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普纳替尼(ponatinib)抑制SNU-449人肝癌细胞增殖并阻断MAPK和PDK1/AKT/mTOR信号通路

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第5期38卷 425-431页

作者：刘畅裴晋红穆秀丽于保锋弓韬梁文婷长治医学院基础部生物化学与分子生物学教研室山西长治046000 山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室山西太原030001 山西大学环境科学研究所山西太原030001

目的研究多靶点蛋白酪氨酸激酶抑制剂普纳替尼(ponatinib)对SNU-449人肝癌细胞增殖的影响及机制。方法先使用16种酪氨酸激酶抑制剂处理SNU-449肝癌细胞72 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,筛选出对SNU-449肝癌细胞最敏感的ponatini... 详细信息

目的研究多靶点蛋白酪氨酸激酶抑制剂普纳替尼(ponatinib)对SNU-449人肝癌细胞增殖的影响及机制。方法先使用16种酪氨酸激酶抑制剂处理SNU-449肝癌细胞72 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,筛选出对SNU-449肝癌细胞最敏感的ponatinib并获得半数抑制浓度(IC50)值。SNU-449细胞分为对照组、(0.06、0.3、0.6)μmol/L ponatinib处理组。采用平板克隆形成实验和倒置显微镜观察ponatinib对肝癌细胞集落形成能力和细胞形态,流式细胞术检测肝癌细胞凋亡和周期,Western blot法检测Src、磷酸化的Src(p-Src)、丝裂原激活的蛋白激酶激酶(MEK)、磷酸化的MEK(p-MEK)、胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化的ERK(p-ERK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)、磷酸化的PDK1(p-PDK1)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷酸化的mTOR(p-mTOR)的表达。结果在16种酪氨酸激酶抑制剂中,ponatinib能够有效抑制SNU-449肝癌细胞增殖。Ponatinib促进SNU-449细胞凋亡,呈现浓度依赖性,同时能够将细胞周期阻滞在G1期。Ponatinib抑制SNU-449细胞中Src磷酸化,抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PDK1/AKT/mTOR)信号通路。结论Ponatinib能够抑制肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞并阻断MAPK和PDK1/AKT/mTOR信号通路,可能是一种治疗肝癌的潜在药物。

关键词：普纳替尼(pormtinib) 细胞增殖细胞凋亡细胞周期肝癌细胞信号通路

抗癌新靶点SLC33A1基因的生物信息学预测分析

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中国生物制品学杂志 2023年第11期36卷 1313-1318,1323页

作者：池奋清秦轲茹张宏伟于保锋山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室山西太原030001 山西省肿瘤医院血液科山西太原030013

目的对SLC33A1基因的理化性质、结构功能、蛋白相互作用以及不同物种间的同源性进行生物信息学预测分析,为SLC33A1功能的进一步研究提供参考。方法利用多种不同的生物信息学工具,对SLC33A1基因的理化性质、亲疏水性、信号肽结构、跨膜... 详细信息

目的对SLC33A1基因的理化性质、结构功能、蛋白相互作用以及不同物种间的同源性进行生物信息学预测分析,为SLC33A1功能的进一步研究提供参考。方法利用多种不同的生物信息学工具,对SLC33A1基因的理化性质、亲疏水性、信号肽结构、跨膜结构、亚细胞定位、三维空间结构、翻译后修饰位点、蛋白相互作用等进行预测分析。结果SLC33A1蛋白是一种中性稳定蛋白,具有疏水性,不存在信号肽序列,主要分布于细胞膜及膜结构细胞器,在囊泡膜的概率为13.0%;SLC33A1蛋白序列有11个跨膜结构域,6个胞外结构域,6个胞内结构域;SLC33A1蛋白三级结构弹性较大,空间结构比较稳定,拥有2个N-糖基化位点、2个O-糖基化位点及13个可能的蛋白激酶磷酸化位点;SLC33A1与ATM等7个蛋白具有高置信度的相互作用关系;SLC33A1主要参与肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)介导的未折叠蛋白应答的负调控、鞘糖脂、唾液酸化、细胞对γ射线的反应、内质网应激反应的负调控等生物学过程。结论利用多种软件对SLC33A1的性质及功能进行了深入了解,为抗癌新靶点的进一步研究提供了思路及理论支持。

