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法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及其在中华豆芫菁斑蝥素生物合成途径中功能分析

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法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及其在中华豆芫菁斑蝥素生物合成途径...

作者：付楠霞西北农林科技大学

学位级别：硕士

斑蝥素(cantharidin)又称芫菁素,是由鞘翅目(Coleoptera)芫菁科(Meloidae)昆虫产生的蔽类防御物质,具有重要的实用价值。探索斑蝥素的生物合成路径有助于实现对斑蝥素的大规模开发利用。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate syntha... 详细信息

斑蝥素(cantharidin)又称芫菁素,是由鞘翅目(Coleoptera)芫菁科(Meloidae)昆虫产生的蔽类防御物质,具有重要的实用价值。探索斑蝥素的生物合成路径有助于实现对斑蝥素的大规模开发利用。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是MVA途径下游分支点的关键酶,探索其与斑蝥素生物合成的关系将会加深我们对斑蝥素合成路径的认识。本研究的目的主要由两个:一是通过RT-PCR与RACE技术相结合的手段克隆中华豆芫菁(EpicautachinensisLaporte)FPPS基因,并用一系列生物信息学软件分析并预测该基因的生物学功能;二是通过RNAi技术干扰FPPS mRNA在中华豆芫菁体内的表达,通过RT-qPCR技术检测不同实验组试虫体内FPPSmRNA表达量,确定RNA干扰效果,并通过气相色谱内标法检测各组试虫体内的斑蝥素含量,进而推断出二者之间的关系。本实验的主要研究成果如下:1.获得中华豆芫菁Echinensis法尼基焦磷酸合酶基因FPPS全长cDNA序列,命名为EcFPPS(GenBank登录号KC758147),序列分析结果表明,该基因全长1 842bp,其中5’非编码区144 bp,3’非编码区423bp,开放阅读框1 275 bp,共编码424个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为49.2 kD,理论等电点pI为8.89,预测分子式为C2188H6604N34520635S24,不稳定系数为38.68,总平均亲水系数为-0.449,为疏水的稳定蛋白。序列分析发现,中华豆芫菁与其他6种昆虫FPPS在氨基酸水平上具有72.56%的相似性,且其近N端具有R**S四肽基序,此外还包含7个异戊烯基转移酶保守区和2个典型的DD**D的天冬氨酸富含区。与已知的20余种昆虫FPPS氨基酸构建的系统发育树显示中华豆芫菁E.chinensis与鞘翅目拟步甲科昆虫赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)FPPS氨基酸的进化关系最近。EcFPPS的亚细胞定位进行预测发现其N端具有1段明显的线粒体靶向肽。2.对中华豆芫菁雄虫交尾后0、2、4、6、8和10天体内斑蝥素含量及FPPS mRNA表达量的测定结果显示,雄虫体内斑蝥素含量在刚交尾结束时很低,但到第2天时斑蝥素含量已增加了4倍,紧接着在交尾后第4天斑蝥素达到峰值,约为刚交尾后试虫体内斑蝥素含量的17倍,由此我们可以推断雄虫在完成交尾后重新合成了斑蝥素。同样时间内,FPPS mRNA表达量在交尾后第2天略有增加,随后维持稳定。相关性分析显示二者无显著的相关性,初步推测FPPS基因在转录水平的表达量可能与斑蝥素的生物合成关系不大。3.通过RT-qPCR技术检测了交尾后第2、4、6、8、10天内不同实验组试虫体内FPPS mRNA表达量,结果显示RNAi技术成功地抑制了中华豆芫菁雄虫FPPS mRNA的表达,抑制率在93%以上。对不同处理组试虫体内斑蝥素含量检测表明,在FPPS mRNA表达正常的情况下,斑蝥素含量在交尾后第四天达到峰值,随后稍有降低并维持在这一稳定水平;当FPPSmRNA表达量受到抑制时,斑蝥素的含量在交尾后第2天即到达稳定水平。这表明,FPPS被干扰后,中华豆芫菁体内仍能继续合成斑蝥素,且斑蝥素含量达到稳定水平的时间也提前了。本研究首次克隆得到了中华豆芫菁FPPS基因的全长cDNA序列,并对其进行了相关的生物信息学分析,并基于RNAi技术成功地抑制了交尾后中华豆芫菁雄虫体内FPPS基因编码mRNA的表达量,得出斑蝥素在FPPS被干扰后,中华豆芫菁仍能继续合成斑蝥素,且达到稳定水平的斑蝥素含量与对照组试虫无显著性差异。但值得注意的是FPPS被干扰后中华豆芫菁雄虫体内斑蝥素含量达到稳定含量的时间也提前了。这表明,FPPS基因在转录水平的表达量的变化对斑蝥素生物合成的影响不大。

