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生长停滞特异性转录本5在乳腺癌中低表达并抑制上皮细胞-间充质转化

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南方医科大学学报 2017年第11期37卷 1427-1435页

作者：丁勇兴段克才陈素莲蚌埠市第三人民医院普外肿瘤科蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心安徽蚌埠233000

目的探讨生长停滞特异性转录本5(lncRNA-GAS5)在乳腺癌中发展和上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中的影响。方法采用实时定量聚合酶链反应法检测乳腺癌组织和癌旁组织(n=36)、乳腺癌MCF-7亲本和耐药细胞中lncRNA-GAS5的表达,并分析GAS5表... 详细信息

目的探讨生长停滞特异性转录本5(lncRNA-GAS5)在乳腺癌中发展和上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中的影响。方法采用实时定量聚合酶链反应法检测乳腺癌组织和癌旁组织(n=36)、乳腺癌MCF-7亲本和耐药细胞中lncRNA-GAS5的表达,并分析GAS5表达与乳腺癌临床分期和淋巴结转移相关性;qRT-PCR法、Western blot和免疫组化法检测细胞周期和EMT相关蛋白的表达;迁移、趋化和黏附分离实验检测细胞生物学活性;通过光学显微镜观察细胞的形态学变化;以耐药细胞株构建裸鼠乳腺癌模型,体内探讨过表达GAS5对紫杉醇抗乳腺癌作用的影响。结果 LncRNA GAS5转录本水平相对于癌旁组织是显著降低的(P<0.05),GAS5低表达与乳腺癌TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05);耐药细胞株中GAS5表达下调(P<0.05),GAS5与P21表达正相关,而与CDK6表达呈负相关;体外干扰GAS5促进乳腺癌亲本细胞株发生EMT表型改变和侵袭能力增加,而过表达lncRNA GAS5可抑制乳腺癌耐药细胞株EMT表型和侵袭能力(P<0.05),并提高紫杉醇的药物敏感性。体内实验发现,过表达GAS5通过逆转EMT标志蛋白,提高紫杉醇抑制肿瘤生长和肺转移的作用。结论 LncRNA GAS5低表达可能通过诱导EMT促进乳腺癌的肺转移,可能是乳腺癌的一个潜在治疗靶点。

关键词：长链非编码RNA 生长停滞特异性转录本5 乳腺癌上皮细胞-间充质转化

99mTc-vMIP-ⅡN端肽在乳腺癌分子显像的实验研究

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99mTc-vMIP-ⅡN端肽在乳腺癌分子显像的实验研究

作者：丁勇兴安徽医科大学

学位级别：硕士

目的探讨特异性结合趋化因子4受体(Cytokine receptor4，CXCR4)，来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ(virus macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21个氨基酸的多肽(NT21MP)在乳腺癌靶向诊断的应用价值;探索具有较高放化纯度和良... 详细信息

