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作者：井沆贵阳医学院

学位级别：硕士

【目的】通过复制血管性痴呆（Vascular Dementia, VaD）大鼠模型并对其进行行为学和钙通道相关信号通路检测，探讨VaD大鼠钙通道信号通路的改变，分析其改变引起记忆认知障碍的可能机制。同时进一步探讨骨髓间充质干细胞（bone mesench... 详细信息

【目的】通过复制血管性痴呆（Vascular Dementia, VaD）大鼠模型并对其进行行为学和钙通道相关信号通路检测，探讨VaD大鼠钙通道信号通路的改变，分析其改变引起记忆认知障碍的可能机制。同时进一步探讨骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）移植对VaD大鼠认知功能的改善和钙通道以及与钙通道相关信号通路的影响机制，为BMSCs的临床应用提供适用性资料。【方法】（1）通过贴壁筛选的方法分离、培养BMSCs，至第五代细胞纯化后，用流式细胞仪对所培养BMSCs进行流式表面抗原鉴定，成纤维生长因子（basicfibroblast growth factorbfic，bFGF）和丁羟基茴香醚（Beta HydroxyAcid，BHA）诱导BMSCs分化为神经元细胞，并对诱导后的细胞，进行神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(Neuron speeific enolase，NSE)表达的免疫组化鉴定。诱导后的BMSCs于移植前24h在其培养液中加入浓度为10μmol/L的标记物5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)，离心收集标记后的BMSCs，备用。（2）提前进行大鼠水迷宫智力筛查，大鼠随机分为对照组和模型组，模型组用改良Pulsinelli’s四血管阻断法复制VaD模型，对照组只分离椎动脉和颈总动脉，不进行椎动脉凝闭和颈总动脉的夹闭。30天后筛选模型组中认知功能障碍的大鼠再分为模型对照组和干细胞治疗组。干细胞治疗组将诱导后被BrdU标记的BMSCs细胞悬液通过脑立体定位仪注射到大鼠侧脑室，对照组和模型对照组注射等量培养基。细胞移植30天后进行水迷宫行为学测试，各组大鼠断头取脑，制备石蜡切片，苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色观察大鼠大脑海马区病理变化。（3）免疫组化染色方法检测移植的细胞在大鼠脑组织的表达情况;检测血浆和海马组织一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NOS）活性和NO含量;提取血细胞和海马组织总RNA，Real-time PCR方法测定钙调蛋白（Calmodulin，CaM）、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ（Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseII,CaMKII）和NOS mRNA表达含量;提取海马组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量，用蛋白免疫印迹(Western Blotting)法检测钙调蛋白依赖性激酶（CaMKⅡ）和与钙通道相关的NOS蛋白酶的表达情况。比较对照组、模型对照组组和干细胞治疗组中各项指标，并对各组的含量做出差异性统计学分析。【结果】（1）通过贴壁筛选法分离培养BMSCs，体外传代扩增后，流式细胞仪检测第五代BMSCs表达粘附分子CD90阳性率99.4%，CD29阳性率96.8%，CD44阳性率99.6%，CD45阳性率3.7%。诱导后的BMSCs可表达NSE和Nestin。（2）模型对照组组和干细胞治疗组与对照组相比，模型对照组组和干细胞治疗组大鼠平均逃避潜伏期明显长于对照组，撤去平台后，模型对照组和干细胞治疗组第1次穿越平台所用时间延长，穿越站台次数明显减少，存在统计学意义（P＜0.05）。干细胞治疗组较模型对照组逃避潜伏期缩短（P＜0.05），第1次穿越平台时间缩短，穿越平台次数增加，差异有统计学意义。（3）干细胞治疗组在移植后30天大鼠脑组织双侧半球切片中可见BrdU染色阳性细胞分布，BrdU阳性反应物呈棕褐色、颗粒状或弥漫性分布，位于细胞核内。（4）通过对比分析对照组、模型对照组和干细胞治疗组与钙通道及钙信号相关指标的表达差异，结果显示模型对照组上述酶的活性、mRNA和蛋白表达水平较对照组高（P＜0.05），而干细胞治疗组与模型对照组相比，CaMKⅡ、CaM、NOS和NO表达降低（P＜0.05）。【结论】（1）BMSCs在体外经bFGF/BHA诱导可分化为神经元样细胞，且可表达Nestin和NSE。（2）VaD模型大鼠与钙通道主要相关的NOS和CaMKII信号表达增高，提示钙超载参与到了VaD所引起的认知障碍机制中。(3)诱导后的BMSCs可以被BrdU标记，以立体定向途径移植的BMSCs可在宿主脑内存活。(4)诱导后的BMSCs可通过改善神经受损引起的钙超载来改善模型大鼠的认知功能。