关键词： SLC33A1 肿瘤生物信息学预测

酪氨酸激酶抑制剂BGJ398对人肝癌Huh-7细胞增殖、凋亡及迁移的影响及其作用机制

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中国生物制品学杂志 2023年第8期36卷 947-954页

作者：刘畅余安琪池奋清弓韬梁文婷于保锋长治医学院基础部生物化学与分子生物学教研室山西长治046000 长治医学院第一临床学院山西长治046000 山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室山西太原030001 山西大学环境科学研究所山西太原030001

目的评价酪氨酸激酶抑制剂BGJ398对人肝癌Huh-7细胞增殖、凋亡和迁移的影响,并探讨其作用机制。方法 MTT法检测10种酪氨酸激酶抑制剂对Huh-7细胞存活的影响,并分别采用单靶点动力学公式和双相动力学公式分析Huh-7细胞对BGJ398的敏感性... 详细信息

目的评价酪氨酸激酶抑制剂BGJ398对人肝癌Huh-7细胞增殖、凋亡和迁移的影响,并探讨其作用机制。方法 MTT法检测10种酪氨酸激酶抑制剂对Huh-7细胞存活的影响,并分别采用单靶点动力学公式和双相动力学公式分析Huh-7细胞对BGJ398的敏感性。将10、30和90 nmol/L BGJ398分别加入Huh-7细胞,同时设对照组(不加药物),37℃培养24 h,流式细胞术检测BGJ398对Huh-7细胞凋亡和周期的影响;划痕试验检测BGJ398对Huh-7细胞迁移能力的影响;Western blot法检测BGJ398对Huh-7细胞多条通路相关蛋白表达水平的影响。结果 10种酪氨酸激酶抑制剂均可抑制Huh-7细胞增殖,其中Huh-7细胞对BGJ398最敏感,IC50为(0.020±0.013)μmol/L;Huh-7细胞对BGJ398的反应由两相组成,其中F1相占92.8%(Kd1为36 nmol/L),F2相占7.2%(Kd2>1 000μmol/L)。与对照组比较,30和90 nmol/L BGJ398组Huh-7细胞凋亡率及处于G1期的细胞百分比均显著上升(t=-6.407~-4.459,P均<0.05),10、30和90 nmol/L BGJ398组处于S期的细胞百分比明显减少(t分别为2.982、7.859和12.425,P均<0.05);划痕24及48 h后,30、90 nmol/L BGJ398组划痕面积均明显减小(t=5.376~18.197,P均<0.05);30、90 nmol/L BGJ398组磷酸化成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)及磷酸化胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)蛋白的表达水平均明显下降(t=4.015~6.729,P均<0.01)。结论 BGJ398能够抑制人肝癌Huh-7细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,可能是通过抑制FGFR磷酸化及MAPK信号通路实现的,BGJ398有望成为治疗肝癌的潜在药物。

关键词：酪氨酸激酶抑制剂BGJ398 细胞增殖细胞凋亡细胞周期细胞迁移信号通路

基于分子信标策略的CRISPR/Cas12a荧光传感器用于循环肿瘤DNA的放大检测

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分析化学 2023年第2期51卷 184-193页

作者：张函笑代晓春周亚楠吕旭珍弓韬赵旭华于保锋山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室

构建了一种以分子信标（Molecular beacon, MB）为信号探针的CRISPR/Cas12a生物传感器，用于循环肿瘤DNA(Circular tumor DNA, ctDNA)的快速放大检测。MB具有良好的稳定性，其颈部末端分别标记有荧光素（FAM）和四甲基罗丹明（TAMRA）... 详细信息

