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苹果树腐烂病拮抗细菌筛选及其发酵条件研究

苹果树腐烂病拮抗细菌筛选及其发酵条件研究

作者：乔占祥河南农业大学

学位级别：硕士

苹果树腐烂病是苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)侵染引起的一种毁灭性枝干病害。病害发病轻时可造成树皮组织腐烂坏死、树势衰弱、果实产量和品质降低;严重时可导致整树枯死,甚至毁园。因此,苹果树腐烂病有苹果树“癌症”... 详细信息

苹果树腐烂病是苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)侵染引起的一种毁灭性枝干病害。病害发病轻时可造成树皮组织腐烂坏死、树势衰弱、果实产量和品质降低;严重时可导致整树枯死,甚至毁园。因此,苹果树腐烂病有苹果树“癌症”之称,由该病害造成的产量和经济损失巨大,是制约中国苹果产业健康发展的重要因素之一。目前,对腐烂病的防治主要采用化学药剂进行防治,但长期使用化学药剂一方面会导致果品的农药残留,影响消费者的身体健康,另一方面也会破坏果园的生态环境,同时也会使得病原菌抗药性上升。随着人们生活水平的不断提高,对果品质量要求的越来越高,安全、无毒,对环境友好,并且不易使病原菌产生抗药性的生物防治技术越来越受到研究者的青睐。在众多的生防菌资源中,拮抗细菌以种类多、繁殖快、适应力强而备受关注。芽孢杆菌(Bacillus spp.)因其能产生多种抗菌物质,对多种植物病原真菌都有拮抗作用,而且对植物也有促生作用,同时还可以诱导植物产生抗性等。越来越多的研究表明,芽孢杆菌在植物病害防治方面具有巨大的应用潜力。本研究采用土壤稀释法,从植物根际土壤中分离出细菌菌株,并通过皿内对峙培养和离体枝条接种试验,初步筛出3株具有明显抑制苹果腐烂病菌生长的芽孢杆菌,分别将其命名为ZM220、ZM2016和ZM3094,继而通过培养特征、生理生化与分子生物学相结合的方法明确了这三株细菌的种类归属,并对该3株芽孢杆菌进行发酵条件筛选,以期进一步提高拮抗菌株的抑菌活性。最后,对抑菌效果最好的ZM220菌株进行田间防效试验,实验结果如下:1.通过土壤梯度稀释法,从不同地区小麦根际土壤中分离出851株细菌,初筛获得48株对苹果腐烂病菌具有拮抗活性的菌株,通过皿内对峙和室内离体枝条接种试验,复筛选出3株对苹果树腐烂病菌有明显抑制效果的拮抗细菌,将其分别命名为ZM220、ZM2016和ZM3094。这三株拮抗细菌对苹果腐烂病菌的皿内抑制率分别达到了68.02%、63.49%和65.58%,其对离体枝条防效分别为92.39%、96.16%和85.89%。2.通过形态学观察、生理生化实验,并结合分子生物学分析,将三株拮抗菌株ZM220、ZM2016、ZM3094分别鉴定为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)3.对三株芽孢杆菌进行生长曲线测定及发酵条件研究,结果表明,三株拮抗细菌均在LB培养基内长势最好,在12 h时繁殖速度最快。菌株ZM220在36 h时生长达到最大量,其最佳培养条件为:2%接种量、p H 7.0、转速为200 rpm、装液量为75 ml/250 m L;菌株ZM2016在42 h时生长达到最大量,其最佳培养条件为:2%接种量、p H 7.0、转速为220 rpm、装液量为75 m L/250m L;菌株ZM3094在54 h时生长达到最大量,其最佳培养条件为:1.5%接种量、p H 7.0、200rpm、装液量为25 m L/250 m L。4.三株拮抗细菌的发酵滤液对腐烂病菌菌丝生长具有较强的抑制作用。菌株ZM220、ZM2016和ZM3094的发酵滤液,在稀释20倍后对腐烂病菌菌丝生长的抑制效果仍然高达100%。ZM220、ZM2016和ZM3094的发酵滤液稀释50倍后对苹果树腐烂病菌菌丝生长的拮抗效果分别为88.09%、80.95%、70.24%。菌株ZM220发酵液对田间腐烂病的防治效果不够理想,其田间治疗效果为36.06%。

