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作者：付苏雷新乡医学院

学位级别：硕士

背景高等动物的大脑皮层是一个由多层神经细胞构成的、高度复杂而有序的复合体,它的形成是神经细胞由内及外的装配过程,这个过程受到严格的调控以确保建立正确的、有功能的大脑皮层。有研究表明,通过条件型基因敲除技术在小鼠胚胎时敲除... 详细信息

背景高等动物的大脑皮层是一个由多层神经细胞构成的、高度复杂而有序的复合体,它的形成是神经细胞由内及外的装配过程,这个过程受到严格的调控以确保建立正确的、有功能的大脑皮层。有研究表明,通过条件型基因敲除技术在小鼠胚胎时敲除N-Cadherin基因,会导致大脑皮层出现分层混乱,完全失去正常的层结构,这说明N-Cadherin在皮层发育中有着不可替代的作用。小鼠子宫内电转基因技术是近年来发展起来的在活体内研究基因功能的重要方法,特别适用于中枢神经系统基因功能研究。目的建立小鼠活体子宫内电转基因方法,利用该方法结合RNA干扰技术研究N-Cadherin在小鼠大脑皮层形成过程中对神经元迁移的影响。方法1.小鼠活体子宫内电转基因：取怀孕15d的小鼠,以合适的电转条件对胎鼠大脑皮层室管膜进行定时定位活体电转基因,电转后24h取阳性胎脑,4%多聚甲醛固定,包埋后冷冻冠状切片,DAPI染细胞核观察组织形态结构变化,荧光免疫组织化学法检测α-SMA的表达差异。2.活体电转报告基因质粒的选择：通过小鼠子宫内电转基因技术将pCAGGS-GFP, pEGFP-N1和pCL-GFP三种质粒转染到E15胎鼠的大脑皮层室管膜,通过统计三种质粒表达的荧光强度,筛选一个在活体表达荧光最强的质粒作为报告基因质粒;进一步将筛选出的质粒以不同浓度做电转比较,确定用于后续实验的合适浓度。3. N-Cadherin异常表达质粒(超表达质粒和RNA干扰质粒)的构建与验证：对购自Addgene的小鼠N-Cadherin超表达质粒进行测序,分析质粒结构;小鼠N-Cadherin的RNA干扰质粒,首先通过在线设计干扰片段,然后交由公司合成构建;将异常表达质粒转染HEK293T细胞后,应用免疫荧光及Western blotting检测N-Cadherin表达量的变化,以此验证质粒表达的效率和强度。4.通过小鼠活体子宫电转基因技术和RNA干扰技术相结合,在小鼠胚胎大脑皮层发育过程中实现对N-Cadherin的超表达和抑制表达,应用GFP示踪N-Cadherin超表达和抑制表达后神经元在大脑皮层发育过程中的迁移特征。5.为了研究N-Cadherin是否对干细胞向神经细胞分化具有重要作用,本研究将培养至第六代小鼠脂肪间充质干细胞诱导成为类神经细胞,应用RT-PCR检测诱导后N-Cadherin及其相关蛋白β-catenin、ADAM17、ADAM9等的表达变化。结果1.通过对各种转染条件的探索,成功建立了小鼠子宫内电转基因方法。GFP阳性表达胚胎的脑组织切片,显示GFP转染和正常区域的组织形态结构和a-SMA表达无显著差别。2.通过三种质粒pCAGGS-GFP、pEGFP-N1和pCL-GFP在活体表达GFP荧光强度进行比较,发现相同摩尔浓度下pCAGGS-GFP在小鼠大脑皮层的荧光表达最强;其作为报告基因的适合浓度为0.25μg/μL～0.5μg/μL。3.小鼠N-Cadherin的超表达质粒pEGFP-N-Cad转染HEK293T细胞后,细胞免疫荧光及Western blotting的结果表明,pEGFP-N-Cad能够实现小鼠N-Cadherin的超表达;同时由公司构建的两个干扰质粒N-Cad-shRNA1和shRNA2用同样的方法检测,结果表明两个干扰质粒均有干扰效果,但N-Cad-shRNA1干扰效果更优。4.通过小鼠子宫内电转基因方法成功实现了N-Cadherin在小鼠大脑皮层的抑制表达和超表达,发现抑制N-Cadherin的表达导致大脑皮层神经细胞停滞在VZ区及SVZ区,不能正常迁移;而N-Cadherin的超表达对大脑皮层神经细胞的迁移未见明显影响。5.将小鼠脂肪间充质干细胞体外诱导成类神经细胞后,观察到GFAP表达呈阳性,RT-PCR结果显示N-Cadherin表达显著升高,β-catenin、ADAM9和ADAM17表达显著降低。结论1.成功建立了以GFP作为报告基因的小鼠子宫内电转基因方法。2.筛选出一个在小鼠子宫内电转中适合作报告基因的质粒pCAGGS-GFP,并确定其最佳浓度。3.筛选出一个能够有效干扰小鼠N-Cadherin表达的干扰序列,并获得了相应的干扰质粒。4.在小鼠大脑皮层发育过程中,超表达N-Cadherin后未见对室管膜细胞迁移有明显影响,而干扰N-Cadherin的表达后则明显抑制其向外迁移,暗示N-Cadherin对室管膜神经细胞向外迁移具有重要作用。5.体外诱导小鼠脂肪间充质干细胞成为类神经细胞后,发现N-Cadherin基因表达显著升高,而β-catenin、ADAM9和ADAM17

