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新型猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展

病毒学报 2022年第5期38卷 1237-1243页

作者：秦俣杨永乐俞德黄耀伟浙江大学动物医学系杭州310058

冠状病毒可引起人或动物不同程度的呼吸道或胃肠道疾病,严重危害公共卫生或畜禽安全。近年来,新生仔猪腹泻在国内外多次暴发,给养猪业带来了巨大的经济损失。一种源自菊头蝠的新型猪冠状病毒于2017年在广东省腹泻仔猪中被发现,是目前已... 详细信息

冠状病毒可引起人或动物不同程度的呼吸道或胃肠道疾病,严重危害公共卫生或畜禽安全。近年来,新生仔猪腹泻在国内外多次暴发,给养猪业带来了巨大的经济损失。一种源自菊头蝠的新型猪冠状病毒于2017年在广东省腹泻仔猪中被发现,是目前已知的第五种在自然状态下感染猪的冠状病毒,本课题组将其称为猪肠道甲型冠状病毒(Swine enteric alphacoronavirus),后来又命名为猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。SADS-CoV是COVID-19疫情出现之前最新鉴定的动物冠状病毒,具有潜在的广泛种属嗜性,特别可感染多种人类呼吸道和肠道原代培养细胞,对其潜在的公共卫生意义应引起高度重视。本文针对SADS-CoV进行综述,阐述其发现、病原学、分子流行病学、跨种传播、诊断和防控等方面的最新研究进展。

关键词：猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV) 病原学流行病学跨种传播防控

冠状病毒非结构蛋白Nsp2的演化、结构与功能

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中国生物化学与分子生物学报 2023年第10期39卷 1375-1382页

作者：薛甜焦亚娟黄耀伟浙江大学动物医学系杭州310058 岭南现代农业科学与技术广东省实验室华南农业大学兽医学院广州510642

以新冠病毒(SARS-CoV-2)为代表的冠状病毒(coronavirus,CoV)主要危害呼吸系统和消化道系统,严重危害人类与动物健康。冠状病毒非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)是病毒基因Orf1ab编码的多聚蛋白质在病毒木瓜样蛋白酶作用下,经... 详细信息

以新冠病毒(SARS-CoV-2)为代表的冠状病毒(coronavirus,CoV)主要危害呼吸系统和消化道系统,严重危害人类与动物健康。冠状病毒非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)是病毒基因Orf1ab编码的多聚蛋白质在病毒木瓜样蛋白酶作用下,经切割后形成的成熟加工产物。Nsp2的研究较少,其在病毒复制相关的生命周期、与宿主相互作用等过程中发挥的主要作用至今未得到阐明。尽管Nsp2在不同CoVs中变异程度较大,但其演化分型与不同冠状病毒亚属的分型一致。最近对SARS-CoV-2 Nsp2的高级结构进行了解析和分析,同时也发现了SARS-CoV-2 Nsp2上存在一些与新冠突变株相关的显著突变,但是对Nsp2结构与突变及其生物学功能的联系仍不清楚。虽然Nsp2对于冠状病毒复制是非必须的,但是对于野生毒株达到最大病毒复制量至关重要。Nsp2被招募到被感染细胞的双层膜囊泡结构,与多种病毒蛋白质相互作用,协同参与病毒复制与转录。Nsp2还通过与多种宿主蛋白质相互作用,不仅参与线粒体、溶酶体、内质网等细胞器的生理过程,调节宿主细胞的能量代谢与物质转运,还通过影响干扰素的产生调节宿主先天免疫应答。本文对冠状病毒,特别是新冠病毒的Nsp2的产生、遗传演化、结构、主要变异位点进行了归纳,同时对其参与病毒复制、与病毒蛋白质及宿主蛋白质互作等最新研究进行概述总结,以期为冠状病毒的病原生物学、致病机制研究与防控提供参考。

关键词：冠状病毒新冠病毒非结构蛋白2 演化结构生物学功能

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传染性法氏囊病病毒感染性克隆的快速构建

Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第4期35卷 338-344页

作者：黄耀伟李龙李建荣于涟浙江大学生物医学工程学系杭州310027 杭州310029 杭州310029 杭州310029 浙江大学动物预防医学研究所浙江大学动物预防医学研究所浙江大学动物预防医学研究所浙江大学动物预防医学研究所杭州310029

