢复又可以被钙离子螯合剂和钙通道阻断剂所抑制,该现象提示我们,逆境条件下可能启动了钙信号通路,激活一系列适应渗透胁迫的基因表达,这些基因的表达参与了极性生长的调控,从而弥补了因为RAM通路缺失而造成的极性生长缺陷。我们利用GFP-CaM融合蛋白活细胞标记技术研究菌丝顶端功能性的钙离子的受体-钙调素（CaM）的动态分布,发现钙调素的过表达可以加速菌丝的生长,钙调素在菌丝顶端顶体（Spitzenk（o|¨）rper）部位有高浓度聚集,CaM总是在生长菌丝的最顶端处呈GFP亮球型,并预测和决定菌丝顶端生长方向及新的的生长点的发生。当菌丝生长停止后,菌丝顶端钙调素的亮点消失。同时发现钙调素的定位方式依赖于微丝细胞骨架的完整性。对钙离子通道基因midA和cchA的研究发现当分别关闭这两个基因时,菌丝仍能生长但生长速度明显减缓,突变株对低钙更为敏感。更有意思的是发现CchA/MidA作为一对复合体不仅在曲霉的极性生长中其重要作用,而且通过调控真菌细胞壁整合途径影响细胞壁成分从而改变真菌对胞外细胞壁破坏试剂的抗性。在细胞分裂研究方面,我们采用胞质分裂起始网（SIN）细胞骨架定位的关键扳机（key trigger）sepH为基点,采用随机突变和反向调节子筛选法目前成功筛选到sepH突变株的反向调节子（Suppressors）118株,通过回补实验发现磷酸核酮糖转移酶prs家族参与胞质分裂的调控。在产孢发育方面,我们发现钙亲和双元系统在构巢曲霉无性繁殖中发挥重要作用:将高亲和性钙离子吸收系统基因敲除后,在高钙条件下几乎不影响产生分生孢子和菌丝的生长,在低钙条件下会延缓构巢曲霉分生孢子的形成,但不能阻断产生分生孢子,敲除菌株菌丝的极性生长也受到了很大的抑制。将低亲和性钙离子吸收系统基因敲除后,无论在高钙还是在低钙的条件下都会在很大程度上阻断分生孢子的产生,相比野生型菌株,其产孢量降低了2-3个数量级,而且突变菌株对营养菌丝的生长几乎没有影响。综上所述,我们课题组以构巢曲霉为模式生物,系统研究了钙信号系统中的钙离子通道基因、钙调蛋白、以及下游靶蛋白-钙调磷酸酶、钙调激酶在曲霉形态建成中的功能,阐明了钙信号系统在真菌极性生长、胞质分裂和产孢发育中的功能以及作用机理,这不仅为探索钙信号系统的细胞学功能提供理论知识,更重要的是弄清楚真菌形态建成调控网,为有效地控制真菌的生长和繁殖可以提供有效靶点。

关键词：钙信号系统形态建成生长发育曲霉

构巢曲霉(A.nidulans)细胞极性生长以及胞质分裂信号传导过程中的分子调控机制研究

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构巢曲霉(A.nidulans)细胞极性生长以及胞质分裂信号传导过程中的...

2010年中国菌物学会学术年会

作者：王莎仲国维曹进玲高丽娜陈培英陆玲江苏省南京市江苏省资源生物技术重点实验室江苏省微生物工程中心南京师范大学生命科学学院

在真核生物的生长和发育过程中,细胞生长与分裂在时间和空间上均被精确地调节,一旦失调将会引起细胞凋亡,衰老等生理和病理现象。曲霉类丝状真菌与很多重要的工业用和医学致病真菌密切相关,近年来在国际上引起人们的极大关注。由于丝状... 详细信息

在真核生物的生长和发育过程中,细胞生长与分裂在时间和空间上均被精确地调节,一旦失调将会引起细胞凋亡,衰老等生理和病理现象。曲霉类丝状真菌与很多重要的工业用和医学致病真菌密切相关,近年来在国际上引起人们的极大关注。由于丝状真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)具有许多独特的优势,因此可以作为研究细胞极性生长以及胞质分裂很好的模式生物。借助于目前基因组计划的测序成果,以及蛋白质标记技术,DNA同源整合技术以及基因敲除等技术,我们已经成功构建了系列的、与极性生长和胞质分裂密切相关、具有不同荧光标记(分别根据需要标记CFP、GFP、YFP和RFP)的同源整合菌株,筛选并鉴定了控制极性生长和胞质分裂的重要基因并研究相应蛋白质的功能和特性。我们发现丝状真菌的极性生长受到钙信号通路调控,其可能的途径为:钙离子通道(CchA,MidA)——Ca——钙结合蛋白(CaM,CnaA)——转录因子(CrzA)——靶基因表达——极性生长)。另外,我们通过对细胞隔开始网(septation initiation network,SIN)信号途径中SepH反向调节子进行了筛选和鉴定研究,发现了使sepH胞质分裂表型恢复正常的sin菌株,证实了SIN途径具有对应反向的旁路途径(bypass)的存在。本课题涉及的生物学问题的解决将有助了解与真菌侵染性密切相关的极性生长和胞质分裂的分子机理,这将对工业上和医学上促进和控制细胞生长及其相应的生理学和药理学提供强有力的理论依据,具有极其重要意义。

关键词：构巢曲霉极性生长胞质分裂信号转导

“卫生化学”课程网络教学状况调查与思考——以南京医科大学为例

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科教文汇 2021年第15期 89-91页

作者：仲国维茅力周靖平王梦李磊乔善磊南京医科大学公共卫生学院江苏南京211166

目的:了解学生网络学习的习惯和感受,为网络教学平台建设提供参考,对南京医科大学公共卫生学院预防医学专业两个年级的本科生进行了“卫生化学”网络教学调查。方法:问卷调查法和访谈法。结果:学生更乐于接受的是网络视频课程结合课后... 详细信息

目的:了解学生网络学习的习惯和感受,为网络教学平台建设提供参考,对南京医科大学公共卫生学院预防医学专业两个年级的本科生进行了“卫生化学”网络教学调查。方法:问卷调查法和访谈法。结果:学生更乐于接受的是网络视频课程结合课后作业进行过程控制的教学方法。学生更喜欢使用电脑进行学习,但使用移动设备的学生仍然是个很大的群体。交流方式上,学生喜欢使用即时通讯软件与教师交流。视频讲解清晰细致且结合作业的网络课程最受学生欢迎。结论:教师还要进一步完善网络平台资源建设,积极优化网络平台,增强网络教学效果。

关键词：卫生化学网络教学问卷调查