关键词：子宫内电转 RNA干扰神经钙粘蛋白神经元迁移

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鸡胚发育过程GFP标记视顶盖神经元迁移规律及NF分布特点的研究

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中国免疫学杂志 2013年第4期29卷 412-415页

作者：杨慈清李小英付苏雷李晗林俊堂新乡医学院生命科学技术学院新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室新乡453003

目的:阐明鸡胚发育过程视顶盖层的组织学结构,神经元迁移的模式及神经丝蛋白的分布特点。方法:鸡胚正常培养到第3天(E3),采用鸡胚带壳开窗培养方法,取出3～4 ml蛋清,开窗培养至E5,将质粒pCAGGS-GFP通过活体原位电转基因技术导入视顶盖,... 详细信息

目的:阐明鸡胚发育过程视顶盖层的组织学结构,神经元迁移的模式及神经丝蛋白的分布特点。方法:鸡胚正常培养到第3天(E3),采用鸡胚带壳开窗培养方法,取出3～4 ml蛋清,开窗培养至E5,将质粒pCAGGS-GFP通过活体原位电转基因技术导入视顶盖,电转后继续培养到胚胎发育的E8～E12,取材、固定、包埋、切片后进行荧光免疫组化分析不同时期各层结构的形成和神经丝蛋白的分布。结果:在鸡胚发育过程,视顶盖从内向外最终共形成6层结构,大部分神经元垂直于视顶盖平面迁移至视神经纤维层终止,部分细胞沿视神经纤维层继续水平迁移,在中央灰质层(SGC)层,细胞迁移复杂,既存在纵向也存在横向迁移模式,NF的表达具有明显层的特点。结论:鸡胚发育过程视顶盖神经元不但存在从内向外垂直迁移的模式,而且还存在水平横向迁移的模式。

关键词：胚胎发育视顶盖神经丝蛋白神经元迁移

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鸡胚发育过程N-Cadherin和Neurofilament在视顶盖中的表达模式研究

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中国免疫学杂志 2013年第8期29卷 791-794页

作者：杨慈清李小英付苏雷赵善廷林俊堂新乡医学院生命科学技术学院新乡453003 西北农林科技大学动物医学院杨陵712100

目的:阐明鸡胚发育过程中神经钙黏蛋白(N-Cadherin)和神经丝蛋白(Neurofilament,NF)在视顶盖中的表达模式。方法:从鸡胚发育第6天(E6)开始到孵化的E20,分别取材、固定、包埋和冰冻切片,采用荧光免疫组织化学法检测N-Cadherin和NF蛋白在... 详细信息

目的:阐明鸡胚发育过程中神经钙黏蛋白(N-Cadherin)和神经丝蛋白(Neurofilament,NF)在视顶盖中的表达模式。方法:从鸡胚发育第6天(E6)开始到孵化的E20,分别取材、固定、包埋和冰冻切片,采用荧光免疫组织化学法检测N-Cadherin和NF蛋白在视顶盖各层的表达。结果:在鸡胚发育过程中,从E6开始,N-Cadherin和NF便呈强阳性表达,并且表现出明显各层分布的差异,E10-E14时,在NF强表达的区域与N-Cadherin重叠,E14之后NF的表达减弱,N-Cadherin无明显变化。结论:N-Cadherin和NF在鸡胚发育过程视顶盖的表达呈明显的层的分布,二者的表达既存在差异又有重叠。

