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PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗的构建及真核表达

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生物医学工程学杂志 2013年第5期30卷 1102-1107页

作者：王鹤于继云李力广西医科大学附属肿瘤医院南宁530021 军事医学科学院基础医学研究所北京100850

为构建和表达人乳头瘤病毒(HPV)58型相关宫颈癌治疗用疫苗,将HPV58mE6E7融合基因片段插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建重组真核表达质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。再将得到的sigHPV58mE6E7-Fc-GPI片段插入新型疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7中,构建PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗。经限制性内切酶鉴定及测序分析证实PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗构建成功。流式细胞术及免疫荧光检测表明该疫苗中的融合抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI及分子佐剂GM-CSF/B7.1能够同时实现真核表达。表明PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗可作为治疗HPV58相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗。

关键词：人乳头瘤病毒58型 E6基因 E7基因 DNA疫苗真核表达

人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性

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中华肿瘤杂志 2013年第7期35卷 491-496页

作者：王鹤于继云李力广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科南宁530021 军事医学科学院基础医学研究所转化医学研究室

目的探讨人乳头瘤病毒（HPV）58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性。方法分别定点突变HPV58型E6和E7基因中3个氨基酸的密码子，去除突变后的E6和E7基因的终止码并将其基因片段融合，突变修饰后的基因命名为HPV58mE6E7。将重组质... 详细信息

目的探讨人乳头瘤病毒（HPV）58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性。方法分别定点突变HPV58型E6和E7基因中3个氨基酸的密码子，去除突变后的E6和E7基因的终止码并将其基因片段融合，突变修饰后的基因命名为HPV58mE6E7。将重组质粒转染NIH／3T3细胞，plRES—neo-HPV58mE6E7转染组为实验组，plRES-neo-HPV58E6E7转染组为阳性对照组，plRES—neo空载转染组为阴性对照组。流式细胞术、免疫荧光和Westernblot检测转染细胞HPV58mE6E7融合蛋白的表达，软琼脂集落形成和裸鼠皮下成瘤实验检测HPV58mE6E7融合蛋白的转化活性。以HPV58mE6E7融合基因为靶抗原构建DNA疫苗，免疫小鼠后采用酶联免疫吸附试验检测免疫鼠血清中特异性抗体，酶联免疫斑点法检测免疫鼠脾淋巴细胞中可分泌1干扰素的特异性CD8’T细胞数。结果将pGEM—Teasy／HPV58mE6E7和pMD一18T／HPV58E6E7质粒分别测序，HPV58E6E7融合基因与HPV58型E6和E7基因标准序列的同源性达100％，并证实点突变成功。稳定转染HPV58mE6E7和HPV58E6E7的NIH／3T3细胞表达率分别为70．3％和84．1％。实验组和阳性对照组HPV58mE6E7和HPV58E6E7融合蛋白的相对表达水平分别为2．1±1．7和3．8±1．4，阴性对照组HPV58mE6E7和HPV58E6E7融合蛋白呈阴性表达。实验组和阴性对照组未见集落形成；阳性对照组有31个集落形成，其中〉50个细胞的集落10个。实验组和阴性对照组细胞接种裸鼠后，在4周内均未成瘤；而阳性对照组中有6只裸鼠形成肿瘤。以HPV58mE6E7融合基因为靶抗原的DNA疫苗具有良好的抗原性，抗体滴度为25600，特异性免疫斑点数为（218．8±34．4）个，明显高于对照组。结论修饰后的HPV58E6E7基因可融合表达，并在消除其转化活性的同时保留其抗原性，可作为HPV58阳性相关肿瘤治疗性DNA疫苗的靶基因。

关键词：人乳头瘤病毒58 基因 E6 基因 E7 生物转化疫苗 DNA 抗体

HPV58型复合DNA疫苗抗肿瘤免疫效果的初步观察

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中华妇产科杂志 2013年第7期48卷 523-527页

作者：王鹤于继云李力广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科南宁530021 军事医学科学院基础医学研究所转化医学研究室

目的初步观察PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合DNA疫苗的抗肿瘤免疫效果.方法在检测该复合疫苗的免疫效果前,自行构建了稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16-HPV58E6E7成瘤细胞系,表达并纯化了HPV58E6E7-GST融合蛋白作为抗原.将该疫苗免疫C57BL/... 详细信息