关键词：骨髓间充质干细胞血管性痴呆 NOS CaMKII 神经元分化诱导

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血管性痴呆模型大鼠NOS、NO的表达

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中风与神经疾病杂志 2013年第10期30卷 902-905页

作者：井沆肖雁官志忠贵阳医学院分子生物学重点实验室贵州贵阳550004

目的观察血管性痴呆大鼠血浆和海马组织一氧化氮合酶和一氧化氮表达情况,探讨血管性痴呆的发病机制。方法采用改良的四血管法[1](4-VO)制备大鼠VaD模型,Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,生化酶法检测大鼠血浆和脑组织tNOS和iNOS的酶... 详细信息

目的观察血管性痴呆大鼠血浆和海马组织一氧化氮合酶和一氧化氮表达情况,探讨血管性痴呆的发病机制。方法采用改良的四血管法[1](4-VO)制备大鼠VaD模型,Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,生化酶法检测大鼠血浆和脑组织tNOS和iNOS的酶活性以及NO含量,Western-blot法检测海马组织NOS蛋白表达情况,并对1月组和2月组表达差异进行对比分析。结果与对照组相比,VaD模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,第一次穿越平台时间延长,穿越平台次数减少(P<0.05);VaD模型大鼠血浆及海马组织tNOS、iNOS活性和NO的含量明显增高(P<0.05);VaD模型大鼠海马组织NOS蛋白表达明显增高(P<0.01)。模型1月组血浆及海马组织NOS活性和NO的含量比模型2月组表达增高。结论 NOS酶活升高及海马组织高表达NOS可能是VaD海马神经元受损、学习记忆环路破坏、大鼠认知功能下降的原因。

关键词：血管性痴呆一氧化氮合酶海马四血管法 NO

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骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆大鼠认知功能及一氧化氮合酶的表达的影响

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临床神经病学杂志 2015年第4期28卷 276-280页

作者：井沆田茂董艳军官志忠肖雁贵阳医学院分子生物学重点实验室 550004 贵阳医学院病理学教研室 550004

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)侧脑室移植对血管性痴呆(Va D)大鼠认知功能及一氧化氮合酶(NOS)的表达的影响。方法将SD大鼠分为BMSCs组、培养基组及假手术组。BMSCs组大鼠侧脑室注射BMSCs,培养基组大鼠侧脑室注射DMEM基础培养液。移... 详细信息