关键词：苹果树腐烂病拮抗细菌鉴定生物防治发酵条件研究

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随机右删失数据下单调回归函数的估计

北京工业大学学报 2009年第8期35卷 1142-1147页

作者：孙志猛张赛茵北京工业大学应用数理学院北京100124

为了在随机右删失数据情况下,给出单调回归函数的合理估计,利用最大凸弱函数的理论和把未删失数据垫高的统计思想,得到了单调回归函数的一个新的估计.与核估计等传统的估计相比,该估计保证了单调性,因此在实际应用中(如儿童的生长曲线... 详细信息

为了在随机右删失数据情况下,给出单调回归函数的合理估计,利用最大凸弱函数的理论和把未删失数据垫高的统计思想,得到了单调回归函数的一个新的估计.与核估计等传统的估计相比,该估计保证了单调性,因此在实际应用中(如儿童的生长曲线的制定等),当出现右删失情况且由历史经验或常识断定回归函数是单调函数时,该估计方法更加自然和贴近实际.并在一定的假设条件下,研究了该估计的渐近分布和相合性,得到了较好的极限性质.

关键词：非参数统计随机误差回归分析估计理论

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生物降解地膜专用抗紫外剂研发与应用评价

生物降解地膜专用抗紫外剂研发与应用评价

作者：乔润猛中国农业科学院

学位级别：硕士

传统PE（聚乙烯）地膜的使用造成严重的―白色污染‖问题,为解决这个问题,全生物降解地膜逐渐发展起来,其中,PBAT（聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯）凭借良好的加工性能和机械性能成为目前主流地膜材料之一。但随着PBAT地膜的应用,出现了... 详细信息