关键词：中华豆芫菁 FPPS RACE技术 RNAi 斑蝥素

化学农药对茶小绿叶蝉成虫的防效及其原因探究

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茶叶科学 2023年第4期43卷 544-552页

作者：邹佳婷郭宇航边磊罗宗秀李兆群修春丽付楠霞蔡晓明中国农业科学院茶叶研究所浙江杭州310008 中国农业科学院研究生院北京100081

茶小绿叶蝉(Empoasca onukii Matsuda)是茶园重要害虫,目前主要以化学防治为主,但化学农药对成虫的防治效果尚不明确。通过田间试验,评估了化学农药对茶小绿叶蝉成虫的防效;并通过室内模拟试验,探究成虫防效不佳的原因。结果显示,田间... 详细信息

茶小绿叶蝉(Empoasca onukii Matsuda)是茶园重要害虫,目前主要以化学防治为主,但化学农药对成虫的防治效果尚不明确。通过田间试验,评估了化学农药对茶小绿叶蝉成虫的防效;并通过室内模拟试验,探究成虫防效不佳的原因。结果显示,田间对若虫防效很好的化学农药对成虫的防治效果不理想。室内研究显示,以田间施药浓度甚至更低的浓度喷施整株茶梢时,成虫死亡率均为100%。当茶梢中部着药时,成虫死亡率最高,为63.33%~71.67%;但茶梢顶部着药时,成虫死亡率仅为20.00%~28.33%。当茶梢顶部着药时,通过增加茶梢周围的遮光范围或降低茶梢顶部的光照强度,可增加成虫的死亡率。这些结果表明,茶小绿叶蝉成虫活动范围主要在茶梢中部应是化学农药不能在田间对其有效控制的主要原因,且成虫这一习性与光强有着一定的关系。这一发现为田间茶小绿叶蝉成虫的防治提供了借鉴,有助于进一步提高化学农药对茶小绿叶蝉的防治效果。

关键词：茶小绿叶蝉成虫化学农药防治效果影响因素

一株球孢白僵菌的分离鉴定及其对茶丽纹象甲幼虫的室内致病力测定

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中国生物防治学报 2023年第5期39卷 1104-1112页

作者：付楠霞罗宗秀李兆群边磊修春丽陈宗懋蔡晓明中国农业科学院茶叶研究所杭州310008

茶丽纹象甲是我国茶园重要的食叶害虫之一,目前以化学农药防治为主,亟需开发绿色生态环保的防控技术。为筛选出可防治茶丽纹象甲的生防菌株,本研究从田间采集了自然感病致死的茶丽纹象甲幼虫僵虫并分离出一株虫生真菌菌株。形态学特征... 详细信息