构建了一种以分子信标（Molecular beacon, MB）为信号探针的CRISPR/Cas12a生物传感器，用于循环肿瘤DNA(Circular tumor DNA, ctDNA)的快速放大检测。MB具有良好的稳定性，其颈部末端分别标记有荧光素（FAM）和四甲基罗丹明（TAMRA）两种荧光基团。ctDNA不存在时，CRISPR/Cas12a体系无活性，无法切割MB，因此MB两端的荧光基团由于形成发夹结构的颈部相互靠近而发生荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET），显示出TAMRA的荧光。当ctDNA存在时，ctDNA特异性识别Cas12a/crRNA二元复合物并激活Cas12a的反式切割活性。由于单链DNA是Cas12a最敏感的底物，因此MB的环部单链首先被切割，继而引起颈部双链的解离而导致两种荧光团彼此远离，无法发生FRET，最终显示出FAM的荧光信号。对MB环部的碱基数目、MB浓度以及crRNA与Cas12a的浓度比例等实验条件进行了优化。在最优条件下，1.7～500 pmol/L范围内，ctDNA浓度与传感器在518 nm处的荧光强度呈线性关系，检出限为0.6 pmol/L(3σ)。将此传感器用于血清样品中ctDNA的检测，回收率在93%～110%之间。

关键词： CRISPR 生物传感器荧光共振能量转移循环肿瘤DNA

基因工程小肽——[Gly～（14）]-Humanin及人胰岛素突变体原核表达克隆的构建、表达及初步纯化

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基因工程小肽——[Gly～（14）]-Humanin及人胰岛素突变体原核表...

作者：于保锋山西医科大学

学位级别：硕士

目的 1．基因工程[Gly]-Humanin原核表达体系的构建、表达及初步纯化 2．基因工程人胰岛素突变体原核表达体系的构建、表达、初步纯化及测活方法采用基因工程手段，基因合成法分别获得[Gly]-Humanin(HNG)及人胰岛素... 详细信息

目的 1．基因工程[Gly]-Humanin原核表达体系的构建、表达及初步纯化 2．基因工程人胰岛素突变体原核表达体系的构建、表达、初步纯化及测活方法采用基因工程手段，基因合成法分别获得[Gly]-Humanin(HNG)及人胰岛素突变体(M-insulin)的cDNA序列，构建了pBV220-HNG、pTXB1-HNG及pTXB1—M-insulin原核表达质粒，基因测序确定质粒的正确性。三个质粒转化大肠杆菌工程菌株，诱导表达，Western-Blot鉴定目的蛋白。采用超声加洗涤液破碎菌体;离心加冻融分离纯化融合蛋白，研究不同的超声次数和冻融对包涵体洗涤效果的影响。放免法测定人胰岛素突变体融合蛋白的活性。结果 1．克隆构建成功构建了pBV220—HNG、pTXB1—HNG及pTXB1—M-insulin三个质粒，基因测序显示重组质粒的大小、方向、长度均正确。pBV220—HNG在大肠杆菌中未检测到表达，后两个克隆在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达，HNG及M-insulin融合蛋白表达量分别占全菌蛋白的40％及50％左右;经Western-Blot鉴定M-insulin融合蛋白可以与小鼠抗人胰岛素单克隆抗体(IgG)发生抗原抗体结合反应。 2．工程菌表达条件的研究山西医科大学 2003届硕士学位论文表达凿l株BLZI(DE3)一pTXBI一HNG及BL21(DE3)一PTXBI一介insulin均在BL培养基，37oC、ZOOrpm摇床培养4小时45分时进入对数生民中后期，此时加入终浓度0.Olmlnol/L的I尸TG开始诱导，再持续培养5小时可达到最人表达量。 3.表达产物初步纯化仁Gly”〕一Flumanin融合蛋白和人胰岛素突变体融合蛋白包涵体的洗涤方案为:lj]体沉淀溶于含Zmol，/L尿索洗涤液，超声(200W、巧O次、3 秒/次、间隔3秒)，4℃、I000Orpm离心15min后沉淀用洗涤液充分重悬，一2()℃冻存过夜，次日融化后4℃、10000rPm离心15min，取上清，即得到初步纯化的融合蛋白，可去除土要的杂蛋白，融合蛋白溶解于上清液中，纯度达到80%以:。 4.活性测定采用放射免疫法，对人胰岛素突变体融合蛋白初步纯化产物，进行放免计数，结果:每升诱导培养后的菌液表达产物中，具有的放射免疫活性为0.5单位。今士考个二目卜乙成功构建了pTXBI一HNG及pTXBI一M一insulin原核表达克隆，并获得了高效表达，经过纯化得到纯度人于80%的融合蛋白，并对人胰岛素突变体融合蛋白进行了初步活性测定。为用融合表达方式表达小分子量多肤及规模化制备小分子蛋自奠定了初步的实验和理论基础。

