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大黄鱼三种病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选

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生物工程学报 2012年第12期28卷 1460-1472页

作者：张崇文毛芝娟于涟上海市水产研究所上海200433 浙江万里学院浙江宁波315100 浙江大学动物科学学院浙江杭州310058

弧菌是海水养殖环境中常见的条件性致病菌,弧菌病的暴发给水产养殖业造成了严重损失。鉴于水生动物尤其是鱼类弧菌病的发生常常是多种(血清型或亚种)弧菌的混合感染,筛选具有潜在的交叉保护性蛋白抗原,作为制备多价疫苗或联合疫苗的侯... 详细信息

弧菌是海水养殖环境中常见的条件性致病菌,弧菌病的暴发给水产养殖业造成了严重损失。鉴于水生动物尤其是鱼类弧菌病的发生常常是多种(血清型或亚种)弧菌的混合感染,筛选具有潜在的交叉保护性蛋白抗原,作为制备多价疫苗或联合疫苗的侯选成分具有重要意义。文中从患病大黄鱼中分离到8株弧菌,经生理生化和分子生物学鉴定分别为6株哈维氏弧菌Vibrio harveyi,1株溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和1株副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus。选择典型的不同种的弧菌为代表,提取其外膜蛋白,经SDS-PAGE和Westernblotting分析,确定它们大约在45 kDa、35 kDa、22 kDa处出现了3条共同的免疫印迹条带,表明它们很有可能含有共同的能够彼此交叉保护的抗原。利用双向电泳和免疫印迹相结合的方法,借助于MALDI-TOF-MS质谱分析技术,发现溶藻弧菌V.alginolyticus的一种功能未知的孔蛋白(Porin,GenBank Accession No.ZP_01260407)和副溶血弧菌V.parahaemolyticus的一种麦芽糖孔蛋白的前体蛋白(Maltoporin precursor,GenBank AccessionNo.NP_801154)能够和哈维氏弧菌V.harveyi全菌多抗产生免疫反应,表明这两种蛋白可以作为3种弧菌的交叉保护性抗原,以此制备的疫苗可望对3种弧菌的感染产生交叉保护作用。

关键词：弧菌鉴定外膜蛋白交叉保护性抗原

实行党政领导科技进步目标责任制和开展科技创先活动是推进区域科技进步的重要措施

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中国软科学 1998年第4期 48-51页

作者：于涟浙江省科委

实行党政领导科技进步目标责任制和开展科技创先活动是推进区域科技进步的重要措施浙江省科委副主任于涟浙江省经济发展的一大特色是以县、市经济为主的区域经济比较发达。在全国百强县中，浙江占了２３个。区域经济的强劲发展已成为浙... 详细信息

实行党政领导科技进步目标责任制和开展科技创先活动是推进区域科技进步的重要措施浙江省科委副主任于涟浙江省经济发展的一大特色是以县、市经济为主的区域经济比较发达。在全国百强县中，浙江占了２３个。区域经济的强劲发展已成为浙江省经济持续快速健康发展的主要支撑...

关键词：浙江经济发展技术进步科技创先目标责任制

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2004年第5期30卷 545-552页

作者：卢觅佳于涟谢荣辉张朝政浙江大学生物医学工程系浙江杭州310027 浙江大学动物预防医学研究所浙江杭州310029

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达... 详细信息

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDVVP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) 多聚蛋白(VP2/4/3) 家蚕杆状病毒载体家蚕表达安全性免疫原性

鸡传染性法氏囊病病毒非结构蛋白基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

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微生物学报 2005年第5期45卷 763-766页

作者：于涟李龙刘岩郑江涛魏永伟浙江大学动物预防医学研究所浙江省重点实验室杭州310029

利用RT-PCR技术从传染性法氏囊病病毒(IBDV)TL2004株感染鸡胚尿囊液中扩增到VP5基因,进而构建了T7启动子控制下的N端GST-Tag融合表达质粒pGEX-VP5。序列测定表明VP5基因全长438bp,编码一个由145个氨基酸组成的VP5蛋白。将pGEX-VP5转化... 详细信息

利用RT-PCR技术从传染性法氏囊病病毒(IBDV)TL2004株感染鸡胚尿囊液中扩增到VP5基因,进而构建了T7启动子控制下的N端GST-Tag融合表达质粒pGEX-VP5。序列测定表明VP5基因全长438bp,编码一个由145个氨基酸组成的VP5蛋白。将pGEX-VP5转化大肠杆菌BL21,在IPTG的诱导下高效表达了GST-VP5融合蛋白(44kD)。通过包涵体纯化的方法,获得的较高纯度的融合蛋白,免疫新西兰兔,Western blot和ELISA分析表明,制备的融合蛋白抗血清效价在1∶12800以上,并具有良好的免疫反应特异性,为进一步研究VP5在IBDV复制与致病中的作用,以及研制IBDVVP5基因缺失疫苗打下了良好的基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP5基因表达多克隆抗体

猪Ⅱ型圆环病毒浙江分离株全基因组的克隆与序列分析

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2005年第6期31卷 777-782页

作者：张朝政由振强卢觅佳于涟浙江大学动物预防医学研究所浙江省重点实验室浙江杭州310029 浙江省医学科学院浙江杭州310013

越来越多的证据显示,猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原之一.本研究克隆了两株PCV2浙江分离株(JS2003和Zhuji2003)的全基因并对其进行测序.序列分析结果表明,这两个基因组全长均为1767nt,与GenBank中... 详细信息

越来越多的证据显示,猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原之一.本研究克隆了两株PCV2浙江分离株(JS2003和Zhuji2003)的全基因并对其进行测序.序列分析结果表明,这两个基因组全长均为1767nt,与GenBank中的其它24株PCV2相比,核苷酸同源性为94.8%～99.8%,而与4株PCV1的核苷酸同源性仅为76.5%～78.0%.虽然PCV2基因从总体上来说相对稳定,但在不同地区分离到的PCV2中确实存在一定的基因差异.

