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莱姆病两种检测方法的建立

莱姆病两种检测方法的建立

作者：付钰广中国农业科学院

学位级别：硕士

莱姆病是一种自然疫源性人兽共患病,由伯氏疏螺旋体引起,通过传介蜱叮咬人或动物传播。该病临床表现复杂多样,可引起人体多系统、多器官的损害,严重者终生致残甚至死亡,除威胁人类健康外,还通过危害家畜健康对畜牧业的发展构成了威胁,... 详细信息

莱姆病是一种自然疫源性人兽共患病,由伯氏疏螺旋体引起,通过传介蜱叮咬人或动物传播。该病临床表现复杂多样,可引起人体多系统、多器官的损害,严重者终生致残甚至死亡,除威胁人类健康外,还通过危害家畜健康对畜牧业的发展构成了威胁,已成为全球公共卫生问题,于1992年被世界卫生组织列入重点防治研究对象。对莱姆病的研究,大多研究集中在人上,在动物上的研究相对较少。由于蜱是伯氏疏螺旋体的传播媒介,动物是其贮存宿主,它们在莱姆病的传播中发挥着重要的作用。本研究建立了伯氏疏螺旋体血清学诊断方法ELISA和病原学检测方法real-time PCR,并运用这些方法对我国部分疫区进行了流行病学的初步调查。以伯氏疏螺旋体SZ(B. garinii)、BO23(B. afzelii)和B31(B. burgdorferi sensus stricto)菌株的外膜蛋白OspC基因为靶基因,通过PCR扩增出目的片段,克隆到表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒,表达的蛋白用MagneGSTTM Protein Purification System纯化。纯化的蛋白用三株菌株免疫羊制备的阳性血清做Western Blot(WB)检测,结果显示这三个基因型菌株的重组OspC具有抗原性及交叉反应,表明该重组蛋白是建立检测羊体内伯氏疏螺旋体相应抗体ELISA方法的理想抗原。本研究中,SZ菌株的OspC重组蛋白用来建立了ELISA。建立的ELISA方法通过检测200份阳性血清和214份阴性血清,估算出了该方法的敏感性和特异性分别为87.5%和86.4%。该方法与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、巴贝斯虫(临潭、宁夏、新疆、河北、天竺)、羊无浆体和羊弓形虫的羊的阳性血清没有交叉反应。通过调查502份(2004年)和360份(2010年)采集自甘肃省甘南自治区的羊血样品,检测阳性率分别为5.4%和9.4%。通过参考Genbank中发表的伯氏疏螺旋体16S rRNA基因序列,设计检测伯氏疏螺旋体的通用引物和探针,建立了real-time PCR。该方法可特异性的检测出阿氏疏螺旋体(B. afzelii)、伽氏疏螺旋体(B. garinii)和狭义伯氏疏螺旋体(B. burgdorferi sensu stricto),而与泰勒虫、巴贝斯虫、无浆体、衣原体和支原体病原无交叉反应。其敏感性为常规PCR的104倍,能从22.88 fg的基因组DNA中检测到伯氏疏螺旋体核酸。通过检测采集自黑龙江尚志市的369份蜱(革蜱属)样品,及采集自甘肃省甘南自治州的186份牦牛和146份绵羊样品,阳性率分别为42.8%、24.19%和39.04%。

关键词：伯氏疏螺旋体外膜蛋白C ELISA Real-time PCR 检测

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莱姆病的研究进展

中国兽医科学 2011年第1期41卷 99-105页

作者：付钰广罗建勋殷宏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

结合国内外对莱姆病的研究结果,从病原学、流行病学(地理分布、贮存宿主、传播媒介和易感人群)、发病机理、临床症状、诊断(包括病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断)、预防和治疗等方面阐述了莱姆病的研究进展,旨在为该病的深入研... 详细信息

结合国内外对莱姆病的研究结果,从病原学、流行病学(地理分布、贮存宿主、传播媒介和易感人群)、发病机理、临床症状、诊断(包括病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断)、预防和治疗等方面阐述了莱姆病的研究进展,旨在为该病的深入研究提供参考。

关键词：莱姆病病原学流行病学临床症状检测

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西尼罗病毒诊断的研究进展

中国人兽共患病学报 2011年第8期27卷 742-745页

作者：付钰广任巧云罗建勋殷宏家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

西尼罗病毒（WestNileVirus，WNV）首次于1937年12月在乌干达西尼罗地区的一名发热成年女性血液标本分离到，属黄病毒科（Flavivirdae）黄病毒属（Flavivirus）的乙型脑炎病毒血清群。可导致人类西尼罗热（westNileFever）或西尼罗脑炎... 详细信息

