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稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO细胞系的构建与鉴定

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河南农业科学 2023年第6期52卷 131-138页

作者：孙雪珂丁培阳王思桥刘思源李明慧常泽杰陈艺兰李瑞琪张改平河南农业大学生命科学学院河南郑州450002 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 郑州大学生命科学学院河南郑州450001 江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接EL... 详细信息

为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示,稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立,并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白;且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好,具有良好的免疫原性,中和效价为1∶128。综上,成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系,且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。

关键词：猪δ冠状病毒 S1蛋白 CHO细胞稳定表达蛋白质纯化

噬菌体随机肽库筛选HPV45亚型L1蛋白抗原表位

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郑州大学学报（理学版） 2022年第1期54卷 88-94页

作者：彭亚允栗宁陈玉梅周景明刘红亮祁艳华梁超丁培阳朱习芳王爱萍郑州大学生命科学学院河南郑州450001

高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)可诱发女性宫颈癌,HPV45是HPV主要高危亚型之一,L1蛋白是主要的保护性蛋白。以大肠杆菌表达、纯化获得的重组蛋白SUMO-45 L1作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗HPV45 L1蛋白的单克隆抗体,... 详细信息

高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)可诱发女性宫颈癌,HPV45是HPV主要高危亚型之一,L1蛋白是主要的保护性蛋白。以大肠杆菌表达、纯化获得的重组蛋白SUMO-45 L1作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗HPV45 L1蛋白的单克隆抗体,并以单克隆抗体3C11为靶分子,使用噬菌体展示技术对随机十二肽库进行亲和淘选,三轮筛选后挑选12个与单抗3C11反应较强的克隆进行测序并分析。结果表明,噬菌体所展示的氨基酸序列与HPV45 L1蛋白序列“381VPNTYD386”相同,将其进行肽的合成,并通过斑点-酶联免疫吸附测定(dot enzyme-linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)和间接竞争ELISA鉴定,最终鉴定出单克隆抗体3C11识别的L1蛋白线性表位“381VPNTYD386”。该表位的鉴定,为进一步分析HPV45 L1蛋白的结构和功能关系奠定了基础。

关键词：人乳头瘤病毒 L1蛋白单克隆抗体噬菌体展示技术表位

山羊子宫内膜细胞与性腺激素对uNK细胞分泌活性的调节作用

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畜牧兽医学报 2013年第6期44卷 866-870页

作者：廖庆红丁培阳赵丹丹王爱华齐雪峰西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

为探讨山羊子宫内膜细胞和性腺激素对子宫自然杀伤(uNK)细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和γ-干扰素(IFN-γ)含量的影响。本研究以永生化山羊子宫内膜基质细胞(ESC)和上皮细胞(EEC)为体外研究模型,通过ELISA法检测子宫内膜细胞和性腺激... 详细信息

为探讨山羊子宫内膜细胞和性腺激素对子宫自然杀伤(uNK)细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和γ-干扰素(IFN-γ)含量的影响。本研究以永生化山羊子宫内膜基质细胞(ESC)和上皮细胞(EEC)为体外研究模型,通过ELISA法检测子宫内膜细胞和性腺激素(E2和P4)对uNK细胞分泌VEGF和IFN-γ含量的影响。结果显示,在uNK细胞与EEC共培养时,雌激素E2单独或与P4共同作用可显著抑制uNK细胞中IFN-γ和VEGF分泌水平(P<0.05),而P4单独作用不显著;而当uNK细胞与ESC共培养时,孕酮P4单独或与E2共同作用可显著增强IFN-γ在uNK细胞中的分泌水平(P<0.05),而E2单独或与P4共同作用可显著抑制VEGF分泌水平(P<0.05)。研究结果表明性腺激素对与EEC或ESC共培养的uNK细胞分泌水平具有不同程度的调节作用。

关键词：山羊子宫内膜上皮细胞性腺激素 uNK细胞分泌活性

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新城疫病毒HN蛋白的酵母表达及其活性鉴定

河南农业科学 2020年第3期49卷 145-150页

作者：李旭锋王垚金前跃周稳柴永笑陈晓丁培阳张改平河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

为了制备新城疫病毒(NDV)HN蛋白并研究其免疫原性,将优化的HN基因胞外区插入毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性转化子,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE和West... 详细信息