目的探讨特异性结合趋化因子4受体(Cytokine receptor4，CXCR4)，来源于病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ(virus macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21个氨基酸的多肽(NT21MP)在乳腺癌靶向诊断的应用价值;探索具有较高放化纯度和良好稳定性的Tc直接标记NT21MP的方法，筛选最佳标记条件，建立一种简便可靠的Tc-NT21MP制备方法;建立乳腺癌动物模型，SPECT显像探讨Tc-NT21MP对乳腺癌显像的可行性;为Tc-NT21MP在乳腺癌早期诊断中的应用提供理论和实验依据。方法①采用免疫荧光染色法检测小鼠乳腺癌细胞4T-1中CXCR4的表达及NT21MP与CXCR4的结合;②采用预锡化法直接标记NT21MP，纸层析法测标记率及放化纯度，筛选最佳标记条件，并测其在生理盐水或37℃人血清中不同时间点的放化纯，观测其体内外稳定性;③标记好的Tc-NT21MP与SKBR3细胞进行体外放射受体分析，通过饱和及抑制实验，检验其受体结合活性;④制备荷乳腺癌细胞株4T-1细胞荷瘤鼠，实验分为三组(空白对照组、生理盐水组和NT21MP治疗组)，建模后第3周，局部出现明显肿块后，尾静脉注射3.7MBq(0.1ml)Tc-NT21MP，于注射后0.5h、1h和2h进行SPECT显像，用ROI分析靶(T)与非靶(NT)比值;⑤免疫组化法检测荷乳腺癌小鼠原发肿瘤细胞中CXCR4的表达;⑥荷乳腺癌小鼠原发肿瘤的大小检测。结果小鼠乳腺癌细胞株4T-1细胞中高表达CXCR4受体;未以渗透剂处理时，NT21MP与4T-1细胞膜上受体结合，以渗透剂处理后，NT21MP可进入细胞内，与胞浆和胞核中CXCR4高效结合;以2μg肽、25μg SnCl2、100℃孵育15min标记率最高，游离Tc为0，胶体85%，超过2h后放化纯下降较明显;受体分析显示大结果显示：Tc-NT21MP具有可饱和及抑制的受体结合特性，且亲和力较高，RT=23.2174pmol，KD=0.4348nmol;SPECT显像显示Tc-NT21MP注射后能迅速靶向肿瘤组织，生理盐水组2h的T/NT达4.65，而NT21MP组T/NT则为1.38;NT21MP治疗组原发瘤乳腺癌细胞的CXCR4表达较生理盐水组下调，且肿瘤生长抑制。结论Tc-NT21MP易于制备，且具有良好的放射化学品质，能与CXCR4阳性的乳腺癌细胞高亲和力结合，Tc-NT21MP SPECT显像具有T/NT比值高的特点，具有受体靶向性，表明Tc-NT21MP是一个较理想的CXCR4阳性肿瘤的受体显像剂，本研究为乳腺癌的受体诊断提供了理论和实验依据。

关键词：乳腺癌 CXCR4/vMIP-Ⅱ 受体显像靶向

pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒的构建及其在活细胞内的作用

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浙江大学学报（医学版） 2012年第5期41卷 519-526页

作者：高艳军杨清玲陈昌杰丁勇兴蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心蚌埠医学院生化与分子生物学教研室蚌埠市中心医院普外肿瘤科安徽蚌埠233030

目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用。方法:应用化学合成法获得巨噬细胞... 详细信息

目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用。方法:应用化学合成法获得巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viralmacrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21肽(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)编码的基因序列,克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VC155中,筛选含有目标基因的正确克隆。利用RT-PCR扩增人乳腺癌细胞株SKBR3的CXCR4全长基因后,T-A亚克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VN173载体中。然后,经酶切鉴定及DNA测序分析2个基因是否正确连接至真核表达载体中。应用脂质体转染的方法共转染pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VC155-CXCR4至细胞株COS-7中,在荧光显微镜下观察NT21MP与CXCR4在胞内的相互作用。结果:经DNA测序及同源性对比,证实pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VN173-CXCR4重组载体构建成功;基因片段与NCBI基因库vMIP-Ⅱ和CXCR4基因CDS序列同源性达99.9%。BiFC法观察NT21MP与CXCR4在细胞内结合出现的荧光信号,该信号分布细胞内。结论:本实验成功构建了应用BiFC技术的真核表达载体,并且在活细胞内检测到NT21MP与CXCR4的互相结合。

关键词：受体,趋化因子/遗传学趋化因子CXCL2 质粒重组蛋白质类/遗传学遗传载体转染遗传互补测验

长链非编码RNA RP11-770J1.3和跨膜蛋白25对紫杉醇耐药人乳腺癌细胞株耐药性的影响

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浙江大学学报（医学版） 2017年第4期46卷 364-370页