西尼罗病毒（WestNileVirus，WNV）首次于1937年12月在乌干达西尼罗地区的一名发热成年女性血液标本分离到，属黄病毒科（Flavivirdae）黄病毒属（Flavivirus）的乙型脑炎病毒血清群。可导致人类西尼罗热（westNileFever）或西尼罗脑炎（WestNileEncephalitis）。发病者常常出现发烧、头痛、皮疹、淋巴结肿大等症状，严重时表现为无菌性脑膜炎，甚至死亡。

关键词：西尼罗病毒诊断乙型脑炎病毒无菌性脑膜炎西尼罗脑炎淋巴结肿大标本分离成年女性

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鸭坦布苏病毒E蛋白膜外区的原核表达与鉴定

中国兽医科学 2013年第8期43卷 850-854页

作者：刘宗梁付钰广吉艳红李郁魏建忠朱启运安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为获得鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)E蛋白膜外区的表达产物,以DTMUV安徽分离株(AH10)E基因序列设计特异性引物,扩增E基因,将其克隆至原核表达载体pET-SUMO中,构建重组表达质粒pET-SUMO-E,然后将其转化至感受态细胞*** Rosett... 详细信息

为获得鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)E蛋白膜外区的表达产物,以DTMUV安徽分离株(AH10)E基因序列设计特异性引物,扩增E基因,将其克隆至原核表达载体pET-SUMO中,构建重组表达质粒pET-SUMO-E,然后将其转化至感受态细胞*** Rosetta(DE3)中,并以IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,获得了70ku的表达产物,与预期结果相符。Western-blot分析表明,目的蛋白能与兔抗DTMUV E蛋白多克隆血清及DTMUV鸭阳性血清发生特异性反应,显示出良好的反应活性。结果表明,成功表达了E蛋白膜外区,这一成果为DTMUV疫苗制备和诊断试剂盒的研发奠定了基础。

关键词：鸭坦布苏病毒 E蛋白膜外区原核表达鉴定

甲型流感病毒H1N1(pdm09)在猪和猪呼吸道上皮细胞气液界面培养体系的毒力特性研究

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甲型流感病毒H1N1(pdm09)在猪和猪呼吸道上皮细胞气液界面培养体...

小反刍兽疫病毒China／Tib／07株V蛋白的原核表达及纯化

第九届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：付钰广 Georg Herrler

引言/目的2009年始发于墨西哥的H1N1甲型流感病毒在全球引起了大流行,该病毒仅在2009年就致使全球超过10万人感染而致死亡,给人类生命安全造成了极大的威胁。研究发现,该病毒极有可能是在猪体内重组后传播给人类。由于毒株在新的宿主体... 详细信息

引言/目的2009年始发于墨西哥的H1N1甲型流感病毒在全球引起了大流行,该病毒仅在2009年就致使全球超过10万人感染而致死亡,给人类生命安全造成了极大的威胁。研究发现,该病毒极有可能是在猪体内重组后传播给人类。由于毒株在新的宿主体内形成稳定的谱系需要对新宿主的一个适应过程,因此,本研究以分离自2009、2010、2014和2015年的甲型H1N1 (pdm09)流感毒株为研究对象,分别采用猪只和体外分化的猪呼吸道上皮细胞气液界面培养体系(ALI)研究毒株的感染特性、毒力变化等。

关键词：呼吸道上皮细胞甲型流感病毒 pdm09 气液界面培养特性研究

来源： cnki会议评论

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中国兽医科学 2013年第11期43卷 1140-1145页

作者：张学虎马旭升付钰广曾巧英才学鹏朱启运甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为获得小反刍兽疫病毒(PPRV)V基因在大肠杆菌中的表达产物,根据GenBank中China/Tib/07株的V基因序列人工合成了V基因,然后将其克隆至表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-V,经酶切鉴定和测序确认后将重组质粒转化大肠杆菌B... 详细信息

为获得小反刍兽疫病毒(PPRV)V基因在大肠杆菌中的表达产物,根据GenBank中China/Tib/07株的V基因序列人工合成了V基因,然后将其克隆至表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-V,经酶切鉴定和测序确认后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达和GST亲和树脂柱纯化融合蛋白。SDS-PAGE检测结果显示,使用0.8mmol/L的IPTG在30℃、130r/min条件下诱导8h后,分子质量约为58ku的融合蛋白以可溶性状态大量表达;SDS-PAGE及Western-blot分析表明,用含有1mmol/L还原性谷胱甘肽的GST洗涤缓冲液洗涤8次并用2mmol/L的还原性谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱时可获得纯度较高的融合蛋白,且此融合蛋白可被抗GST标签的抗体所特异性识别。结果表明,成功表达并纯化了小反刍兽疫病毒的V蛋白,该项工作为研究其生物学功能积累了资料。