传统PE（聚乙烯）地膜的使用造成严重的―白色污染‖问题,为解决这个问题,全生物降解地膜逐渐发展起来,其中,PBAT（聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯）凭借良好的加工性能和机械性能成为目前主流地膜材料之一。但随着PBAT地膜的应用,出现了降解速率过快、产品性能不稳定、农业生产适应性差等问题,因此需要对其进行性能提升研究。本研究从紫外线吸收剂的分子设计着手,设计并合成了以环庚三烯酚酮（UVA-0C）为核心单体的3种新型紫外线吸收剂（UVA-1C、UVA-4C和UVA-6C）,利用它们通过吹塑法制备PBAT/UVA-0C、PBAT/UVA-1C、PBAT/UVA-4C和PBAT/UVA-6C抗紫外老化地膜,并将上述地膜进行玉米田间应用评价试验。研究结果如下:（1）新合成的紫外线吸收剂中,UVA-6C的紫外吸收强度和热稳定性最高。通过改变分子量大小和与苯环相连的烷基链长短,以传统紫外线吸收剂UVA-0C为基体,合成了3种具有不同紫外吸收强度的新型紫外线吸收剂UVA-1C、UVA-4C和UVA-6C。H NMR等结果显示新型紫外线吸收剂的结构组成正确。与UVA-0C相比,UVA-1C和UVA-4C和UVA-6C拓宽了紫外吸收光谱,在238 nm和320 nm处的紫外吸收逐渐增强,且热稳定性依次增加。此外,3种新型紫外线吸收剂均可用于制备吹塑温度为150℃左右的PBAT地膜。UVA-6C紫外吸收强度最高及热稳定最强的原因有三:（1）结构中包含较多的发色基团,增强吸收紫外光能力;（2）分子量最大,提高稳定性;（3）与苯环相连的烷基链最长,有机碳链取代羟基上的氢原子的取代效应可增强热稳定性。（2）通过熔融共混吹塑法制备了PBAT、PBAT/UVA-0C、PBAT/UVA-1C、PBAT/UVA-4C和PBAT/UVA-6C地膜,其中,PBAT/UVA-6C地膜的抗紫外老化能力最强。与PBAT地膜相比,未老化前和老化360 h后的紫外吸收强度分别比PBAT地膜高23.8%和23.4%;在老化箱中的功能有效期比PBAT地膜延长240 h;老化480 h后,Mn分子量的下降率比PBAT地膜低28.5%;老化600 h后,羰基指数的下降率比PBAT地膜低7.4%;经过300 min乙醇溶剂的浸泡后,PBAT/UVA-6C地膜中的UVA迁移析出量最少。PBAT/UVA-6C地膜最强的抗老化能力与UVA-6C在PBAT中的稳定性密切相关。AFM结果显示PBAT/UVA-6C地膜的表面粗糙度值为9.5 nm,比PBAT/UVA-0C地膜降低20.2%,其与PBAT的结合程度最紧密,因此作用效果更强。这种结合紧密程度主要得益于UVA-6C结构中与苯环相连的较长的烷基链,促使其与PBAT间的紧密结合。（3）在鲜食玉米田间应用评价试验中,PBAT/UVA-6C地膜的表观降解速率最慢,有效覆盖期可延长7 d左右。覆膜33 d后,PBAT/UVA-6C地膜的紫外吸光度下降率最小,吸光度值比PBAT地膜高36.4%。覆膜47 d后,PBAT/UVA-6C地膜Mn的下降率比PBAT地膜低19.5%,CI的下降率比PBAT地膜低7.5%。覆膜40 d后,PBAT/UVA-6C地膜的拉伸负荷和直角撕裂负荷分别比PBAT地膜高17.2%和27.2%,水蒸气透过率比PBAT地膜高9.3%。覆盖PBAT/UVA-6C地膜可提高耕层土壤温度,有利于鲜食玉米生长及产量提高。覆膜前40 d,覆盖PBAT/UVA-6C地膜的耕层土壤积温比覆盖PBAT地膜高6.9%。与覆盖PBAT地膜相比,覆盖PBAT/UVA-6C地膜能够加快鲜食玉米生长进程,可使鲜食玉米提前4 d左右成熟,且鲜食玉米产量增加7.8%。与PBAT地膜相比,PBAT/UVA-6C地膜能够为鲜食玉米生长创造更适宜的环境条件,对于促进鲜食玉米生长发育和提高产量优势明显。

关键词：聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯生物降解地膜抗紫外老化性能紫外线吸收剂鲜食玉米

单级单相无电解电容Buck-Boost逆变器

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电工技术学报 2023年第24期38卷 6768-6781页

作者：王立乔陈建医程超然曹立志燕山大学电力电子节能与传动控制河北省重点实验室秦皇岛066004

该文给出一种无电解电容的单级单相Buck-Boost逆变器。该逆变器可以灵活地实现升降压以适应宽输入范围的直流侧电压;仅用一个工作于正负半周的低值直流储能电感而无需电解电容和大电感,开关器件和无源器件数目少,因而降低了成本和体积,... 详细信息

该文给出一种无电解电容的单级单相Buck-Boost逆变器。该逆变器可以灵活地实现升降压以适应宽输入范围的直流侧电压;仅用一个工作于正负半周的低值直流储能电感而无需电解电容和大电感,开关器件和无源器件数目少,因而降低了成本和体积,提高了可靠性、使用寿命和功率密度;通过改变储能电感电流方向实现极性反转,控制方式十分简洁,非常适用于中小功率光伏系统。该文详述了Buck-Boost逆变器的工作原理、升降压能力及调制策略,并在此基础上,完成该逆变器升降压、扰动以及并网控制的仿真和实验,结果良好且与理论分析相契合。

关键词：电力电子无电解电容单级单相非隔离 Buck-Boost 光伏逆变器

“五四”新文化运动时期马来亚华人女性角色探析（1914-1920） ——以《叻报》为中心

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“五四”新文化运动时期马来亚华人女性角色探析（1914-1920） —...

