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α7烟碱型乙酰胆碱受体分子伴侣Tmem35a的克隆及其功能研究

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药学学报 2024年第7期 1993-2001页

作者：王紫涵于津鹏长孙东亭朱晓鹏罗素兰广西大学医学院广西特色生物医药重点实验室

烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs）属于配体门控离子通道受体,其中α7nAChR亚型广泛分布于大脑皮层、丘脑和海马体等区域。此外,在小胶质细胞、巨噬细胞、骨髓细胞等也有分布,研究发现其与胆碱能抗炎通... 详细信息

烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs）属于配体门控离子通道受体,其中α7nAChR亚型广泛分布于大脑皮层、丘脑和海马体等区域。此外,在小胶质细胞、巨噬细胞、骨髓细胞等也有分布,研究发现其与胆碱能抗炎通路的功能密切相关,是阿尔茨海默症和精神分裂症药物开发的重要靶标。建立稳定的体外药物筛选体系,对于靶向α7 nAChR新药的高效筛选至关重要。在非洲爪蟾卵母细胞膜上,重组表达nAChRs的不同亚型,并通过电生理技术进行电流检测,是一种先进而复杂的新药筛选模型。分子伴侣可以协助部分nAChRs亚基组装形成功能性受体,为靶向该受体的化合物筛选提供稳定表达的模型。为此,本研究从大鼠体内分离克隆了α7 nAChR的一个分子伴侣基因,其名称为Tmem35a （transmembrane protein 35A）,进一步构建了该基因的重组表达载体,再利用体外转录技术获得了该基因的cRNA,将之与α7 nAChR的cRNA混合后同时注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行表达。然后,利用双电极电压钳检测该分子伴侣对α7 nAChR电流表达和通道药理活性的影响。结果显示,TMEM35A （也被称为novel acetylcholine receptor chaperone, NACHO）可有效提高α7 nAChR蛋白在卵母细胞膜上的表达,受体蛋白表达量提高了约1倍;其配体乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）刺激诱发的峰值电流提高了约10倍。注入Tmem35a cRNA后的卵母细胞,其表达的α7 nAChR对激动剂ACh的半数效应浓度为228.5μmol·L-1,和本体223.3μmol·L-1基本一致,维持了α7受体正常功能特性。研究结果表明,分子伴侣NACHO有效协助了α7 nAChR在非洲爪蟾卵母细胞的异源表达,稳定表达的α7 nAChR可以为靶向该受体的先导化合物活性筛选提供模型。本研究所有动物实验过程经广西大学伦理委员会审查批准（批准号:GXU-2023-0249）。

关键词： α7烟碱型乙酰胆碱受体分子伴侣NACHO 基因克隆双电极电压钳药物筛选模型

烟碱型乙酰胆碱受体α3[K152E,E184D,Q195T]β4突变型的构建及其功能研究

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药学学报 2022年第4期57卷 1054-1062页

作者：陈舒苗于津鹏张笑凡朱晓鹏罗素兰长孙东亭海南大学药学院海南大学热带生物资源教育部重点实验室海南海口570228 广西大学医学院广西南宁530004

α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)是成瘾、癌症和肥胖等重要疾病的潜在新靶点。本研究对大鼠(rat,r)α3β4 nAChRs的α3亚基上的3个氨基酸位点同时进行突变,将这3个位点分别突变为rα6亚基上与α3... 详细信息