茶丽纹象甲是我国茶园重要的食叶害虫之一,目前以化学农药防治为主,亟需开发绿色生态环保的防控技术。为筛选出可防治茶丽纹象甲的生防菌株,本研究从田间采集了自然感病致死的茶丽纹象甲幼虫僵虫并分离出一株虫生真菌菌株。形态学特征和分子系统进化关系分析显示该菌株为球孢白僵菌Beauveria bassiana,命名为Maure 1.1。在自然化蛹和羽化温度(22℃)条件下,茶丽纹象甲幼虫在接种1×10^(5)~1×10^(8)个孢子/m L的球孢白僵菌菌株Maure 1.1孢子液后,其感病死亡率随接种后观察时间的延长而增加。其中,用最大浓度孢子通过浸虫和拌土法处理11 d时,茶丽纹象甲幼虫的累计校正死亡率分别为76.67%和73.33%,LC_(50)分别为2.00×10^(3)和1.11×10^(3)个孢子/mL,LT_(50)分别为7.87和7.84 d。上述结果表明,球孢白僵菌Maure 1.1对茶丽纹象甲幼虫具有致病活力,可作为茶丽纹象甲生物防治的候选菌株。

关键词：茶丽纹象甲球孢白僵菌分离鉴定致病力测定生物防治

锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶的cDNA克隆、序列分析及原核表达

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中国农业科学 2014年第2期47卷 273-283页

作者：付楠霞翟枫姜鸣吕淑敏张雅林西北农林科技大学植物保护学院植保资源与病虫害治理教育部重点实验室

【目的】法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶,获得芫菁法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)是探究其与斑蝥素生物合成途径关系的基础。论文旨在克隆锯角豆芫菁(Epicauta gorhami ... 详细信息

【目的】法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶,获得芫菁法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)是探究其与斑蝥素生物合成途径关系的基础。论文旨在克隆锯角豆芫菁(Epicauta gorhami Marseul)FPPS,预测该基因及其编码蛋白的结构、性质与功能,并实现其编码蛋白的原核表达。【方法】首先根据已知昆虫FPPS编码蛋白的保守区序列,利用CODEHOP软件设计简并引物,利用RT-PCR获得锯角豆芫菁的cDNA模板,巢式PCR扩增锯角豆芫菁FPPS保守区;随后根据所得的保守区片段设计特异性引物,运用RACE技术分别克隆锯角豆芫菁FPPS 3′和5′端序列;然后根据预测的FPPS开放阅读框(ORF)设计ORF区特异性引物,巢式PCR扩增编码区序列;最后用DNAMAN拼接获得锯角豆芫菁的全长cDNA序列。运用DNAMAN、MEGA 5.05、ProtParam及TargetP 1.1 Server等多种生物信息学软件对该基因全长cDNA序列、Fps系统进化关系及其基本理化性质、FPPS蛋白的亚细胞定位等进行分析;将锯角豆芫菁FPPS与pET28a(+)连接,构建原核表达载体pET28a(+)-EgFPPS并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,IPTG诱导融合蛋白的原核表达。分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时段收集的菌液超声波破碎后,分离上清及沉淀并进行煮沸处理,SDS-PAGE检测融合蛋白的可溶性;Western Blot印迹杂交验证目的蛋白的表达【。结果】获得锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶基因FPPS全长cDNA序列,命名为EgFPPS(GenBank登录号KC840040),序列分析结果表明,该基因全长1 857 bp,其中5′非编码区146 bp,3′非编码区436 bp,开放阅读框1 275 bp,共编码424个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为49.2 kD,理论等电点pI为8.89,预测分子式为C2192H3457N605O632S25,不稳定系数为38.62,总平均亲水系数为-0.429,为疏水的稳定蛋白。序列分析发现,锯角豆芫菁与其他6种昆虫FPPS在氨基酸水平上具有72.56%的同源性,且其近N端具有R**S四肽基序,此外还包含7个异戊烯基转移酶保守区和两个典型的DD**D的天冬氨酸富含区。系统发育树显示锯角豆芫菁与鞘翅目拟步甲科昆虫赤拟谷盗进化关系最近。EgFPPS的亚细胞定位进行预测发现其N端具有一段明显的线粒体靶向肽。原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1 mmol·L-1的IPTG诱导4 h即能实现融合蛋白的高效表达;融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western Blot印迹检测也证实大肠杆菌DE3中表达了一个分子量约为49 kD的蛋白质,与预测分子量大小基本一致。【结论】成功从芫菁科昆虫克隆得到FPPS,并成功实现了其编码蛋白的原核表达,为后期探索其在芫菁科昆虫体内斑蝥素生物合成途径中的功能提供理论基础。