为了制备新城疫病毒(NDV)HN蛋白并研究其免疫原性,将优化的HN基因胞外区插入毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性转化子,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot鉴定筛选出目的蛋白表达菌株;通过对诱导剂含量、诱导时间、培养基初始pH值和诱导温度进行优化,研究最佳表达条件;采用镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA对目的蛋白进行鉴定;利用去糖基化酶PNGase F对目的蛋白进行处理,验证其糖基化修饰程度.结果显示,HN重组蛋白在毕赤酵母中成功表达,且在28℃ 条件下,培养基初始pH值为7.0,用0.5%甲醇诱导5 d,蛋白质表达量最高;通过镍柱亲和层析可获得纯度高于90%的重组蛋白;间接ELISA结果表明,重组蛋白活性良好;去糖基化试验验证了重组蛋白存在糖基化修饰.综上,利用毕赤酵母X-33成功表达了HN蛋白,且纯化产物纯度较高、活性良好,具有糖基化修饰.

关键词：新城疫病毒 HN蛋白毕赤酵母蛋白质纯化蛋白质活性

妊娠山羊子宫uNK细胞与VEGF动态分布研究

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畜牧兽医学报 2014年第5期45卷 821-826页

作者：丁培阳刘艳利曹阳坡李笑靳亚平王爱华齐雪峰西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

探讨子宫内自然杀伤细胞(uNK)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)在正常妊娠山羊子宫的动态分布规律。采用免疫组织化学技术对uNK细胞和VEGF在妊娠山羊子宫内的分布以及含量的动态变化进行研究,并通过RT-PCR技术检测VEGF mRNA的动态转录水平... 详细信息

探讨子宫内自然杀伤细胞(uNK)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)在正常妊娠山羊子宫的动态分布规律。采用免疫组织化学技术对uNK细胞和VEGF在妊娠山羊子宫内的分布以及含量的动态变化进行研究,并通过RT-PCR技术检测VEGF mRNA的动态转录水平。结果显示:在妊娠早期,uNK细胞和VEGF大量存在于蜕膜部;妊娠中期,在子宫基质、腺体和肌层血管处检测到大量uNK细胞和VEGF表达;在妊娠后期,uNK细胞量和VEGF表达急剧减少。RT-PCR技术检测显示,妊娠早期和妊娠中期VEGF mRNA的转录量差异不显著,但均显著高于妊娠晚期VEGF mRNA的转录水平(P<0.05)。山羊子宫内uNK细胞和VEGF在妊娠不同时期的分布规律呈现一定相关性。

关键词：山羊 uNK细胞 VEGF 动态分布 RT-PCR

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禽腺病毒4型XZ株增殖与纯化方法的建立

动物医学进展 2019年第11期40卷 40-44页

作者：柴永笑金前跃李旭锋王垚丁培阳周稳罗俊郅玉宝张改平河南农业大学河南郑州450002 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 西北农林科技大学陕西杨凌712100

2015年7月以来,禽腺病毒4型在中国的大部分地区暴发流行,并造成重大损失。为进一步对该病毒进行研究,采用两种方法对所分离的XZ株进行体外增殖培养,并利用透射电镜观察到完整的病毒粒子,同时采用超滤浓缩和凝胶层析的方法对病毒进行纯... 详细信息

2015年7月以来,禽腺病毒4型在中国的大部分地区暴发流行,并造成重大损失。为进一步对该病毒进行研究,采用两种方法对所分离的XZ株进行体外增殖培养,并利用透射电镜观察到完整的病毒粒子,同时采用超滤浓缩和凝胶层析的方法对病毒进行纯化。结果显示,成功建立了稳定的禽腺病毒4型XZ株增殖体系,以及温和、高效的病毒纯化工艺,且纯化病毒感染性强,具有很好的免疫原性。

关键词：禽腺病毒4型 XZ株增殖与纯化

猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选

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河南农业科学 2019年第10期48卷 133-139页

作者：王垚金前跃周稳李旭锋柴永笑丁培阳陈晓邢云瑞李艳华郭军庆张改平河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 西北农林科技大学陕西杨凌712100

为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,... 详细信息

为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定。同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定。结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体。

关键词：猪伪狂犬病毒 gE蛋白毕赤酵母单克隆抗体

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猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究

动物医学进展 2020年第1期41卷 1-7页

作者：周稳金前跃陈晓丁培阳李旭峰王垚柴永笑张雨航周恩民郭军庆郅玉宝张改平西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪... 详细信息

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白毕赤酵母蛋白纯化免疫活性

表达猪白细胞介素-4的重组PRRSV在猪体内的免疫效果评价

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表达猪白细胞介素-4的重组PRRSV在猪体内的免疫效果评价