作者：李钰王月月王海凤张凌宇丁勇兴陈素莲杨清玲陈昌杰蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心安徽蚌埠233000 蚌埠市第三人民医院普外肿瘤科安徽蚌埠233000 蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室安徽蚌埠233000

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)RP11-770J1.3和跨膜蛋白25(TMEM25)对紫杉醇耐药人乳腺癌细胞株耐药性的影响。方法:利用实时定量PCR检测lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25在人乳腺癌细胞MCF-7和紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/PR)中的表达。在MCF-7... 详细信息

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)RP11-770J1.3和跨膜蛋白25(TMEM25)对紫杉醇耐药人乳腺癌细胞株耐药性的影响。方法:利用实时定量PCR检测lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25在人乳腺癌细胞MCF-7和紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/PR)中的表达。在MCF-7/PR中转染lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的干扰片段,磺酰罗丹明B法检测MCF-7/PR对紫杉醇药物敏感性的变化,并运用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测多药耐药相关蛋白(MRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、多药耐药基因1(MDR1)及其编码产物P-gp mRNA和蛋白水平的改变。结果:lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25在MCF-7/PR中表达上调(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组和紫杉醇阴性对照组比较,干扰lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的表达可以提高MCF-7/PR对紫杉醇的药物敏感性,并下调耐药相关基因MRP、BCRP、MDR1及其编码产物P-gp的表达(均P<0.05);与单独干扰lncRNA RP11-770J1.3或TMEM25比较,同时干扰lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的作用更加明显(P<0.05)。结论:MCF-7/PR中lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的表达上调,联合干扰lncRNA RP11-770J1.3和TMEM25的表达可以提高MCF-7/PR对紫杉醇的敏感性。

关键词： RNA 膜蛋白质类/代谢乳腺肿瘤/病理生理聚合酶链反应紫杉酚/药理学细胞系肿瘤/病理学肿瘤细胞培养的抗药性肿瘤

vMIP对细胞膜上趋化因子受体亲和力的结合特性研究

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上海交通大学学报（医学版） 2006年第4期26卷 389-392页

作者：杨清玲丁勇兴蚌埠医学院生化与分子生物学教研室蚌埠233000 蚌埠市中心医院肿瘤科

目的通过病毒巨噬细胞炎性蛋白(vMIP)对外周血中单个核细胞(PBMC)膜上趋化因子受体结合的比较性研究,阐明vMIP与受体的结合能力。方法通过放射性配体受体结合实验,利用饱和实验、动力学实验和特异性分析,鉴定vMIP的受体结合能力。结果v... 详细信息

目的通过病毒巨噬细胞炎性蛋白(vMIP)对外周血中单个核细胞(PBMC)膜上趋化因子受体结合的比较性研究,阐明vMIP与受体的结合能力。方法通过放射性配体受体结合实验,利用饱和实验、动力学实验和特异性分析,鉴定vMIP的受体结合能力。结果vMIP与人、食蟹猴PBMC膜上受体结合的Kd分别为11.1、14.3nmol/L,对趋化因子受体CCR5和CXCR4竞争结合的IC50分别为3.4、4.5nmol/L。结论提示了vMIP与膜上受体有较高的亲和力,并对CCR5和CXCR4具有高度特异性,可能对防治炎症及HIV1感染等具有重要意义。

关键词：病毒巨噬细胞炎性蛋白趋化因子受体放射性配体受体结合实验

RNAi抑制MCF-7细胞survivin基因及对多西他赛敏感性影响

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中国药理学通报 2008年第6期24卷 792-796页

作者：杨清玲丁勇兴王惠李成华蚌埠医学院生化与分子生物学教研室安徽蚌埠233000 蚌埠市中心医院肿瘤科安徽蚌埠233000 蚌埠医学院临床检验诊断实验中心安徽蚌埠233000