关键词：锯角豆芫菁 FPPS RACE技术生物信息学原核表达

鳞翅目昆虫类型Ⅱ性信息素环氧二烯同分异构体的分离制备

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应用昆虫学报 2022年第2期59卷 268-275页

作者：罗宗秀张新忠崔少伟李兆群蔡晓明边磊修春丽付楠霞陈宗懋中国农业科学院茶叶研究所杭州310008

【目的】为建立一种适用于鳞翅目昆虫类型Ⅱ性信息素环氧二烯同分异构体的分离制备方法。【方法】本研究采用半制备高效液相色谱正向系统,结合蒸发光散射检测器和SunFire Silica OBD制备柱,建立了分离制备鳞翅目昆虫类型Ⅱ性信息素方法... 详细信息

【目的】为建立一种适用于鳞翅目昆虫类型Ⅱ性信息素环氧二烯同分异构体的分离制备方法。【方法】本研究采用半制备高效液相色谱正向系统,结合蒸发光散射检测器和SunFire Silica OBD制备柱,建立了分离制备鳞翅目昆虫类型Ⅱ性信息素方法,制备样品经气相色谱质谱联用仪分析并最终通过田间诱捕试验验证。【结果】采用0.5%四氢呋喃的正己烷溶液为流动相,流速为7 mL/min,蒸发光散射检测器漂移管温度为40℃,在增益设为500的条件下运行,类型Ⅱ性信息素环氧二烯同分异构体的分离效果较好,分离度为2.72-3.10,制备样品单体纯度高,制备样品回收率为80.73%-98.47%;将分离制备的C18环氧二烯同分异构体混合物应用于田间诱捕试验,结果表明本方法制备的顺3,顺9-6,7-环氧十八碳二烯单体结合顺3,顺6,顺9-十八碳三烯可以专一性引诱灰茶尺蠖Ectropis grisescens,28 d共计诱杀45.33头/诱捕器;制备的顺3,顺6-9,10-环氧十八碳二烯单体结合顺3,顺6,顺9-十八碳三烯可以专一性引诱优美苔蛾Miltochrista striata,28 d共计诱杀44.00头/诱捕器。【结论】半制备高效液相色谱法是一种简单便利,高效易行的类型Ⅱ性信息素环氧二烯同分异构体的分离制备方法,可满足实验研究与小面积田间应用的需求。

关键词：类型Ⅱ性信息素环氧二烯同分异构体分离制备

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茶蚕大陆种群性信息素鉴定与虫口监测应用

茶叶科学 2022年第1期42卷 101-108页

作者：崔少伟赵冬香张家侠商建农蔡晓明李兆群边磊修春丽付楠霞陈宗懋罗宗秀中国农业科学院茶叶研究所浙江杭州310008 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海南海口571101 安徽省农业科学院茶叶研究所安徽黄山245000 杭州市西湖区农业技术推广服务中心浙江杭州310013

茶蚕(Andraca bipunctata Walker)是我国一种重要的茶树食叶害虫,严重时其幼虫可将整株茶树的叶片取食殆尽,造成极大危害。本研究对我国茶蚕大陆种群性信息素进行了鉴定,利用正己烷浸提法对求偶高峰期的茶蚕雌虫性信息素进行了提取,利... 详细信息