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)侧脑室移植对血管性痴呆(Va D)大鼠认知功能及一氧化氮合酶(NOS)的表达的影响。方法将SD大鼠分为BMSCs组、培养基组及假手术组。BMSCs组大鼠侧脑室注射BMSCs,培养基组大鼠侧脑室注射DMEM基础培养液。移植后30 d比较各组大鼠学习记忆能力,血浆和海马组织TNOS和i NOS的酶活性及NO水平、血液NOS mRNA、海马组织NOS mRNA、NOS蛋白水平。结果与假手术组比较,BMSCs组及培养基组逃避潜伏期及第1次穿越平台时间显著延长(均P<0.05),穿越平台次数明显减少(P<0.05)。与培养基组比较,BMSCs组大鼠逃避潜伏期及第1次穿越平台时间显著缩短(均P<0.05),穿越平台次数显著增加(均P<0.05)。培养基组和BMSCs组大鼠血浆、海马组织t NOS、i NOS酶活性及NO水平均显著高于假手术组(均P<0.05)。BMSCs组大鼠血浆、海马组织t NOS、i NOS酶活性及NO水平均明显低于培养基组(均P<0.05)。与假手术组比较,培养基组和BMSCs组血浆、海马组织NOS mRNA及海马组织NOS蛋白表达水平均显著增高(均P<0.01)。BMSCs组血浆、海马组织NOS mRNA及海马组织蛋白NOS表达水平较培养基组显著降低(均P<0.05)。结论 BMSCs侧脑室移植能够降低Va D大鼠的NO水平及t NOS、i NOS酶活性,从而发挥一定神经保护作用,改善大鼠的认知功能。

关键词：血管性痴呆骨髓间充质干细胞一氧化氮合酶认知功能

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骨髓间充质干细胞治疗血管性痴呆大鼠行为学及海马CaM、CaMK Ⅱ表达水平的影响

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中风与神经疾病杂志 2015年第2期32卷 148-150页

作者：井沆田茂董艳军官志忠肖雁贵阳医学院分子生物学重点实验室贵州贵阳550004 贵阳医学院病理教研室贵州贵阳550004

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal cells,BMSCs)侧脑室移植治疗血管性痴呆(vascular dementia,VaD)模型对大鼠行为学及海马钙调蛋白(calmodulin,CaM)、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)表达的影响。方法以全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal cells,BMSCs);流式细胞仪对所培养BMSCs进行表面抗原鉴定;成纤维生长因子(basic fibroblast growth factorbfic,b FGF)和丁羟基茴香醚(beta hydroxy acid,BHA)诱导BMSCs分化为神经元细胞,并对诱导后的细胞,进行神经元特异性的免疫组化鉴定;采用改良四血管法制备Va D模型,设立对照组,造模4 w后将VaD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、BMSCs治疗组。观察4 w后实验大鼠的行为学表现及应用Real-time PCR检测海马CaM、CaMKⅡ表达水平。结果 BMSCs治疗组行为学表现有明显改善。其海马CaM、CaMKⅡmRNA表达比模型组降低(P<0.05)。结论侧脑室移植BMSCs显著改善VaD大鼠行为学表现,并使其海马CaM、CaMKⅡ表达降低。

关键词：血管性痴呆骨髓间充质干细胞海马 CaM CaMKⅡ

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外源性硫化氢对血管性痴呆模型大鼠学习记忆的影响

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中风与神经疾病杂志 2014年第11期31卷 969-972页

作者：田茂井沆董艳军肖雁官志忠贵阳医学院分子生物学重点实验室贵州贵阳550004 贵州省人民医院贵州贵阳550004

目的观察外源性硫化氢(Hydrogen Sulfide,H2S)对血管性痴呆大鼠(Vascular Dementia,Va D)学习记忆改善情况及血管性痴呆大鼠血浆硫化氢含量的变化。方法采用改良的四血管法(4-VO)复制大鼠Va D模型,将模型大鼠按给药干预时间分为1 d组、... 详细信息

目的观察外源性硫化氢(Hydrogen Sulfide,H2S)对血管性痴呆大鼠(Vascular Dementia,Va D)学习记忆改善情况及血管性痴呆大鼠血浆硫化氢含量的变化。方法采用改良的四血管法(4-VO)复制大鼠Va D模型,将模型大鼠按给药干预时间分为1 d组、7 d组、30 d组,每组分为假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组。低剂量组每日腹腔注射H2S供体Na HS 30μmol/kg,高剂量组每日腹腔注射H2S供体Na HS 100μmol/kg,假手术组与模型组每日腹腔注射等量生理盐水,然后进行Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,用HE染色观察海马神经元的损伤情况,并测定Va D大鼠模型血浆硫化氢含量。结果与假手术组相比,模型组逃避潜伏期明显增长(P<0.05),血浆硫化氢浓度明显减少(P<0.05),海马神经元损伤严重;与模型组相比,低剂量组与高剂量组逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),血浆硫化氢浓度明显增加(P<0.05),海马神经元损伤减轻,血管性痴呆大鼠学习记忆有所改善。结论硫氢化钠可改善Va D大鼠的认知水平和病理变化,其保护作用可能与提高硫化氢含量有关。