关键词：胚胎发育神经钙黏蛋白神经丝蛋白表达模式视顶盖

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小鼠子宫内电转基因方法的建立

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解剖学杂志 2013年第2期36卷 170-172,F0004页

作者：杨慈清李小英卢习付苏雷赵善廷林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南省医用组织再生重点实验室新乡453003 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

目的：建立小鼠子宫内电转基因技术，比较分析转染绿色荧光蛋白（GFP）后对胚胎发育及相关蛋白表达的影响。方法：将怀孕15d的小鼠，水合氯醛麻醉后，取出两侧子宫，用毛细管注射针将2μg／μl的pCAGGS-GFP质粒0．5-1μl准确注射到胎鼠... 详细信息

目的：建立小鼠子宫内电转基因技术，比较分析转染绿色荧光蛋白（GFP）后对胚胎发育及相关蛋白表达的影响。方法：将怀孕15d的小鼠，水合氯醛麻醉后，取出两侧子宫，用毛细管注射针将2μg／μl的pCAGGS-GFP质粒0．5-1μl准确注射到胎鼠侧脑室，在电压40V、每次脉冲60ms，间隔940ms，电脉冲6次的条件下进行定时定位活体电转基因，电转后24h取材，甲醛固定冷冻冠状切片，DAPI染细胞核观察组织形态结构变化，荧光免疫组织化学检测α-SMA的表达差异。结果：妊娠15d孕鼠转染24h后小鼠成活率80％（8／10），胚胎成活率为54．2％（13／24），存活胚胎GFP阳性表达率为61．5％（8／13），GFP阳性表达胚胎脑组织切片，基因转染区域和正常组织区组织形态结构和α-SMA表达不存在差别。结论：成功建立了小鼠子宫内电转基因的方法。

关键词：小鼠转基因方法子宫内电转

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鸡胚发育过程中Shh超表达对脊髓神经纤维投射的抑制作用

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解剖学报 2015年第1期46卷 1-5页

作者：李晗杨慈清王聪睿胡阿珍付苏雷林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003

目的探讨鸡胚发育过程中,sonic hedgehog（Shh）在脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。方法在鸡胚龄2.5～3d（E2.5～E3）时,利用鸡胚活体原位电转基因技术将Shh表达质粒和携带有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的质粒共转入鸡胚脊髓,E6... 详细信息

目的探讨鸡胚发育过程中,sonic hedgehog（Shh）在脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。方法在鸡胚龄2.5～3d（E2.5～E3）时,利用鸡胚活体原位电转基因技术将Shh表达质粒和携带有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的质粒共转入鸡胚脊髓,E6时取材切片,至少取3个材料,免疫荧光技术检验Shh的超表达,利用Open Book技术研究Shh在鸡胚脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。结果在脊髓组织切片水平上,免疫荧光结果表明,Shh在鸡胚脊髓中成功超表达,无论在组织切片上还是通过Open Book技术进行观察,与对照组相比,超表达后转染侧神经纤维都无法正常通过底板投射到对侧,表明Shh在鸡胚脊髓神经纤维投射方面具有重要作用。结论在鸡胚发育过程中,脊髓中Shh超表达后对神经纤维投射具有抑制作用。

关键词： Shh 神经纤维投射活体原位电转 Open Book 鸡胚

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鸡胚发育早期Sonic Hedgehog在脊髓中的异位表达对形态结构及相关蛋白表达的影响

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中国细胞生物学学报 2014年第8期36卷 1123-1127页

作者：李小英杨慈清王聪睿付苏雷李晗林俊堂新乡医学院生命科学技术学院新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室新乡453003

该文主要分析音猬因子（Sonic Hedgehog,Shh）在鸡胚发育过程中对脊髓形态结构的形成和相关蛋白表达的影响。实验过程采用鸡胚带壳开窗培养技术,待胚胎发育至第3 d,将2μg/μL pCAGGS-Shh和0.25μg/μL pCAGGS-GFP质粒以1：8浓度混合,将... 详细信息