目的初步观察PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合DNA疫苗的抗肿瘤免疫效果.方法在检测该复合疫苗的免疫效果前,自行构建了稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16-HPV58E6E7成瘤细胞系,表达并纯化了HPV58E6E7-GST融合蛋白作为抗原.将该疫苗免疫C57BL/6小鼠（免疫组）后,通过抗肿瘤移植保护实验和肿瘤生长抑制实验观察该疫苗对小鼠负荷的B16-HPV58E6E7移植瘤的防治效果；通过特异性抗体检测、酶联免疫斑点检测、特异性杀伤实验观察该疫苗在被免疫小鼠体内诱发的体液和细胞免疫反应.以单纯抗原PVAX1-HPV58mE6E7 Fc免疫小鼠作为单纯抗原组.结果抗肿瘤移植保护实验显示,经PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗免疫的小鼠成瘤率仅为9/15,但成瘤时间最长[为（13.6±1.7）d],且肿瘤生长最慢.在肿瘤生长抑制实验中,疫苗组小鼠的肿瘤生长抑制率达81.4％.体液免疫检测显示,该疫苗和单纯抗原均能在小鼠体内诱发特异性抗体,最高滴度分别为1∶25 600和1∶12 800,两组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）；但在细胞免疫检测中,疫苗组激活的特异性T淋巴细胞数[（219±34）个/4×105个脾淋巴细胞]约为单纯抗原组[（55±25）个/4×105个脾淋巴细胞]的4倍,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）；且该疫苗诱发的特异性针对B 16-HPV58 E6 E7细胞的杀伤率（最高为43.3％）也明显高于单纯抗原组（杀伤率最高为31.3％）,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合DNA疫苗能有效激发特异性的体液和细胞免疫反应,显著抑制B16-HPV58E6E7肿瘤细胞的生长,在细胞免疫上优于单纯抗原,可作为HPV58阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗.

关键词：乳头状瘤病毒科癌基因蛋白质类,病毒性衣壳蛋白质类 DNA疫苗免疫活性小鼠,近交系

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细胞表面工程与肿瘤疫苗

免疫学杂志 2003年第6期19卷 478-479,481页

作者：于继云沈倍奋军事医学科学院基础医学研究所北京100850

细胞表面工程 ,又称GPI锚定蛋白转移法 ,是一种不依赖基因转移而能够在细胞膜上表达新蛋白的有效方法。GPI锚定蛋白可以通过其尾部脂质GPI结构自然地整合到细胞膜上。这种方法克服了基因转移技术的一些局限 ,在临床应用上更具优势。该... 详细信息

细胞表面工程 ,又称GPI锚定蛋白转移法 ,是一种不依赖基因转移而能够在细胞膜上表达新蛋白的有效方法。GPI锚定蛋白可以通过其尾部脂质GPI结构自然地整合到细胞膜上。这种方法克服了基因转移技术的一些局限 ,在临床应用上更具优势。该技术可用于肿瘤疫苗和肿瘤免疫治疗方面的研究 ,将GPI锚定修饰的免疫分子直接转移到肿瘤细胞膜上。

关键词：细胞表面工程肿瘤疫苗 GPI锚定蛋白转移法糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白

过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活

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细胞与分子免疫学杂志 2014年第5期30卷 485-488页

作者：朱静潆杜芝燕王芳于继云田仁礼殷小涛张巍新疆大学生命科学与技术学院新疆乌鲁木齐830046 军事医学科学院基础医学研究所转化医学研究室北京100850

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的... 详细信息

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P<0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。

关键词：人SPRY2 HEK293T细胞过表达增殖存活

一种拮抗HIV-1并靶向DC的融合基因的设计及表达鉴定

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生物工程学报 2011年第8期27卷 1191-1197页

作者：赵萌徐青于继云余云舟北京交通大学生命科学与生物工程研究院北京100044 军事医学科学院基础医学研究所北京100850 军事医学科学院生物工程研究所北京100071

艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)通过与靶细胞膜的融合感染宿主细胞,研究表明阻断HIV与受体靶分子的结合可以阻止HIV进入宿主细胞,抑制HIV病毒的感染。设计合成了一个包含CD4和CCR5与HIV-1结合的主要功能结构区,及Flt3-L... 详细信息

艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)通过与靶细胞膜的融合感染宿主细胞,研究表明阻断HIV与受体靶分子的结合可以阻止HIV进入宿主细胞,抑制HIV病毒的感染。设计合成了一个包含CD4和CCR5与HIV-1结合的主要功能结构区,及Flt3-L和Mip-3α分子的融合基因,构建了2个融合基因的真核表达载体pABK-CKR5-CD4/Flt3L-Mip3α(pABK-HIV-MF)和pABK-CKR5-CD4(pABK-HIV-MT),在人胚肾293细胞中进行了表达。RT-PCR、细胞免疫荧光技术、ELISA和Western blotting检测结果表明融合基因在真核细胞中获得了正确的表达,这为进一步研究其对于HIV-1的拮抗并靶向树突状细胞(DC)清除研究奠定了基础。