茶蚕(Andraca bipunctata Walker)是我国一种重要的茶树食叶害虫,严重时其幼虫可将整株茶树的叶片取食殆尽,造成极大危害。本研究对我国茶蚕大陆种群性信息素进行了鉴定,利用正己烷浸提法对求偶高峰期的茶蚕雌虫性信息素进行了提取,利用气相色谱-触角电位联用仪(GC-EAD)筛选性信息素提取物中的活性成分,运用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对活性成分进行分析,采用触角电位技术(EAG)测试了性信息素成分的电生理活性,并通过田间诱捕试验筛选出性信息素最佳剂量,最后利用性信息素对海南五指山地区的茶蚕种群进行了监测。GC-EAD结果显示,茶蚕性信息素提取物中只有1种成分可引起雄虫的触角电位反应。GC-MS分析结果初步确定该活性成分为顺11,顺14-十八碳醛(E11,E14-18Ald)。EAG测试和田间引诱试验验证了性信息素鉴定结果,田间诱捕数据显示不同剂量的性信息素在田间的引诱效果不同,当剂量为0.9 mg时,田间引诱效果最佳。虫口监测结果表明,茶蚕性信息素是一种理想的虫口监测方法,利用该方法明确海南五指山地区5—10月共有两代茶蚕,成虫高峰期为6月17日和8月27日。本研究结果为我国茶叶主产区利用性信息素进行诱杀防治或虫口监测提供了理论依据。

关键词：茶蚕性信息素鉴定虫口监测

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茶园有害生物绿色精准防控技术集成应用

中国茶叶 2022年第10期44卷 1-7页

作者：蔡晓明边磊罗宗秀李兆群修春丽付楠霞陈宗懋中国农业科学院茶叶研究所浙江杭州310008

绿色防控技术的集成应用与创新发展,对于减少茶园化学农药用量、提升茶叶质量安全和茶园生态安全水平同样重要。文章对绿色防控技术集成的基本原则、茶树害虫绿色精准防控的集成应用和茶树有害生物绿色精准防控的未来发展等几方面进行... 详细信息

绿色防控技术的集成应用与创新发展,对于减少茶园化学农药用量、提升茶叶质量安全和茶园生态安全水平同样重要。文章对绿色防控技术集成的基本原则、茶树害虫绿色精准防控的集成应用和茶树有害生物绿色精准防控的未来发展等几方面进行了介绍和展望,以期促进茶园有害生物绿色防控技术的创新发展。

关键词：茶园有害生物绿色防控技术集成应用

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茶树害虫性信息素防控原理与技术应用

中国茶叶 2022年第3期44卷 1-9页

作者：罗宗秀付楠霞李兆群蔡晓明边磊修春丽陈宗懋中国农业科学院茶叶研究所浙江杭州310008

性信息素是昆虫求偶和交配行为中发挥重要作用的信息化合物,自性信息素被发现之初,科学家们就考虑利用其高效的行为调控能力开发害虫防治技术。随着性信息素相关研究的不断深入,基于性信息素的防治技术已经开始应用于农作物保护。茶树... 详细信息

性信息素是昆虫求偶和交配行为中发挥重要作用的信息化合物,自性信息素被发现之初,科学家们就考虑利用其高效的行为调控能力开发害虫防治技术。随着性信息素相关研究的不断深入,基于性信息素的防治技术已经开始应用于农作物保护。茶树是一种高经济价值作物,茶叶是一种人们喜爱饮用的饮料,利用性信息素防治茶树害虫具有高效、环保、专一性强等优点,能减少化学农药使用保证茶叶质量安全,具有显著的经济价值和社会效益。文章介绍性信息素概念与应用原理、茶树害虫性信息素研究进展和茶树害虫性信息素防控技术应用,以期为茶树害虫性信息素相关研究和防控技术应用提供参考。

关键词：茶树性信息素防控应用

茶园绿色防控“十三五”进展及“十四五”发展方向

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中国茶叶 2021年第9期43卷 66-73,76页

作者：蔡晓明罗宗秀边磊李兆群修春丽付楠霞陈宗懋中国农业科学院茶叶研究所浙江杭州310008

总结了"十三五"期间,我国茶园有害生物绿色防控领域取得的重要研究进展,分析了"十四五"期间面临的压力与挑战,提出了相应的应对策略和发展方向,为将来我国的茶园有害生物绿色防控研究工作提供参考。

关键词：茶树有害生物绿色防控 “十三五” 进展 “十四五” 发展方向