关键词：血管性痴呆海马四血管法 Morris水迷宫硫化氢

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精细化护理对于新生儿重症肺炎合并呼吸衰竭的影响研究

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中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 2022年第4期 103-105页

作者：孙杰井沆贵州省人民医院贵州贵阳550002

应用精细化护理服务到临床新生儿重症肺炎合并呼吸衰竭病人中的实施方法和护理效果加以研究。方法:回顾性选取我们医院在过去两年之内所收治的新生儿重症肺炎合并呼吸衰竭病人资料,共计80例病人资料将其纳入成为此次课题的观察,对象利... 详细信息

应用精细化护理服务到临床新生儿重症肺炎合并呼吸衰竭病人中的实施方法和护理效果加以研究。方法:回顾性选取我们医院在过去两年之内所收治的新生儿重症肺炎合并呼吸衰竭病人资料,共计80例病人资料将其纳入成为此次课题的观察,对象利用随机数字表法对病人开展分组,给予其中一组病人常规护理服务,共计40例作为对照组,给予剩余一组病人精细化护理干预,共计40例作为研究组,两组病人接受各自护理措施之后的护理效果开展比较。结果:通过研究结果能够发现精细化护理干预病人的动脉血氧分压、血氧饱和度以及动脉血二氧化碳分压指标与对照组比较存在显著的统计学意义;接受精细化护理干预病人家长对于整体护理服务的满意程度与对照组比较具有显著的统计学意义。结论:应用精细化护理干预到临床新生儿重症肺炎合并呼吸衰竭病人的护理工作中,可以进一步使病人的临床表现症状获得改善,并且能够帮助提升病人家长对于整体护理服务的满意程度,存在较大的推广价值。

关键词：新生儿重症肺炎呼吸衰竭精细化护理护理效果应用价值

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贵阳地区不同孕期孕妇血清同型半胱氨酸、叶酸和维生素B_(12)水平变化及对子代结局的影响

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现代医药卫生 2024年第14期40卷 2357-2361,2366页

作者：孙杰井沆贵州省人民医院新生儿科贵州贵阳550002 贵州省人民医院检验科贵州贵阳550002

目的了解贵阳地区不同孕期孕妇血清同型半胱氨酸(Hcy)、叶酸(FA)和维生素B12(VitB_(12))水平及对发生子代不良结局的影响,为妊娠期孕妇个性化增补FA和VitB_(12)、预防妊娠并发症及胎儿出生缺陷提供参考。方法选取2022年1-12月在贵州省... 详细信息