α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)是成瘾、癌症和肥胖等重要疾病的潜在新靶点。本研究对大鼠(rat,r)α3β4 nAChRs的α3亚基上的3个氨基酸位点同时进行突变,将这3个位点分别突变为rα6亚基上与α3亚基上相对应的氨基酸种类,构建α3[K152E,E184D,Q195T]β4三点突变型受体,并研究其功能。利用PCR介导的定点突变方法构建了α3[K152E,E184D,Q195T]三点突变体载体,体外转录获得相应的cRNA,与野生型β4亚基的cRNA按相同比例注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行重组表达,然后用双电极电压钳技术检测其受体活性和功能。测定α3β4 nAChRs野生型和突变型在乙酰胆碱、尼古丁和金雀花碱3种不同激动剂的诱导下,其配体门控电流的大小以及门控特征,比较野生型和突变型受体之间的功能差异。α3[K152E,E184D,Q195T]三点突变体的功能与野生型相比存在显著差异。乙酰胆碱、尼古丁和金雀花碱对α3β4 nAChR野生型的半数最大效应浓度(EC_(50))分别为277.5、34.02和23.05μmol·L^(-1);针对三点突变体,3种激动剂的EC_(50)分别为170.5、26.6和98.45μmol·L^(-1)。3种激动剂对突变体的EC_(50)与野生型受体的EC_(50)相比,其活性变化分别为0.6、0.8和4.3倍。其中突变型受体对金雀花碱的活性影响最显著,其激动剂活性下降了77%。此外,与1 mmol·L^(-1)乙酰胆碱诱导的峰值电流幅度相比,金雀花碱对野生型和突变型α3β4 nAChRs的最大激动效率(E_(max))从94.12%提升至155.08%。α3[K152E,E184D,Q195T]β4三点突变型明显降低了对金雀花碱的敏感性,但其最大激动电流幅度明显变大。三点突变型略微增强了对乙酰胆碱和尼古丁的敏感性,说明α3亚基上的这3个氨基酸对α3β4 nAChRs的配体结合功能影响较大,对不同激动剂的影响情况各异,这为今后探究α3β4 nAChRs重要受体的精细结构和功能以及相关疾病的发病机制研究提供了很好的线索。

关键词： PCR介导定点诱变 α3β4烟碱型乙酰胆碱受体突变型电生理学功能研究激动剂通道开放分子机制

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DA-602型盒式录音磁带研制报告

信息记录材料 1985年第3期 9-13页

作者：杨述玺于津鹏大连磁带厂

大连磁带厂是国家定点录音磁带专业生产厂。为发展我国磁带工业,满足市场需求,在科研单位的协作下研制出 DA—602型盒式录音磁带,现已通过技术鉴定,投入工业生产。一、实验磁带是多学科技术的综合,不仅要求电声性能好,而且机械物理性能... 详细信息

大连磁带厂是国家定点录音磁带专业生产厂。为发展我国磁带工业,满足市场需求,在科研单位的协作下研制出 DA—602型盒式录音磁带,现已通过技术鉴定,投入工业生产。一、实验磁带是多学科技术的综合,不仅要求电声性能好,而且机械物理性能要稳定。在高速复制和录放时,不变形、不掉粉、

关键词：盒式录音磁带磁粉分散性取向性表面处理粘合剂 TA 磁记录器粘结剂磁浆农药助剂分散剂扩散剂

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外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

中国生物工程杂志 2011年第11期31卷 123-129页

作者：高炳淼李宝珠于津鹏胡远艳长孙东亭罗素兰海南大学热带生物资源教育部重点实验室海口市海洋药物重点实验室海口570228

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表... 详细信息

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。

关键词：杆状病毒外源基因重组蛋白昆虫细胞

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α9α10乙酰胆碱受体模型的建立

α9α10乙酰胆碱受体模型的建立

第12届生物毒素研究及医药应用学术大会

作者：雷宇苗朱晓鹏于津鹏长孙东亭罗素兰海南大学热带生物资源教育部重点实验室海口市海洋药物重点实验室海南大学海洋学院

烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs）,是一类重要的配体门控离子通道,广泛分布于肌肉、中枢和外周神经系统中,与学习、感觉、神经紊乱等重要行为相关。α9α10nAChRs主要存在于外周神经系统,是许多耳部疾病... 详细信息

烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs）,是一类重要的配体门控离子通道,广泛分布于肌肉、中枢和外周神经系统中,与学习、感觉、神经紊乱等重要行为相关。α9α10nAChRs主要存在于外周神经系统,是许多耳部疾病,如耳鸣,听力丧失,眩晕等的潜在作用靶点,也是治疗神经痛药物的作用靶点。因此,在非洲爪蟾卵母细胞（蛙卵）上建立α9α10nAChRs模型,对以该受体为靶点进行药物筛选至关重要。α9α10nAChRs模型建立过程和方法简述如下。首先将含有大鼠α9和α10亚基基因的质粒线性化后,通过体外转录合成两种亚基的cRNA,并按1:1的比例将两种cRNA混合均匀后,显微注射到非洲爪蟾卵母细胞中,培养3-5天后,利用双电极电压钳技术对受体的表达情况进行检测。结果显示,在钳制电压-70 mV条件下,注射了α9和α10nAChR亚基cRNA的蛙卵细胞,在10μM乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）刺激下产生内向电流,并且该电流可以被α9α10nAChRs的特异阻断剂αO-芋螺毒素GeXIVA所阻断,对照空白细胞不产生电流,说明α9α10nAChRs模型构建成功,为利用该模型筛选作用于α9α10nAChRs的芋螺毒素,以及其他海洋生物活性物质提供了基础。