作者：乔岑欣华侨大学

学位级别：硕士

人们通常使用华人社会是中国本土社会的延伸来评价“二战”前中国对于华人社会的影响。“五四”新文化运动时期女性解放思潮同样深刻影响了海外的女性华人社会,促使其发生了与中国本土同步进行的现代性转型。本文运用丰富的《叻报》华... 详细信息

人们通常使用华人社会是中国本土社会的延伸来评价“二战”前中国对于华人社会的影响。“五四”新文化运动时期女性解放思潮同样深刻影响了海外的女性华人社会,促使其发生了与中国本土同步进行的现代性转型。本文运用丰富的《叻报》华人社会史料,对1914至1920年“五四”新文化运动新旧思潮鼎革时期马来亚华人女性角色问题展开系统研究,以回应马来亚女性解放思潮及其实践的社会及历史变迁问题。论文共分为五个章节。绪论部分,提出问题及阐述研究的理论、方法、资料来源与创新之处;第一章“20世纪初马来亚华人社会中的女性”,概述中国女性的出洋和20世纪初马来亚华人社会女性人口的数量、比率与分布,介绍“五四”新文化运动影响下马来亚华人社会新风气;第二章“家庭、婚姻与女性角色”,关注华人女性婚恋观、新旧婚礼仪式的变化、女性家庭角色扮演等问题;第三章“教育、女校与女生”,介绍母仪教育观和女子华校兴起背景下女校的教育教学及人才培养、女生服饰观变化、社会角色扮演和角色期待等问题;第四章“普通女工与精英女性”,聚焦普通女性的职业和精英女性的社会参与问题;第五章“‘另类’女性:娼妓”,关注妓女特殊群体职业生态及其社会问题。本文研究显示,在由传统向现代过渡的“五四”新文化运动时期,华人女性游移于新与旧、现代与传统之间,显示出转型期的诸多新特点,包括:大胆追求恋爱自由和婚姻幸福,崇尚个性解放,反对缠足,改良华服,大胆维护妇女自身权益,积极融入社会公益慈善事业等。经济独立、拥有智识、关心社会和爱国(中国)的新女性形象取代贤妻良母,成为社会对于女性新的角色期待,从而使马来亚华人女性社会的现代性转型深深打上了“五四”新文化运动思潮的烙印,成为马来亚华人女性角色转型的里程碑。

关键词：马来亚华人女性 “五四”新文化运动《叻报》

支座与桥梁横向连接失效对列车—轨道—桥梁系统动态特性的影响

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支座与桥梁横向连接失效对列车—轨道—桥梁系统动态特性的影响

作者：乔心格重庆交通大学

学位级别：硕士

支座是桥梁结构中重要部件之一,其起到了连接梁体和桥墩的承上启下作用,桥梁支座性能好坏与否对于确保桥梁的整体力学特性、维护桥梁安全服役性能具有至关重要的作用。但是在桥梁的服役过程中,由于列车荷载、温度荷载、强风荷载、地震... 详细信息