关键词：猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2) 断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS) 序列分析

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中国对虾血细胞吞噬功能的研究

中国水产科学 1997年第2期 1-6页

作者：杜爱芳蔡渭明于涟浙江农业大学

本研究建立了检测中国对虾血细胞吞噬功能的橙检测法。该检测法可同时直观地观察中国对虾血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬和杀伤情况：一项试验可同时获得吞噬和杀伤百分率，吞噬和杀伤指数四个指标。用本法研究四种免疫增强剂对时虾血细... 详细信息

本研究建立了检测中国对虾血细胞吞噬功能的橙检测法。该检测法可同时直观地观察中国对虾血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬和杀伤情况：一项试验可同时获得吞噬和杀伤百分率，吞噬和杀伤指数四个指标。用本法研究四种免疫增强剂对时虾血细胞吞噬功能的作用，结果表明，他们均可提高血细胞对金葡菌的吞噬活力以及血淋巴中的溶菌活力和酚氧化酶活力，但经统计学分析，结合攻毒试验的结果，浙农Ⅰ号和湖州Ⅰ号的免疫效果优于湖州Ⅱ号和湖州Ⅲ号。

关键词：中国对虾血细胞吞噬功能检测方法免疫增强剂

罗氏沼虾诺达病毒TAS-ELISA检测法的建立及应用研究

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2006年第4期32卷 377-382页

作者：钱冬刘问潘晓艺曹铮于涟浙江大学生物医学工程与仪器科学学院浙江杭州310028 浙江省淡水水产研究所浙江湖州313001 浙江大学动物预防医学研究所浙江杭州310029

罗氏沼虾肌肉白浊病(Whitish muscle diseases ofMacrobrachium rosenbergii)是近年来流行于罗氏沼虾苗种阶段的严重疾病,该病病原已确定为罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergiiNodavirus,MrNV).作者在病毒超离提纯的基础上,制备了罗氏沼虾诺达病毒兔抗血清,并应用抗罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体2B5,建立了三抗体夹心酶联免疫检测方法(TAS-ELISA).TAS-ELISA最适反应条件为:兔抗体以1μg/mL包板,小鼠单抗2B5的工作浓度为1∶50000,该法检测MrNV的灵敏度达0.98 ng,对WSSV、TSV及其他细菌感染死亡的罗氏沼虾苗没有非特异性反应.通过对2000—2002年病虾及疑似病虾的病毒检测,表明TAS-ELISA法比间接ELISA法和核酸电泳法有更高的阳性检出率和符合率;此外还摸索了降低孵育温度和缩短孵育时间对病毒检测的影响,表明各步孵育温度和时间分别为25℃和20 min对于白浊症状的病苗检测无明显影响,使得本法更加适合于生产实践.

关键词：罗氏沼虾肌肉白浊痛罗氏沼虾诺达病毒 TAS-ELISA 应用

用长距离RT-PCR扩增并克隆鸡传染性法氏囊病病毒的大节段全长基因组

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2001年第3期33卷 355-359页

作者：黄耀伟于涟丁红梅李建荣宋坤华杭州310027 浙江大学生物医学工程学系浙江大学动物预防医学研究所!杭州310029

使用长距离RT PCR方法扩增并克隆了一种双链RNA病毒———鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)的大节段全长基因组。首先比较 4种病毒纯化和基因组抽提方案 ,发现超速离心后用蛋白酶K消化病毒粒子是较好的方法 ,所得dsRNA不用精制模板即可直接... 详细信息

使用长距离RT PCR方法扩增并克隆了一种双链RNA病毒———鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)的大节段全长基因组。首先比较 4种病毒纯化和基因组抽提方案 ,发现超速离心后用蛋白酶K消化病毒粒子是较好的方法 ,所得dsRNA不用精制模板即可直接进入RT PCR体系。在 5 0℃下用SuperscriptII酶反转录合成单链cDNA ,经RNaseH除去杂交链的RNA后 ,用一对引物直接扩增到预期分子量的片段。PCR产物克隆并测序 ,序列分析证实获得了 3 2 5 9bp的大节段全长。该方法优于传统的双链RNA病毒分段克隆策略 ,大大简化了克隆程序

关键词：传染性法氏囊病病毒A节段长距离RT-PCR cDNA全长克隆

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基因融合技术及其应用

农业生物技术学报 2006年第2期14卷 273-278页

作者：刘岩于涟浙江大学动物预防医学研究所浙江省重点实验室浙江大学动物预防医学研究所浙江省重点实验室杭州310029

基因融合技术以其快捷、高效生产多功能蛋白的优势,近年来在生物学领域中得到了愈来愈广泛的应用,结合本实验室的相关研究,简要综述基因融合技术、影响基因融合的主要因素以及融合基因的主要应用。

关键词：基因融合 linker 融合蛋白