目的了解贵阳地区不同孕期孕妇血清同型半胱氨酸(Hcy)、叶酸(FA)和维生素B12(VitB_(12))水平及对发生子代不良结局的影响,为妊娠期孕妇个性化增补FA和VitB_(12)、预防妊娠并发症及胎儿出生缺陷提供参考。方法选取2022年1-12月在贵州省人民医院产科门诊建卡产检的单胎妊娠孕妇400例,其中发生不良子代结局的孕妇50例为观察组,正常胎儿结局的孕妇350例为对照组。观察组和对照组按照不同孕周分为孕早期组、孕中期组、孕晚期组。另选同期在该院进行体检的健康育龄期非孕妇女100例作为健康组。采用酶循环法和化学发光微粒子免疫检测法检测Hcy、FA和VitB_(12)水平,比较3组血清Hcy、FA、VitB_(12)水平变化,通过Pearson线性相关对血清Hcy、FA及VitB_(12)进行回归分析,并采用非条件logistic多元逐步回归分析发生不良子代结局的相关危险因素。结果观察组和对照组各期Hcy水平均显著高于健康组,FA及VitB_(12)水平均显著低于健康组,差异均有统计学意义(P<0.05);观察组各期Hcy水平显著高于对照组,而FA和VitB_(12)水平均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);血清Hcy、FA和VitB_(12)水平在孕妇中随着孕周的增加呈逐渐下降趋势。经Pearson相关性分析结果可知,血清Hcy与FA呈负相关(r=-0.772,P<0.05);血清Hcy与VitB_(12)呈负相关(r=-0.613,P<0.05);FA与VitB_(12)呈正相关(r=0.568,P<0.05)。非条件logistic多元逐步回归结果显示,Hcy水平升高、FA水平降低和VitB_(12)水平降低均是孕妇发生不良子代结局的危险因素(P<0.05)。结论孕妇血清Hcy、FA和VitB_(12)的水平与不良子代结局的发生密切相关,因此,孕期应加强对这些指标的监测,一旦发现异常就须采取干预措施,以降低不良子代结局的风险。

关键词：同型半胱氨酸叶酸维生素B_(12) 不良子代结局相关性

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血管性痴呆大鼠海马突触素、发动蛋白Ⅰ的mRNA及蛋白表达变化

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临床神经病学杂志 2014年第1期27卷 37-40页

作者：肖雁苏艳丽井沆吴昌学李毅官志忠贵阳医学院分子生物学重点实验室 550004 贵阳护理职业学院检验系

目的探讨血管性痴呆（VaD）大鼠海马突触素、发动蛋白Ⅰ的mRNA及蛋白表达变化.方法利用改良四血管法制备血管性痴呆大鼠模型.通过Morris水迷宫观察大鼠空间探索及学习记忆情况,采用Real-time及Western-blot法分别检测大鼠海马突触素... 详细信息

目的探讨血管性痴呆（VaD）大鼠海马突触素、发动蛋白Ⅰ的mRNA及蛋白表达变化.方法利用改良四血管法制备血管性痴呆大鼠模型.通过Morris水迷宫观察大鼠空间探索及学习记忆情况,采用Real-time及Western-blot法分别检测大鼠海马突触素、发动蛋白Ⅰ的mRNA与蛋白水平,并与假手术组进行比较.结果 VaD组大鼠各时间点平均逃避潜伏期及第1次穿越平台所用时间均显著长于假手术组（均P＜0.01）,平台穿越次数明显减少（P＜0.05）.VaD组海马突触素及发动蛋白Ⅰ蛋白表达及mRNA表达显著低于假手术组（P ＜0.05～0.01）.结论脑缺血引起大鼠海马组织突触素、发动蛋白Ⅰ表达降低,可能与VaD发病中学习记忆能力减退有关.

关键词：血管性痴呆突触素发动蛋白Ⅰ

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骨髓间充质干细胞移植至血管性痴呆大鼠模型的初步研究

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贵阳医学院学报 2014年第2期39卷 148-153,161页

作者：井沆肖雁官志忠贵阳医学院分子生物学重点实验室贵州贵阳550004 贵阳医学院贵阳医学院病理学教研室贵州贵阳550004

目的:建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),体外诱导BMSCs向神经元样细胞方向分化、鉴定并移植至血管性痴呆大鼠模型的方法。方法:体外分离培养SD大鼠BMSCs,采用贴壁筛选法分离纯化BMSCs,显微镜下观察不同时期BMSCs的细胞形... 详细信息