支座是桥梁结构中重要部件之一,其起到了连接梁体和桥墩的承上启下作用,桥梁支座性能好坏与否对于确保桥梁的整体力学特性、维护桥梁安全服役性能具有至关重要的作用。但是在桥梁的服役过程中,由于列车荷载、温度荷载、强风荷载、地震荷载等外载荷的综合作用,支座与梁体之间的连接销钉可能会被剪断,导致支座与梁体的横向连接失效。一旦支座和桥梁间连接失效,支座和梁体之间即会发生横向相对位移,严重破坏桥梁结构的整体性及安全服役性能,也同时严重影响桥上轨道结构的连续性和平顺性。当列车通过时,桥梁横向移动引起的轨道横向附加不平顺会加剧轮轨相互作用,恶化轮轨动态接触关系,进而影响列车的安全平稳运行。而剧烈的轮轨相互作用力也会向下通过轨道结构作用到桥梁上,导致桥梁横向变形进一步加剧,桥梁整体性和服役性能也进一步恶化;反过来,剧烈的桥梁变形会加剧轨道结构的变形,并进一步影响列车的运行性能。本文大量调研了支座与梁体横向连接失效情况下车轨桥动态特性研究成果,以贵州某铁路桥梁支座与梁体连接失效实际工程问题作为研究对象,开展支座与梁体横向连接失效情况下列车-轨道-桥梁动态特性研究。主要研究内容和结论如下:(1)基于列车-轨道-桥梁动力相互作用理论建立的考虑支座与梁体横向连接失效的车轨桥耦合动力学模型,采用该模型可以准确求解支座病害对车轨桥系统动态特性的影响。该模型可详细考虑列车悬挂系统的非线性、轮轨接触非线性、轨道随机激励等因素,并采用显-隐式混合积分的方法进行求解,可在保证计算精度的基础上提高计算效率。(2)通过现场试验及理论仿真的方法研究了有无支座病害下的桥梁自振特性,揭示了支座与梁体横向连接失效下车轨桥系统基本振动特性。结果表明:支座与梁体之间横向连接失效会严重影响列车-轨道-桥梁系统动力相互作用;当支座有、无病害时,第2阶～第5阶桥梁模态频率有较大差别,支座与梁体连接失效主要影响的是梁的横向模态以及边墩的纵飘模态;病害支座附近的梁端横向振动明显大于墩顶的横向振动,差别达到8倍之多;当支座出现病害后,墩顶横向加速度在15Hz以上的振动比梁端振动大,说明支座与梁体之间横向连接失效主要影响结构的横向振动;支座与梁体连接失效导致列车通过时的轮轨力出现了100～200Hz的高频成分,除此之外列车通过时的轮轨力频率范围主要集中在80Hz以下。(3)分析了列车运行速度、列车载重以及支座与梁体间相对位移对车轨桥系统振动的影响规律,对支座病害下列车-轨道-桥梁系统的运营安全性开展了动态评估。研究表明:当列车行驶速度在40km/h至65km/h的范围内变化时,轮重减载率的数值已经趋近于0.6的第二限度值,表明列车在该桥梁上运行时确实有可能出现运行安全隐患;随着速度的增大,病害梁端处的垂向加速度影响增幅达到200%,病害梁端的横向位移增幅达到了183.5%,中跨跨中横向加速度、第一跨跨中横向加速度的增幅也均达到了100%,病害桥墩顶部横向位移、中跨跨中横向位移、第一跨跨中横向位移也都有超过60%的增幅;随着列车载重的增大,各指标均随着列车载重量的增大而有所增大;除了轮重减载率之外,其他指标均在国家标准所规定的安全范围之内,而轮重减载率则是略微超出标准的规定,但是可以通过加重载重缓解该效应。整体来看,当支座和梁底之间横向连接失效时,列车的安全运营仍可得到有效保证。中间墩支座发生损伤下的结果规律与边墩类似,不过中间墩导致的车轨桥系统振动要大于边墩支座损伤,表明要对中间墩支座予以更为着重的关注。

关键词：桥梁支座病害列车-轨道-桥梁动力相互作用运行安全性振动特性运行速度列车载重

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欠传感器机械臂数字孪生系统关键技术研究

欠传感器机械臂数字孪生系统关键技术研究

作者：牛雨乔长安大学

学位级别：硕士

随着智能制造的发展以及工业机器人的广泛应用,构建物理信息系统实现对机器人运行状态的实时监测成为研究趋势,数字孪生作为物理空间与信息空间交互的最佳工具被有效用于这一研究中。论文将数字孪生技术用于机械臂运行状态监测,重点研... 详细信息