关键词：烟碱型乙酰胆碱受体 α9α10nAChRs 非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳

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乙酰胆碱受体α3β2亚型的重组表达研究

乙酰胆碱受体α3β2亚型的重组表达研究

第十一届中国生物毒素研究及医药应用年会

作者：朱晓鹏于津鹏邴晖长孙东亭罗素兰海南大学热带生物资源教育部重点实验室

烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）是一类重要的配体门控离子通道,广泛分布于肌肉、中枢和外周神经系统。这类受体与学习、感觉、神经紊乱和一些脑部疾病相关。nAChRs有很多种亚型,每种亚型之间的同源性很高,却有着截然不同的药理学功能,急需... 详细信息

烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）是一类重要的配体门控离子通道,广泛分布于肌肉、中枢和外周神经系统。这类受体与学习、感觉、神经紊乱和一些脑部疾病相关。nAChRs有很多种亚型,每种亚型之间的同源性很高,却有着截然不同的药理学功能,急需各种亚型特异性分子探针研究相应受体亚型的精细结构与功能。新近研究表明,乙酰胆碱受体亚型中α3β2与痛觉相关,其中α3亚基广泛分布于大脑皮层及丘脑,β2亚基广泛存在于中枢和外周神经系统,发现特异作用于α3β2亚型的物质有助于镇痛药物的研究。本研究通过体外转录分别获得α3和β2亚基基因的cRNA,二者按照不同的比例（1:10,1:1,10:1）混合后注射到非洲爪蟾卵母细胞内,17℃培养1天以上,这期间α3β2 nAChRs亚型会在卵母细胞膜上表达,通过双电极电压钳技术,检测所表达的受体是否具有配体门控离子通道的功能,用不同浓度的乙酰胆碱（ACh）配体诱导该受体产生不同的内向电流,测定了配体的浓度剂量反应效果。并利用α3β2的特异性探针芋螺毒素LtIA对受体的特性进行了检测。结果表明,α3β2 nAChRs亚型成功表达,并具有很好的ACh配体门控敏感性,不同cRNA比例注射后表达的受体具有相同的功能,对ACh具有相同的敏感性。研究结果为针对α3β2 nAChRs亚型的分子探针和新药筛选提供了模型和基础。

关键词：乙酰胆碱受体 α3β2亚型非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳

α-芋螺毒素TxIB的重组表达及其功能研究

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α-芋螺毒素TxIB的重组表达及其功能研究

第12届生物毒素研究及医药应用学术大会

作者：于津鹏朱晓鹏雷宇苗长孙东亭罗素兰海南大学热带生物资源教育部重点实验室海口市海洋药物重点实验室海南大学农学院

烟碱型乙酰胆碱受体(Neuronal nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)是一类广泛分布于中枢及外周神经系统的配体门控离子通道受体。α6β2nAChRs是其中重要的一种亚型,其作用与尼古丁成瘾、运动功能性障碍相关,是研究和治疗相关... 详细信息