目的:建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),体外诱导BMSCs向神经元样细胞方向分化、鉴定并移植至血管性痴呆大鼠模型的方法。方法:体外分离培养SD大鼠BMSCs,采用贴壁筛选法分离纯化BMSCs,显微镜下观察不同时期BMSCs的细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物表达鉴定BMSCs,用含10μg/L bFGF的L-DMEM及含200μmol/L BHA、2%DMSO的无血清L-DMEM诱导BMSCs向神经元样细胞分化;免疫细胞化学检测分化细胞的巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,以确定其分化特性;用尿嘧啶脱氧核苷(BrdU)标记分化好的细胞,移植到改良Pulsinelli’s四血管复制的血管性痴呆(VaD)模型大鼠侧脑室内,免疫组织化学检测BrdU表达以反映移植BMSCs在大鼠脑内的生长情况,Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力。结果:大鼠BMSCs可通过贴壁筛选法成功分离并在体外大量扩增,流式细胞仪检测显示BMSCs第5代表面标志可达90%以上,细胞表型CD90、CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性;bFGF/BHA诱导BMSCs分化后有Nestin和NSE表达,分化细胞具有神经细胞的形态;与对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,第1次穿越平台时间延长,穿越平台次数减少,差异有统计学意义(P<0.05);BrdU成功标记诱导后的BMSCs,并可在移植大鼠脑内检测到BrdU标记阳性细胞。结论:体外成功分离、培养大鼠BMSCs,生长稳定、可多次传代,bFGF/BHA可诱导BMSCs分化为神经元细胞,BMSCs成功移植到VaD大鼠,BMSCs有望为神经疾病细胞移植治疗提供丰富、易得的细胞来源。

关键词：骨髓间充质干细胞血管性痴呆神经元分化诱导移植

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羟苯磺酸钙对酶法检测血清肌酐影响的临床研究

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中国科技期刊数据库医药 2022年第4期 27-30页

作者：牛志杰陈敏印倩井沆武红权贵州省人民医院检验科贵州贵阳550002

羟苯磺酸钙对酶法在检测血清肌酐干扰过程中的价值。方法:根据美国临床以及实验室标准化协会(CLSI)提出的EP7-A2标准,对酶法检测血清肌酐提供干扰筛选测验以及剂量效应方面测验,接着利用羟苯横酸钙明确羟苯磺酸钙对酶法核定肌酐的干扰... 详细信息

羟苯磺酸钙对酶法在检测血清肌酐干扰过程中的价值。方法:根据美国临床以及实验室标准化协会(CLSI)提出的EP7-A2标准,对酶法检测血清肌酐提供干扰筛选测验以及剂量效应方面测验,接着利用羟苯横酸钙明确羟苯磺酸钙对酶法核定肌酐的干扰程度。结果:在干扰筛选实验之中,干扰配对试验组均值大约是272.82 μmol/L,对照样品均值是427.29 μmol/L,如果干扰值(dabs)95%CI要明显超过既定的干扰实验的可接受标准(dmax),那么此时就代表干扰了羟苯磺酸钙对酶法检测肌酐。在剂量效应实验之中,针对低值肌酐样本,此时参照干扰效应冋归曲线方程Y=0.064X2-2.009X-0.914(P=0.000,R2=0.982,F=661.16),如果羟苯磺酸钙浓度超过1.3mg/L,而干扰值要明显超过干扰测验中可接受标准(dmax);此时干扰剂量效应冋归方程Y=0.063X2-4.54X-3.39(P=0.000,R2=0.995,F=2479.851),如果羟苯磺酸钙实际浓度超过6.03mg/L,此时干扰值超过干扰测验的可接受标准(dmax)。结论:总而言之,羟苯磺酸钙对酶法检测血清肌酐有一定的负干扰作用,这常常是因为受到检测原理方面的因素,从而造成结果上的不同,此时要求仔细询问患者有无摄取羟苯磺酸钙药物,同时在暂停摄药后再次进行抽血检测。同时在条件允许的情况下,也可以采取其他基理的肌酐法进行核验,给同行带来一定的参考价值。

关键词：羟苯磺酸钙酶法血清肌酐

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