关键词： Humanin 胰岛素突变体内蛋白子小分子量多肽融合表达

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人多能干细胞来源的肾定向分化平台的构建

中国生物化学与分子生物学报 2022年第8期38卷 1098-1105页

作者：周冰蕊魏云亮梁婷何生冯志伟靳宁刘志贞赵虹侯淑琳于保锋解军山西医科大学生物化学与分子生物学教研室出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室山西医科大学第一医院影像科太原030001

肾是一种重要的人体器官,具有多种生理功能。然而,全球范围内约有10%的人口患有肾疾病。因此,建立一种接近人体肾的结构与功能的模型进行肾疾病的研究是十分必要的。多能干细胞体外定向诱导分化技术的兴起,为再生医学和精准医学领域注... 详细信息

肾是一种重要的人体器官,具有多种生理功能。然而,全球范围内约有10%的人口患有肾疾病。因此,建立一种接近人体肾的结构与功能的模型进行肾疾病的研究是十分必要的。多能干细胞体外定向诱导分化技术的兴起,为再生医学和精准医学领域注入了新的动力。本研究通过在体外条件下模拟体内肾发育的过程,将人多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞,通过体外定向诱导分化形成肾的祖细胞,进而建立肾的结构与功能单位:肾元。该研究通过激活WNT信号通路,同时抑制TGF-β信号通路,将人多能干细胞从多能态定向诱导至原条阶段。之后通过细胞自分化的能力使其发育至中间中胚层,再通过激活FGF信号通路,将其分化至肾祖细胞阶段。流式细胞检测结果显示,肾祖细胞占总细胞数的51.5%~61.9%。通过免疫荧光检测发现:分化得到的结构中包含肾小球足细胞、近端小管、远端小管等肾组织结构。该研究建立的肾体外分化方法,具有稳定性好、分化效率高、重复性好的特点。为研究人类肾的早期发育机制,肾疾病模型构建,以及药物筛选提供了一种新的方法。

关键词：人多能干细胞体外诱导分化肾的分化肾元

达沙替尼(dasatinib)通过上调上皮钙黏蛋白表达抑制SK-Hep-1人肝癌细胞的增殖、分散和迁移

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细胞与分子免疫学杂志 2021年第9期37卷 801-807页

目的研究多靶点激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)对SK-Hep-1人肝癌细胞增殖、黏附和迁移能力的影响及机制。方法先采用dasatinib处理SK-Hep-1、Bel-7402、SNU-423、SNU-387、Huh-7肝癌细胞,噻唑蓝(MTT)法检测dasatinib对肝癌细胞存活和增... 详细信息