烟碱型乙酰胆碱受体(Neuronal nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)是一类广泛分布于中枢及外周神经系统的配体门控离子通道受体。α6β2nAChRs是其中重要的一种亚型,其作用与尼古丁成瘾、运动功能性障碍相关,是研究和治疗相关疾病的重要靶点。α-芋螺毒素(Conotoxin,CTx)TxIB是从海南产织锦芋螺(Conus textile)中发现的,能特异作用于α6β2nAChRs,其半阻断剂量(IC)为28 nM。TxIB除了阻断α6β2亚型外,对其他已知的nAChRs亚型几乎都没有阻断活性,是迄今对α6β29nAChRs选择性最好的阻断剂,可用于区分α6β2与其他nAChRs亚型,并可作为研究α6β2nAChRs结构和功能的重要探针。目前获得芋螺毒素多肽通常采用化学合成的方法,但由于合成成本高、产率低,限制了其大规模研究应用。本研究利用生物合成的方法,将TxIB的基因片段连接到大肠杆菌表达载体pET-31b(+)上,获得的重组载体转入大肠杆菌BLR(DE3)pLysS进行表达,利用镍离子金属鳌合亲和层析技术对目的产物进行分离纯化,用生物法成功合成重组蛋白KSI-TxIB-His。利用溴化氰(Cyanogen bromide,CNBr)切割技术,去除了融合蛋白中的酮类固醇异构酶(Ketosteroidisomerase,KSI)和His-tag组氨酸标签,并通过高效液相色谱技术(HPLC)分离纯化了重组芋螺毒素TxIB(rTxIB)。利用双电极电压钳技术,对rTxIB的活性进行鉴定,结果表明,rTxIB能专一性作用于α6β2nAChRs,IC为89 nM,与天然TxIB的活性接近。该研究成功利用大肠杆菌表达了α-芋螺毒素TxIB,并对rTxIB的活性进行了检测,该研究结果可为其他芋螺毒素的生物法合成提供方法借鉴。

关键词： α-芋螺毒素 rTxIB 重组表达 pET-31b（+）电生理

α7乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达

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α7乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达

第十一届中国生物毒素研究及医药应用年会

作者：于津鹏朱晓鹏邴晖长孙东亭罗素兰海南大学热带生物资源教育部重点实验室海口市海洋药物重点实验室

α7烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs）是脑胆碱能神经系统中的一个重要部分,并且它与副交感神经系统末端的胆碱能抗炎通路相互联系。脑中的α7 nAChRs的作用涉及中枢神经系统的认知功能,故其激动剂和拮... 详细信息

α7烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs）是脑胆碱能神经系统中的一个重要部分,并且它与副交感神经系统末端的胆碱能抗炎通路相互联系。脑中的α7 nAChRs的作用涉及中枢神经系统的认知功能,故其激动剂和拮抗剂可用于多个认知功能障碍和炎症相关疾病的治疗,以及疾病机理的研究。其小分子激动剂能穿过血脑屏障且适用于多种认知功能障碍的治疗,如阿尔兹海默病和精神分裂症;其拮抗剂是激动剂的一个异构物家族,以芋螺毒素和金环蛇毒素为主要代表。因而,α7nAChRs已成为筛选与之相关的疾病治疗药物的重要靶点。虽然α7 nAChRs的特异性药物还没有进行临床试验,但近期的研究数据已显示出这一类药物具有很好的应用前景。实验采取体外转录的方法,将α7 nAChRs的基因在体外转录合成cRNA,并通过显微注射法注入非洲爪蟾卵母细胞（蛙卵）,诱导培养使α7受体在细胞膜上表达,并运用双电极电压钳技术对表达的受体进行检测。结果显示,α7 nAChRs在蛙卵体内成功表达,并记录到了与ACh浓度呈正相关的内向电流,而且在蛙卵细胞内表达的α7受体模型与天然受体具有相同的结构和功能,可以用于筛选特异性作用于α7 nAChRs的药物或先导化合物。成功地建立了用于药物筛选的α7 nAChRs表达模型。

关键词： α7 nAChRs 双电极电压钳表达

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芋螺毒素抗肿瘤研究进展

芋螺毒素抗肿瘤研究进展

第12届生物毒素研究及医药应用学术大会

作者：孙志华邴晖李晓丹朱晓鹏于津鹏长孙东亭罗素兰海南大学热带生物资源教育部重点实验室海口市海洋药物重点实验室海南大学农学院

近年来,随着天然活性物质和新的作用靶点、信号调节通路逐渐被报道,从天然活性产物中筛选抗肿瘤活性物质成为了当前癌症研究的热点,海洋生物活性物质逐渐成为创新药物的重要来源。抗癌研究表明,这些活性物质主要通过诱导癌细胞凋亡、自...

近年来,随着天然活性物质和新的作用靶点、信号调节通路逐渐被报道,从天然活性产物中筛选抗肿瘤活性物质成为了当前癌症研究的热点,海洋生物活性物质逐渐成为创新药物的重要来源。抗癌研究表明,这些活性物质主要通过诱导癌细胞凋亡、自噬、衰老、分化以及抑制新生血管生成等途径发挥抗肿瘤作用,最终致使癌细胞死亡,达到预防和治疗的目的。

关键词：