检索结果-南通市图书馆

作者：仝丹心东北农业大学

学位级别：硕士

黑曲霉是丝状真菌中曲霉属的一种,具有卓越的蛋白表达和分泌能力,能够正确进行蛋白质的各种翻译修饰,安全性广泛为人们所接受,是建立新型重组蛋白表达系统的理想选择。本课题组前期建立了食品级的黑曲霉分泌表达系统,并通过使用强启动子... 详细信息

黑曲霉是丝状真菌中曲霉属的一种,具有卓越的蛋白表达和分泌能力,能够正确进行蛋白质的各种翻译修饰,安全性广泛为人们所接受,是建立新型重组蛋白表达系统的理想选择。本课题组前期建立了食品级的黑曲霉分泌表达系统,并通过使用强启动子Pgla A6R和高效分泌信号肽Sgla A有效提高了α-淀粉酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶等重组蛋白的产量。但是,在过表达脯氨酰内肽酶、酸性蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶的研究中发现,使用强启动子Pgla A6R和高效分泌信号肽Sgla A后,目的蛋白的表达量有所下降,并且出现了菌体生长抑制现象。推测可能是重组蛋白过度表达导致错误折叠,引发了非折叠蛋白响应。本实验以过表达α-淀粉酶、脯氨酰内肽酶的黑曲霉TH-2为材料,尝试通过改变发酵培养基中葡萄糖和木糖比例、添加蛋白分泌促进剂CPPs和内质网应激抑制剂TUDCA调控目的蛋白的表达、折叠和分泌。分析发酵条件对不同菌株中相同或不同分泌蛋白表达的调控规律。研究结果将深化对黑曲霉分泌蛋白表达调控的认识,为通过优化发酵条件提高重组蛋白的分泌表达量提供有价值的参考。获取的主要研究成果如下:（1）过表达融合Flag标签的α-淀粉酶黑曲霉的构建构建了融合Flag标签的内源α-淀粉酶基因amyAF的黑曲霉表达载体pSZHG6R-amyAF,以强启动子Pgla A6R和Sgla A信号肽调控amyAF基因的表达;采用农杆菌介导法转化黑曲霉,获得amyAF基因表达框整合在gla A基因位点的重组菌株G1A。重组菌株G1A发酵第11 d产α-淀粉酶达到最大值,为129.18 U/m L,是出发菌株TH-2的1.85倍,与之前过表达未融合Flag标签的α-淀粉酶纯合黑曲霉重组菌株（?gla A::amy A in *** TH-2）)所测酶活结果差距不大。（2）过表达α-淀粉酶黑曲霉的发酵调控对重组菌株G1A进行摇瓶发酵培养,设置10%木糖、2%葡萄糖+8%木糖、4%葡萄糖+6%木糖、6%葡萄糖+4%木糖、8%葡萄糖+2%木糖、10%葡萄糖、10%葡萄糖+1%CPPs及10%葡萄糖+0.01%TUDCA等8种不同的发酵培养基,取摇瓶发酵第4 d的样品进行检测分析。荧光定量PCR检测结果表明,与10%葡萄糖的发酵培养基相比,在添加木糖的培养基中,除6%葡萄糖+4%木糖的培养基中amy A基因的转录水平没有显著变化外,其他均显著降低,但最大降幅只有53%;而xyn B基因的转录水平增加了4.24-120.35倍,说明添加木糖对amy A基因的转录水平调控作用有限,而对xyn B基因的转录水平调控作用较大。添加1%CPPs后,淀粉酶基因amy A转录水平下降35%,木聚糖酶基因xyn B转录水平下降30%,内质网折叠相关基因bip A转录水平增加了0.22倍,pdi A基因转录水平增加了0.40倍。添加0.01%TUDCA后,淀粉酶基因amy A转录水平下降67%,木聚糖酶基因xyn B转录水平下降92%,bip A基因转录水平增加了3.50倍,pdi A基因转录水平增加了2.60倍。SDS-PAGE和WB检测结果表明,添加木糖后G1A菌株中木糖酶系蛋白量增加。在培养基中加入1%CPPs或0.01%TUDCA后,胞内可溶蛋白和胞内不溶蛋白都显著降低。酶活检测结果表明,不同配比的葡萄糖和木糖对α-淀粉酶的影响较小,添加1%CPPs或0.01%TUDCA对α-淀粉酶的酶活没有显著影响。这一结果明显与转录水平不一致,说明α-淀粉酶的分泌表达存在转录之后的调控。G1A菌株中木聚糖酶的表达量随着添加的木糖比例增加而逐渐提高,木糖含量为8%时,诱导表达的木聚糖酶的酶活最高,是10%葡萄糖的3.2倍。这一结果与转录水平的趋势基本一致,但差异倍数较小,说明存在转录之后的调控。（3）过表达脯氨酰内肽酶黑曲霉的发酵调控对重组菌株G1P进行摇瓶发酵培养,设置10%木糖、2%葡萄糖+8%木糖、4%葡萄糖+6%木糖、6%葡萄糖+4%木糖、8%葡萄糖+2%木糖、10%葡萄糖、10%葡萄糖+1%CPPs及10%葡萄糖+0.01%TUDCA等8种不同的发酵培养基,取摇瓶发酵第4 d的样品进行检测分析。荧光定量PCR检测结果表明,与10%葡萄糖培养基相比,在添加木糖的培养基中,除添加10%木糖发酵培养基中prot A基因的转录水平显著降低（47%）外,其他比例变化均不显著。xyn B基因的转录水平增加约31.74-53.01倍,说明添加木糖后对prot A基因的转录调控作用不大,而对xyn B基因的转录水平调控作用较大。添加1%CPPs后,脯氨酰内肽酶基因prot A转录水平增加了1.32倍,木聚糖酶基因xyn B转录水平增加了4.66倍,内质网折叠相关基因bip A转录水平增加了1.59倍,pdi A基因转录水平增加了3

关键词：黑曲霉脯氨酰内肽酶 α-淀粉酶发酵调控过表达

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单宁酶在黑曲霉中的高效表达及其酶学性质研究

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食品工业科技 2023年第15期44卷 159-165页

作者：仝丹心李杰何洪彬张会东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 山东师范大学生命科学学院山东济南250014

运用基因工程手段,构建高效表达单宁酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期提高单宁酶的表达,更好地实现单宁酶在茶饮料、饲料等行业的重要作用。以内源高表达的glaA基因位点为整合靶位点,集成glaA多拷贝强启动子Pg... 详细信息

运用基因工程手段,构建高效表达单宁酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期提高单宁酶的表达,更好地实现单宁酶在茶饮料、饲料等行业的重要作用。以内源高表达的glaA基因位点为整合靶位点,集成glaA多拷贝强启动子PglaA6R和信号肽SglaA,构建单宁酶基因AnTan黑曲霉重组表达载体pSZHG6R-AnTan,采用农杆菌介导法转化黑曲霉,获得单宁酶黑曲霉纯合重组菌株A1。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为76 kDa;以10%糊精为碳源摇瓶发酵至11 d时,酶活最高达到134.36 U·mL^(-1),约为宿主菌株的192倍。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为7.0。K^(+)和Ca^(2+)对重组酶没有影响;Mg^(2+)对重组酶有微弱的促进作用;Zn^(2+)对重组酶有明显的促进作用;Cu^(2+)和Fe^(2+)对重组酶有微弱的抑制作用;Mn^(2+)和EDTA对重组酶有明显的抑制作用。研究结果为进一步优化单宁酶的分泌表达提供了有价值的参考。

关键词：单宁酶黑曲霉高效表达酶学性质重组菌株基因工程

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