该文主要分析音猬因子（Sonic Hedgehog,Shh）在鸡胚发育过程中对脊髓形态结构的形成和相关蛋白表达的影响。实验过程采用鸡胚带壳开窗培养技术,待胚胎发育至第3 d,将2μg/μL pCAGGS-Shh和0.25μg/μL pCAGGS-GFP质粒以1：8浓度混合,将0.1~0.5μL混合液准确地注射到神经管,在电压18 V、每次脉冲60 ms、间隔100 ms、电脉冲6次的条件下进行定时定位活体电转基因,电转后6 h开始到5 d分别收集胚胎,冰冻切片,采用荧光免疫组化和DAPI染色观察组织形态结构及相关蛋白的变化。结果表明,电转后6 h便可以观察到GFP的表达,24 h时Shh在脊髓中的异位表达能够诱导转录因子Nkx2.2（NK2 homeobox 2）的表达,并且能够抑制Pax7（paired-type homeobox 7）的表达,而Shh异位表达时脊髓的结构发生了明显的改变;说明Shh作为脊髓发育过程重要的信号分子,其异位表达能够诱导和抑制相关蛋白的表达,影响脊髓正常发育。

关键词：鸡胚脊髓

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鸡胚发育过程敲减神经型钙黏蛋白表达对视顶盖神经元迁移及神经丝蛋白的影响

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解剖学报 2013年第5期44卷 612-615页

作者：杨慈清李琼付苏雷李晗范义峰郭志坤林俊堂新乡医学院生命科学技术学院细胞工程教研室河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003 新乡市驼人医疗器械有限公司河南新乡453403 新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003

目的阐明鸡胚发育过程神经型钙黏蛋白（N-cadherin）在中枢神经系统中的作用及其对神经丝蛋白（NF）表达的影响。方法鸡胚正常培养到第3天（E3），采用鸡胚带壳开窗培养方法，取出3～4ml蛋清，开窗培养至E5，将N-cadherin干扰载体pGP... 详细信息

目的阐明鸡胚发育过程神经型钙黏蛋白（N-cadherin）在中枢神经系统中的作用及其对神经丝蛋白（NF）表达的影响。方法鸡胚正常培养到第3天（E3），采用鸡胚带壳开窗培养方法，取出3～4ml蛋清，开窗培养至E5，将N-cadherin干扰载体pGPU6-GFP-neo-N-cadherin-shRNA通过活体电转基因技术导入视顶盖，电转后继续培养到E12，每组收集3个胚胎，取材，固定，包埋，切片后进行荧光免疫组织化学分析相关蛋白的表达。结果鸡胚发育过程，敲减N-cadherin表达影响神经元迁移，被敲减的细胞主要停留在室管膜区，在N-cadherin受到抑制表达的区域，NF的表达也受到抑制，其表达明显减弱。结论 N-cadherin的抑制表达可导致神经元的迁移发生紊乱，影响NF的表达。

关键词：胚胎发育视顶盖神经型钙黏蛋白神经丝蛋白活体电转鸡胚

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神经型钙黏蛋白对小鼠脂肪间充质干细胞的成神经作用

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解剖学杂志 2015年第6期38卷 659-659,671,封4页

作者：贾阳阳杨慈清付苏雷李晗郭志坤骆建凯新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室

目的:探讨神经型钙黏蛋白(N-cadherin)在小鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)成神经分化中的作用.方法;用差速培养法获取小鼠ADMSCs,传至第5代,经成神经诱导液诱导ADMSCs 7 d后,免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE... 详细信息

目的:探讨神经型钙黏蛋白(N-cadherin)在小鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)成神经分化中的作用.方法;用差速培养法获取小鼠ADMSCs,传至第5代,经成神经诱导液诱导ADMSCs 7 d后,免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP2)的表达,半定量PCR检测细胞中N-cadherinmRNA的表达;采用N-cadherin对细胞进行基因修饰,免疫荧光检测神经丝蛋白(NF)和GFAP的表达.结果:ADMSCs经成神经诱导7d后表达GFAP、NSE和MAP2,半定量PCR结果显示,与对照组相比成神经诱导后的细胞表达N-cadherin显著增高.转染N-cadherin的N-cadherin细胞培养24h后发出细长的突起,与相邻细胞之间形成网状连接.免疫荧光结果显示,转染后的细胞NF和GFAP表达阳性.结论:ADMSCs在体外多种作用下,具有向神经细胞分化的潜能.N-cadherin转染后能改变ADMSCs的形态,并且在ADMSCs向神经分化中发挥一定的作用.