目的利用RNAi技术抑制乳腺癌细胞株MCF-7sur-vivin基因,观察MCF-7细胞株的细胞凋亡率、survivin蛋白表达及对多西他赛(docetaxel)药物敏感性的变化。方法以培养的乳腺癌MCF-7细胞株为体外研究模型,设对照组、空载体组及RNAi组进行实验。... 详细信息

目的利用RNAi技术抑制乳腺癌细胞株MCF-7sur-vivin基因,观察MCF-7细胞株的细胞凋亡率、survivin蛋白表达及对多西他赛(docetaxel)药物敏感性的变化。方法以培养的乳腺癌MCF-7细胞株为体外研究模型,设对照组、空载体组及RNAi组进行实验。(1)半定量RT-PCR、Western blot法检测survivin mRNA、蛋白在各组细胞中的表达;(2)用流式细胞术分析各组细胞周期及细胞凋亡率的影响;(3)用MTT法分析多西他赛对各组细胞存活率作用的浓度。结果(1)RT-PCR检测结果显示,RNAi组survivin扩增条带(134bp)明显弱于空载体组及对照组,mRNA相对含量较空载体组明显下降(75.4%),差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测空载体组与对照组survivin蛋白条带明显存在,且基本一致,而RNAi组同样位置的条带基本消失(79.8%);(2)RNAi组细胞阻滞在G0/G1期,与空载体组和对照组分别比较,差异有统计学意义(P<0.05);(3)MTT比色法检测结果显示,不同浓度多西他赛处理后对照组、空载体组、RNAi组的IC50分别为(124.7±0.21)、(116.9±0.25)、(15.2±2.8)μg.L-1,RNAi组MCF-7细胞对多西他赛的药物敏感性增高(P=0.000)。结论RNAi明显抑制了survivin在转录及翻译水平的表达;RNAi抑制survivin基因表达,能明显提高乳腺癌MCF-7细胞对多西他赛的药物敏感性。

关键词：乳腺癌 survivin 多西他赛 RNA干扰

病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ N端肽调控SDF-1α/CXCR4诱导趋化机制

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细胞与分子免疫学杂志 2012年第2期28卷 137-140页

作者：杨清玲丁勇兴陈昌杰杨志峰高艳军蚌埠医学院生化与分子生物学教研室蚌埠市中心医院肿瘤外科安徽蚌埠233000

目的:评价病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅡN端肽(NT21MP)是否通过干扰SDF-1α/CXCR4信号抑制人乳腺癌细胞株SKBR3细胞的趋化作用。方法:以RT-PCR和免疫组化检测SKBR3和MCF-7两种人乳腺癌细胞中CXCR4的表达;用细胞转移实验检测在NT21MP存在或缺... 详细信息

目的:评价病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅡN端肽(NT21MP)是否通过干扰SDF-1α/CXCR4信号抑制人乳腺癌细胞株SKBR3细胞的趋化作用。方法:以RT-PCR和免疫组化检测SKBR3和MCF-7两种人乳腺癌细胞中CXCR4的表达;用细胞转移实验检测在NT21MP存在或缺乏的情况下SDF-1α诱导SKBR3细胞的趋化作用;以Fluo3/AM为细胞内游离钙离子的荧光指示剂,用激光扫描共聚焦显微镜测定NT21MP对SDF-1α诱导SKBR3细胞内游离钙浓度的影响;Western blot分析ERK1/2和FAK蛋白的磷酸化水平变化。结果:相对于MCF-7细胞,SKBR3细胞中CXCR4蛋白表达水平较高;经SDF-1α处理后,SKBR3的迁移能力提高,CXCR4抑制剂AMD3100可有效抑制SKBR3细胞的迁移,细胞经NT21MP预处理后,可剂量依赖性地抑制SKBR3细胞的迁移(P<0.05);NT21MP也可抑制由SDF-1α诱导的细胞内Ca2+峰值(P<0.05),而钙离子浓度升高是SKBR3细胞迁移的重要信号之一;另外,相对于阴性对照组,NT21MP也可下调SDF-1α诱导的SKBR3中信号蛋白ERK1/2和FAK的磷酸化水平(P<0.05)。结论:NT21MP可抑制SDF-1α诱导的SK-BR3细胞的迁移,可能与其上游钙离子释放和ERK1/2及FAK磷酸化阻断信号有关。