关键词：小反刍兽疫病毒 V基因原核表达纯化

禽流感病毒M2e多拷贝重组蛋白的原核表达及其免疫原性分析

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中国兽医科学 2013年第9期43卷 941-945页

作者：何雯雯付钰广吉艳红刘宗梁魏建忠朱启运安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为了获得流感病毒M2e多拷贝重组蛋白并分析其免疫原性,通过比对GenBank中H5和H9亚型流感病毒的M2基因,选择其N端由23个氨基酸组成的胞外域（M2e）序列进行合成,并将4个M2e序列与3个位于HA246~260T/B细胞表位交叉串联,在其末端添加酵母... 详细信息

为了获得流感病毒M2e多拷贝重组蛋白并分析其免疫原性,通过比对GenBank中H5和H9亚型流感病毒的M2基因,选择其N端由23个氨基酸组成的胞外域（M2e）序列进行合成,并将4个M2e序列与3个位于HA246~260T/B细胞表位交叉串联,在其末端添加酵母转录因子,然后克隆到pGEX-6P-1载体中,表达重组蛋白。SDS-PAGE和蛋白免疫印迹试验分析表明,重组蛋白成功表达,而后纯化获得高纯度产物。经纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合后肌肉注射BALB/c小鼠,二免2周后采集小鼠血清并用ELISA检测M2e抗体水平;同时分离脾细胞并用ELISPOT检测特异性T细胞的数量。ELISA结果表明重组蛋白能诱导免疫组小鼠产生高水平的M2e特异性抗体;ELISPOT分析显示,在M2e肽段的刺激下,免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞中的斑点形成数达150个。结果表明,成功表达的重组蛋白具有良好免疫原性,为广谱型流感病毒亚单位疫苗的研制奠定了基础。

关键词：禽流感病毒 M2e 重组蛋白免疫原性

鸭坦布苏病毒诱导细胞自噬并促进病毒复制的初步研究

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中国兽医科学 2016年第6期46卷 684-688页

作者：王俊勇吉艳红付钰广朱启运中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

细胞自噬在不同病原体感染过程中有着不同的作用,目前尚未见鸭坦布苏病毒(DTMUV)与细胞自噬之间相互作用的报道。本研究通过激光共聚焦方法观察标记LC3自噬荧光颗粒,以及蛋白免疫印迹检测LC3-I/LC3-Ⅱ转化和P62降解,确定鸭坦布苏病毒能... 详细信息

细胞自噬在不同病原体感染过程中有着不同的作用,目前尚未见鸭坦布苏病毒(DTMUV)与细胞自噬之间相互作用的报道。本研究通过激光共聚焦方法观察标记LC3自噬荧光颗粒,以及蛋白免疫印迹检测LC3-I/LC3-Ⅱ转化和P62降解,确定鸭坦布苏病毒能促进BHK21细胞自噬。自噬药物调节剂(雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤)试验结果表明,细胞自噬有利于DTMUV在BHK21细胞中的复制。表明DTMUV感染BHK21细胞能诱导细胞发生自噬,同时细胞自噬又能促进DTMUV复制。

关键词：鸭坦布苏病毒细胞自噬病毒复制

猪树突状细胞表面分子CD103的表达及其抗血清的制备

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畜牧与兽医 2021年第12期53卷 85-91页

作者：张韬付钰广李宝玉王金泉刘光亮新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为制备抗猪树突状细胞表面分子CD103蛋白的多克隆抗体,首先从NCBI基因库中获取查找猪源CD103的基因序列,并设计引物;其次,采集猪呼吸道淋巴结样品,提取RNA反转录为cDNA,通过PCR的方法扩增得到CD103基因片段;然后将所获扩增的CD103基因... 详细信息

为制备抗猪树突状细胞表面分子CD103蛋白的多克隆抗体,首先从NCBI基因库中获取查找猪源CD103的基因序列,并设计引物;其次,采集猪呼吸道淋巴结样品,提取RNA反转录为cDNA,通过PCR的方法扩增得到CD103基因片段;然后将所获扩增的CD103基因克隆入原核表达载体pET-30a(+)并构建表达重组质粒pET-30a-CD103,将构建的重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导蛋白表达,用NI-NTA亲和层析的方法纯化目的蛋白;最后,将纯化的目的蛋白与ISA206佐剂混合乳化后通过背部皮下免疫途径免疫BALB/c小鼠,经3次加强免疫后收集血清获得多克隆抗体。利用ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验评价制备的多克隆抗体的效价和反应性。结果表明,本研究成功扩增得到猪CD103基因并成功构建重组表达质粒;利用原核表达系统成功表达了猪CD103目的蛋白。Western blot以及IFA结果显示,本研究制备的多克隆抗体特异性高,能与CD103蛋白发生特异性结合;经ELISA滴定结果显示,制备的多克隆抗体在稀释至1∶25 600倍时依旧具有良好的反应性。综上表明,本研究成功制备抗猪CD103蛋白多克隆抗体,为后期制备抗CD103单克隆抗体及研究黏膜免疫过程中CD103阳性树突状细胞的相关研究奠定了基础。

关键词：树突状细胞 CD103蛋白多克隆抗体