关键词：神经型钙黏蛋白脂肪间充质干细胞成神经诱导半定量PCR 转染

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ADAM17异常表达对神经前体细胞迁移的影响

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神经解剖学杂志 2014年第6期30卷 683-687页

作者：杨慈清李小英王聪睿付苏雷李晗林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南省医用组织再生重点实验室新乡453003

目的：分析在胚胎发育过程ADAM17异常表达对神经前体细胞迁移的影响。方法：采用鸡胚活体电转和小鼠子宫内电转基因技术,在鸡胚发育的第5 d（E5）,将2μg/μl的p CAGGS-ADAM17和0.25μg/μl的p CAGGS-GFP质粒以1∶8混合液0.25-0.5μl准... 详细信息

目的：分析在胚胎发育过程ADAM17异常表达对神经前体细胞迁移的影响。方法：采用鸡胚活体电转和小鼠子宫内电转基因技术,在鸡胚发育的第5 d（E5）,将2μg/μl的p CAGGS-ADAM17和0.25μg/μl的p CAGGS-GFP质粒以1∶8混合液0.25-0.5μl准确地注射到视顶盖内,然后电转基因,E12时收集胚胎;小鼠胚胎发育的15 d（E15）进行子宫内电转,将2μg/μl的shRNA-ADAM17和0.25μg/μl的p CAGGS-GFP质粒以1∶8混合液0.25-0.5μl准确地注射到一侧脑室,电转基因后E20时收集胚胎。冰冻切片,采用免疫荧光组织化学和DAPI染色观察组织形态结构及相关蛋白的变化。结果：在鸡胚模型中,ADAM17的超表达并不会明显的引起神经前体细胞迁移的改变,对细胞核转录因子Pax7的表达也没有影响;在鼠胚模型中,ADAM17的抑制表达能够引起神经前体细胞迁移受阻,但并没有引起大脑皮层各层的结构的变化。结论：ADAM17的抑制表达对神经前体细胞的迁移具有抑制作用,但并不会引起大脑皮层结构的改变。

关键词： ADAM17 神经前体细胞鸡胚小鼠胚胎

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Caspase-3和Caspase-9在PC-12细胞移植肿瘤模型中的表达及意义

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黑龙江畜牧兽医 2015年第5期 27-29,268页

作者：李小英杨慈清王聪睿付苏雷林俊堂新乡医学院生命科学技术学院河南新乡453003 河南省医用组织再生重点实验室河南新乡453003

为了在建立的PC-12细胞肿瘤移植模型基础上,对不同时间点肿瘤组织中的Caspase-3和Caspase-9的表达进行检测,探讨Caspase-3和Caspase-9在肿瘤发展过程中的作用和意义,试验将指数生长期的PC-12细胞以0.1 m L(1×107个/m L)的密度接种于出... 详细信息

为了在建立的PC-12细胞肿瘤移植模型基础上,对不同时间点肿瘤组织中的Caspase-3和Caspase-9的表达进行检测,探讨Caspase-3和Caspase-9在肿瘤发展过程中的作用和意义,试验将指数生长期的PC-12细胞以0.1 m L(1×107个/m L)的密度接种于出生第7天的昆明白小鼠右前肢腋窝皮下,在接种后的不同时间点(7,14,21天)分别进行取材,将肿瘤块及邻近组织一并取下,通过多聚甲醛固定、包埋剂包埋后进行冰冻切片,采用荧光免疫组织化学法对Caspase-3和Caspase-9的表达进行检测。结果表明:刚出生7天的昆明白小鼠,接种PC-12细胞后7天时便可以明显观察到肿瘤块的形成,在14天时肿瘤块最大,21天时肿块减小,到28天时肿瘤块基本消失;对照组小鼠肌肉组织中Caspase-3和Caspase-9都呈现低表达。在移植肿瘤7天的肿块实体组织中,Caspase-3和Caspase-9都呈阳性表达;在14天时实体组织中表达降低,但是在周围组织中的表达增强;在21天时周围组织的表达也减弱。说明普通昆明白小鼠幼鼠中不能够建立真正的肿瘤模型,但是短期内仍能形成瘤块,在不同时间点,Caspase-3和Caspase-9表达具有明显的区域和量的差异,但是Caspase-3和Caspase-9表达部位和表达量的变化具有相似性。

关键词： PC-12细胞细胞移植肿瘤 Caspase-3 Caspase-9

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