关键词：病毒巨噬细胞炎性蛋白 CXCR4 钙流胞外信号调节激酶

内毒素诱导的肺损伤与CD26/CD30表达的动态研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第5期27卷 442-445页

作者：杨清玲丁勇兴李成华段巧玲蚌埠医学院生化与分子生物学教研室蚌埠市中心医院普外肿瘤科

目的探讨脓毒症小鼠外周血淋巴细胞TH1/TH2应答模式偏移的动态性变化。方法采用尾静脉注射LPS建立小鼠肺损伤模型,用流式细胞术检测CD26~+/CD30~+,以判断TH1、TH2细胞的分化情况及TH1/TH2应答模式的偏移状况。结果LPS组的CD26~+T细胞在... 详细信息

目的探讨脓毒症小鼠外周血淋巴细胞TH1/TH2应答模式偏移的动态性变化。方法采用尾静脉注射LPS建立小鼠肺损伤模型,用流式细胞术检测CD26~+/CD30~+,以判断TH1、TH2细胞的分化情况及TH1/TH2应答模式的偏移状况。结果LPS组的CD26~+T细胞在注射后7h已有明显增多,并在注射后14h达到峰值,38h降至最低点,而后各时点表达率的变化则趋于平稳,保持在正常对照组水平附近。CD30~+T细胞亦从注射后7h开始增加,并于注射后38h达峰值,随后缓慢下降(P<0.01)。肺组织病理切片显示注射后38h小鼠发生肺组织损伤。结论TH1/TH2应答模式向TH2方向的偏移以及细胞免疫抑制可能是LPS诱导的肺损伤的重要因素。

关键词：肺损伤 CD26/CD30 脂多糖流式细胞仪

CXCR4表达水平对判断乳腺癌淋巴结转移潜能的意义

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中国肿瘤临床 2008年第2期35卷 88-91页

作者：丁勇兴李成华杨清玲陈昌杰承泽农蚌埠市中心医院普外肿瘤科安徽省蚌埠市233000 蚌埠医学院生化与分子生物学教研室和病理科

目的:趋化因子受体CXCR4在癌转移中起着重要作用。我们研究了乳腺癌标本中CXCR4的不同表达水平以及生物学标记物HER2的表达,进而评估这些生物学标记物能否预测腋窝乳腺癌腋窝淋巴结转移潜能。方法:CXCR4和HER2表达用免疫组化的方法,检... 详细信息

目的:趋化因子受体CXCR4在癌转移中起着重要作用。我们研究了乳腺癌标本中CXCR4的不同表达水平以及生物学标记物HER2的表达,进而评估这些生物学标记物能否预测腋窝乳腺癌腋窝淋巴结转移潜能。方法:CXCR4和HER2表达用免疫组化的方法,检测不同时期乳腺癌的石蜡切片。其中淋巴结阳性病例80例,淋巴结阴性病例7例。结果:淋巴结阳性较阴性病例显示CXCR4高表达率(26.3%VS.14.3%,P=0.013),HER2过表达(28.8%vs.14.3%,P=0.011)。CXCR4与HER2表达与乳腺癌肿瘤分期(P=0.000)和淋巴结转移状况(P=0.032)正相关。同时标记CXCR4和HER2,与淋巴结阴性肿瘤比较,淋巴结阳性高表达其中一种标记物(51.3%vs.28.6%,P<0.003)。结论:趋化因子受体CXCR4在乳腺癌中是预测腋窝淋巴结转移的一种新型的生物标记物。联和其他标记物,如HER2可提高预测受累淋巴结的状态。

关键词：乳腺癌免疫组化肿瘤分期淋巴结状态