目的研究多靶点激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)对SK-Hep-1人肝癌细胞增殖、黏附和迁移能力的影响及机制。方法先采用dasatinib处理SK-Hep-1、Bel-7402、SNU-423、SNU-387、Huh-7肝癌细胞,噻唑蓝(MTT)法检测dasatinib对肝癌细胞存活和增殖的影响,筛选出对dasatinib敏感的肝癌细胞;培养SK-Hep-1细胞,采用(0.5、1、2)μmol/L dasatinib处理,对照组采用二甲基亚砜(DMSO)处理。采用细胞缓慢聚集实验和分离实验检测dasatinib对SK-Hep-1肝癌细胞间同质黏附力的影响,划痕实验观察dasatinib对肝癌细胞迁移能力的影响;Western blot法检测dasatinib对上皮钙黏蛋白(E-cadherin)表达的影响。结果MTT实验证明dasatinib明显抑制肝癌细胞增殖,且SK-Hep-1细胞对dasatinib最敏感。dasatinib处理促进SK-Hep-1细胞聚集,抑制细胞分散和迁移,上调肝癌细胞E-cadherin表达。结论Dasatinib通过上调E-cadherin表达促进SK-Hep-1肝癌细胞聚集和黏附,抑制细胞增殖、分散和迁移。

关键词：达沙替尼(dasatinib) SK-Hep-1细胞上皮钙黏蛋白(E-cadherin) 黏附迁移

基于双相动力学分析靶向药物联合应用对肝癌细胞SNU-387增殖的影响及其作用机制

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中国生物制品学杂志 2021年第10期34卷 1184-1190页

目的基于双相动力学分析靶向药物联合应用对肝癌细胞SNU-387增殖的影响,并探讨其作用机制。方法 MTT法检测肝癌细胞SNU-387对11种酪氨酸激酶抑制剂(AZD6244、AZD6482、BGJ-398、BMS-754807、bosutinib、crizotinib、dasatinib、gefitinib、imatinib、sunitinib、HG6-64-1)的敏感性;分别采用单靶点动力学公式和双相动力学公式分析肝癌细胞SNU-387与BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1的相互作用,计算拟合曲线的残差平方和(the sums of squared residues,SSR);Western blot法检测BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1对SNU-387细胞关键信号通路的影响;MTT法检测BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1联合应用对SNU-387细胞增殖的影响,计算减量指数(dose reduction index,DRI)。结果 SNU-387细胞对BMS-754807、HG6-64-1及1 μmol/L的dasatinib比较敏感。与单靶点动力学公式比较,双相动力学公式可更好地分析肝癌细胞SNU-387与酪氨酸激酶抑制剂的相互作用。BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1联合应用时F1相靶点不重合,对SNU-387细胞增殖具有显著协同抑制作用。结论 BMS-754807、dasatinib和HG6-64-1通过同时抑制不同靶点协同抑制肝癌细胞SNU-387的增殖,三者联合应用有望成为一种治疗肝癌的潜在药物组合。

关键词：双相动力学分析肝癌细胞蛋白激酶抑制剂联合靶向治疗减量指数

以提高临床和科研能力为导向的生物化学教学改革探索

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基础医学教育 2023年第4期25卷 297-301页

作者：王晓霞刘红林刘志荣于保锋山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室晋中030600

生物化学是医学院校的一门重要基础课程。文章针对精准医学背景下对本科生知识结构和能力素质的要求进行教学改革探索,通过注重临床与科研能力培养的教学理念和课程设计,利于完善知识体系的系统化联系及模块化整合;采用线上线下的混合... 详细信息

生物化学是医学院校的一门重要基础课程。文章针对精准医学背景下对本科生知识结构和能力素质的要求进行教学改革探索,通过注重临床与科研能力培养的教学理念和课程设计,利于完善知识体系的系统化联系及模块化整合;采用线上线下的混合式教学模式,将精准医学理念融合在教学全过程中,培养学生分析问题、解决问题的综合运用能力及创新意识;通过能力与素质并重的多元化的评价体系提升教与学的效果。总之,以培养和强化学生临床和科研思维能力为导向的教学理念与实践,将会为精准医学的发展培养高素质的医学人才。

关键词：生物化学混合式教学临床思维科研素养