关键词：融合基因 HIV 真核表达树突状细胞靶向

人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达及生物活性分析

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细胞与分子免疫学杂志 2014年第3期30卷 225-228页

作者：杜芝燕王芳朱静潆于继云王宇朱晓明张巍军事医学科学院基础医学研究所转化医学研究室

目的构建携带人肿瘤坏死因子受体(TNFR)胞外区融合人IgG Fc片段的重组腺相关病毒载体(pAAV/hTNFR-Fc),并对融合蛋白hTNFR-Fc的表达和生物学活性进行鉴定。方法构建hTNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染人胚肾HEK293T细胞,... 详细信息

目的构建携带人肿瘤坏死因子受体(TNFR)胞外区融合人IgG Fc片段的重组腺相关病毒载体(pAAV/hTNFR-Fc),并对融合蛋白hTNFR-Fc的表达和生物学活性进行鉴定。方法构建hTNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染人胚肾HEK293T细胞,收集转染上清,以Western blot法检测目的蛋白的表达,应用L929细胞测定重组表达产物对人和大鼠TNF-α细胞毒中和活性,采用ELISA比较重组表达产物对人和大鼠TNF-α的结合活性。结果成功构建重组表达载体pAAV/hTNFR-Fc,在转染细胞上清中检测到目的蛋白hTNFR-Fc的表达,重组表达产物可有效结合人TNF-α并中和其L929细胞毒活性,并对大鼠TNF-α具有一定程度的结合和中和活性。结论成功构建了hTNFR-Fc融合基因,验证了其在AAV载体上的分泌性表达,并对其生物活性进行了鉴定,为进一步病毒包装和大鼠关节炎动物实验研究奠定了基础。

关键词： hTNFR—Fc 重组腺相关病毒载体表达活性

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肾癌相关基因的研究进展

细胞与分子免疫学杂志 2005年第B3期21卷 110-112页

作者：刘颖凌世淦于继云军事医学科学院基础医学研究所疫苗工程研究室北京100850

肾癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率约占全身恶性肿瘤的3%.近年来全世界的发病率呈明显增高的趋势, 每年死于肾癌者近1×105 例[1].肾癌对放、化疗均不敏感, 临床上一般采用肾癌根治性切除... 详细信息

肾癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率约占全身恶性肿瘤的3%.近年来全世界的发病率呈明显增高的趋势, 每年死于肾癌者近1×105 例[1].肾癌对放、化疗均不敏感, 临床上一般采用肾癌根治性切除术, 但是一旦出现淋巴结转移, 即使行根治性淋巴结清扫术, 患者生存期也极少超过5年, 若出现肝、肺转移或邻近脏器浸润则预后更差, 因此转移性肾癌的临床治疗陷入困境.最近几年, 遗传学研究表明肾癌是多基因相关肿瘤, 发病机制复杂, 病程发生发展的分子生物学基础至今不明, 为此, 鉴定并克隆出肾癌的特异性或相关性基因将为临床提供必要的诊断指标和治疗标准.本文从肾癌特异性表达的基因、非特异性基因和病程发展过程的辅助性基因3个方面对肾癌相关基因的研究进展进行综述.

关键词：肾肿瘤癌基因免疫治疗

人hCGβ真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第7期26卷 623-626页

作者：张亮王宇江乐阎瑾琦王越胡明明于继云军事医学科学院基础医学研究所

目的：构建人hCGβ真核表达载体，稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，建立稳定表达人hCGβ的小鼠黑色素瘤细胞系。方法：采用PCR方法扩增出人hCGβ全长基因的cDNA编码区序列，利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES—neo中，并... 详细信息

目的：构建人hCGβ真核表达载体，稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，建立稳定表达人hCGβ的小鼠黑色素瘤细胞系。方法：采用PCR方法扩增出人hCGβ全长基因的cDNA编码区序列，利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES—neo中，并加入酶切位点和6×His标签，得到重组表达质粒pIRES—neo—hCGβ-（His）6。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，经G418加压筛选出阳性克隆。RT—PCR、Western blot及免疫荧光检测人hCGβ在B16细胞中的表达。结果：经限制性内切酶鉴定及序列分析，pIRES—neo—hCGβ一（His）6重组体构建正确，最终建立的表达人hCGβ基因的B16细胞系阳性率高于90％。结论：成功构建了真核表达载体plRES—neo—hCGβ-（His）6，建立的稳定转染人hCGβ小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达hCGβ基因。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究人hCGβ抗肿瘤基因疫苗的功能提供了良好的实验基础，为hCGβ在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。

关键词： hCGβ 稳定转染小鼠黑色素瘤细胞肿瘤免疫治疗