随着智能制造的发展以及工业机器人的广泛应用,构建物理信息系统实现对机器人运行状态的实时监测成为研究趋势,数字孪生作为物理空间与信息空间交互的最佳工具被有效用于这一研究中。论文将数字孪生技术用于机械臂运行状态监测,重点研究其孪生端数字模型的建立,在实时状态采集的问题上提出这种欠传感器设备的状态采集方案,结合机械臂运动学模型,设计一种基于测量数据与运动学模型差值的动态偏差补偿的建模方法,实现模型对实体状态的逼近。针对这类控制器通讯接口不开放所导致的无法读取设备内部传感器实时数据的欠传感器设备而言,论文提出的方法可提供一定帮助。主要完成如下几个方面的工作:(1)完成了欠传感器机械臂数字孪生系统总体架构的设计,并针对所涉及的关键技术进行说明。(2)针对孪生端数字模型的实时性要求,进行了机械臂运动学模型建模工具的选型,完成了机械臂运动学建模,分析了该模型的实时性,得到运动学模型计算数据。(3)完成了机械臂的外置式传感器数据采集模块的设计。包括数据采集方案的设计、数据滤波处理以及针对测量中误差的处理。(4)完成了机械臂孪生端数字模型的建立。提出逼近实体状态的建模方案,完成了考虑偏差的拟合算法研究,并通过实验数据进行测试。(5)设计了欠传感器机械臂数字孪生软件,说明软件功能与实现过程,针对机械臂运行状态进行软件的测试。通过以上内容的研究和测试,所设计的欠传感器机械臂数字孪生系统实现了预期的功能,研究结果对于数字孪生技术中孪生端数字模型的精确化设计具有一定的参考意义。

关键词：欠传感器数字孪生机器人运动学孪生端数字模型偏差拟合

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小学高年级英语分级阅读教学的行动研究

小学高年级英语分级阅读教学的行动研究

作者：乔久幸天津师范大学

学位级别：硕士

随着时代的发展,传统阅读的内涵已经无法适应现代社会对阅读的要求。目前,发展学生的阅读素养,已成为全社会的广泛共识。一个人的精神发展史就是阅读史。但是,如何在科学有效的指导下,提高学生的阅读能力,形成优秀的文化品格,促进阅读... 详细信息

随着时代的发展,传统阅读的内涵已经无法适应现代社会对阅读的要求。目前,发展学生的阅读素养,已成为全社会的广泛共识。一个人的精神发展史就是阅读史。但是,如何在科学有效的指导下,提高学生的阅读能力,形成优秀的文化品格,促进阅读品质的发展,是摆在教师面前亟待解决的问题。2022年版的《义务教育英语课程标准》提出要构建以分级体系为基础的英语课程结构。分级阅读就是根据青少年的身心发展规律和认知发展水平,为其选择适合的阅读材料,以促进学生的有效发展。因此,本研究以山西省晋中市某小学六年级某班49名学生为研究对象,在该班级开展两轮分级阅读的行动研究,旨在探究分级阅读在小学高年级英语阅读教学中的影响。本研究拟探讨以下三个问题:(1)分级阅读能否有效提高小学高年级学生的阅读能力?(2)分级阅读能否有效改善小学高年级学生的阅读习惯?(3)分级阅读能否有效提升小学高年级学生的阅读体验?经过14周的行动研究,结合在行动过程中使用的研究工具:调查问卷、师生访谈以及阅读测试卷等,我们发现:分级阅读可以有效提高小学高年级学生的阅读能力、改善学生的阅读习惯,提升学生的阅读体验。除此之外,本文还探讨了当前在开展英语分级阅读教学行动研究时遇到的问题和改进措施。最后,为了优化分级阅读在小学高年级阅读教学中的质量,本文提出了以下三点教学启示:第一,选择恰当的分级阅读材料;第二,进行有效的分级阅读指导;第三,采取科学的分级阅读评价。

关键词：分级阅读小学英语阅读教学行动研究

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D-甘露糖异构酶的分子改造与定向挖掘

D-甘露糖异构酶的分子改造与定向挖掘

作者：罗小乔南昌大学

学位级别：硕士

D-甘露糖作为一种功能糖,具有调节免疫系统、抗炎、抗肿瘤、抑菌等多种生理活性,已广泛应用于医药、食品和日化等领域。目前D-甘露糖的生产主要依赖于植物水解和化学合成,然而,植物水解生产D-甘露糖受到了环境、季节和地域等外界因素限... 详细信息

D-甘露糖作为一种功能糖,具有调节免疫系统、抗炎、抗肿瘤、抑菌等多种生理活性,已广泛应用于医药、食品和日化等领域。目前D-甘露糖的生产主要依赖于植物水解和化学合成,然而,植物水解生产D-甘露糖受到了环境、季节和地域等外界因素限制,化学合成法因其反应条件苛刻、伴有大量的副产物而不满足消费者的健康需求,因此,具有绿色、温和、特异性高等优点的酶催化法受到大众关注,其中D-甘露糖异构酶(Mannose isomerase,MIase)是D-甘露糖酶法生产的关键酶之一,但MIase存在的酶活力低、热稳定性较差等问题严重限制了该酶的工业生产,因此,通过分子改造提高已知MIase的酶学性质或挖掘能编码酶活力高、稳定性好的MIase的基因片段成为了该酶的研究重点。为了给MIase分子改造提供一种新思路和为工业生产D-甘露糖提供候选酶,本论文一方面在已知结构和催化机理的yih S基因编码的MIase的基础上进行定点饱和突变,构建一种新型有效的高通量筛选方法,筛选催化水平与稳定性较高的突变体,并分析其功能、结构和催化机制之间的联系。另一方面采用基因挖掘技术定向挖掘酶学性质较好的新型D-甘露糖异构酶,并通过同源建模、分子模拟技术初步对其结构、催化中心和关键氨基酸进行探究。主要的研究内容与结果如下:1.以重组质粒p ET-22b(+)-yih S为载体,基于分子动力学模拟筛选的R335、E363、G377三个位点对其进行定点饱和突变。通过构建的间苯二酚-盐酸法高通量一轮筛选、高效液相法二轮筛选粗酶液的性质,初步获得了相对酶活高于300%的突变体E363R和R335T,热稳定性较好的R335T与E363V,耐酸性较好的R335F。经纯化后,测定了四个突变体的酶学性质与结构变化,结果表明R335T和E363R对D-果糖的催化活性较野生型(Wild-type,WT)分别提高了128%、85%。R335T、E363R和E363V在40℃时热稳定性分别提高了141%、20%和28%。R335F、R335T和E363V的蛋白结构较WT有更多的酪氨酸(Tyrosine,Tyr)残基和色氨酸(Tryptophan,Trp)残基被暴露出来。四个突变体的β-折叠与β-转角含量较WT均减少,其中R335T的β-转角含量比WT少7.31%,无规则卷曲的含量远高于WT,含量为41.63%,α-螺旋含量比WT高2.17%。2.R335T在四个突变体中展现出最好的热稳定性、最高酶催化活力和较好的酸碱稳定性,所以深入研究R335T的结构对该酶的进一步分子改造具有理论指导意义。R335T的苏氨酸(Thr335)残基伸展自由度比WT的精氨酸(Arg335)残基小,Thr335附近静电重新分布,正电荷减少。R335T的均方根偏差(Root mean square deviation,RMSD)值低于WT,碳骨架结构趋于稳定。R335T的α-螺旋含量比WT高,能比WT更好地维持碳骨架结构与蛋白稳定。R335T活性中心上方的loop129～136的灵活性比WT好,更有助于底物通过催化通道,进入酶的活性中心,这与R335T具有较高酶活性密切相关。3.以Lib Dock Score评判从数据库中挖掘的19条MIase氨基酸序列与甘露糖的亲和力,以酶活力为筛选指标,发现源于双歧杆菌的新型D-甘露糖异构酶(Bifi-MIase)的最适反应温度较高、热稳定性较好。Bifi-MIase在55℃,p H 7.5条件下表现出最高活性,以果糖为底物,酶活为407 U mg。Bifi-MIase在45、55、60、65和75℃下的半衰期(t)分别为762.63、483.70、70.8、54.54和19.91min。Bifi-MIase催化果糖为甘露糖的转化率约为29%,催化D-果糖的动力学参数K、V和k/K值分别为538.7±62.5 m M、11.7±0.9μmol mg s和1.02±0.3 m M s。Bifi-MIase的整体结构、形成结合口袋和深裂缝的残基与沙门氏菌MIase(Se Yih S)具有高度相似性,推测His387可能是Bifi-MIase打开吡喃糖环的主要氨基酸残基,His253残基是主要的酸碱催化剂。

关键词： D-甘露糖 D-甘露糖异构酶稳定性定点饱和突变分子模拟