用长距离RT PCR一步扩增并克隆全长为 2 82 7bp的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)的B节段基因组cDNA ,通过定点的沉默突变在B节段编码区引入一个EcoRV酶切位点作为分子标记。分别构建IBDV的A、B节段基因组真核表达载体 ,在脂质体介导下共转染... 详细信息

用长距离RT PCR一步扩增并克隆全长为 2 82 7bp的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)的B节段基因组cDNA ,通过定点的沉默突变在B节段编码区引入一个EcoRV酶切位点作为分子标记。分别构建IBDV的A、B节段基因组真核表达载体 ,在脂质体介导下共转染Vero细胞。RNA点杂交、间接免疫荧光分析表明重组子在Vero细胞得到了表达 ;用转染细胞的培养上清液不断地接种新的Vero细胞 ,模拟病毒“传代” ,观察到细胞形态学发生变化 ,产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应 (CPE) ;电子显微镜下可以看到符合IBDV病毒粒子结构的物质 ;酶切鉴定验证了所引入的分子标记 ,证实人工IBDV获得拯救。建立的基于长距离RT PCR和RNA聚合酶Ⅱ系统的快速、简易的IBDV感染性克隆构建方案 ,为开发新一代抗IBDV的基因缺失疫苗创造了条件。

关键词：传染性法氏囊病病毒感染性克隆拯救长距离RT-PCR 定点突变

猪肠道冠状病毒与入侵受体氨基肽酶N的相互作用

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中国生物化学与分子生物学报 2019年第9期35卷 952-959页

作者：刘炎黄耀伟浙江大学动物科学学院动物医学系

猪肠道冠状病毒是目前危害养猪产业的重要病原。目前已发现能够感染猪肠道的致病性冠状病毒有4种:猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒和猪肠道甲型冠状病毒。冠状病毒感染宿主的第一步是识别宿主细胞膜受体分子并与... 详细信息

猪肠道冠状病毒是目前危害养猪产业的重要病原。目前已发现能够感染猪肠道的致病性冠状病毒有4种:猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒和猪肠道甲型冠状病毒。冠状病毒感染宿主的第一步是识别宿主细胞膜受体分子并与之结合,随后启动入侵及膜融合进而使病毒基因组进入宿主细胞内部。因此,冠状病毒受体是决定其宿主范围及组织嗜性的关键因素。确定冠状病毒受体及病毒与受体的结合机制对预防新发病毒及开发冠状病毒治疗性药物具有重要意义。猪传染性胃肠炎病毒利用猪氨基肽酶N(aminopeptidase N,APN)作为感染宿主的功能性受体,并利用唾液酸作为辅助结合因子。猪APN最初也被鉴定为猪流行性腹泻病毒的功能性受体,但近年的研究结果与前面的报道存在较大的差异,产生了较大的争议。最近的研究认为,猪丁型冠状病毒的功能性受体也是APN,并且猪丁型冠状病毒能够利用多个物种的APN作为功能性受体,这与其跨物种传播具有密切关系。最新发现的猪肠道甲型冠状病毒则不使用APN作为其入侵受体。本文综述了前面3种猪肠道病毒感染宿主细胞的受体及结合机制的研究进展,并比较分析了猪APN及唾液酸在不同猪肠道冠状病毒入侵宿主过程中结合方式的异同,为进一步研究新发猪肠道冠状病毒受体提供参考。

关键词：冠状病毒受体猪肠道冠状病毒氨基肽酶N

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猪流行性腹泻病毒与宿主抗病毒天然免疫抑制

中国生物化学与分子生物学报 2016年第9期32卷 967-975页

作者：郭存财刘炎黄耀伟浙江大学动物科学学院杭州310058

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)能引起猪腹泻等肠道疾病,属于α属冠状病毒,它的爆发给很多国家养猪业造成了严重的经济损失。2010年以来,PEDV感染在中国出现大规模爆发,一种突变型PEDV也于2013年在美国出现并... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)能引起猪腹泻等肠道疾病,属于α属冠状病毒,它的爆发给很多国家养猪业造成了严重的经济损失。2010年以来,PEDV感染在中国出现大规模爆发,一种突变型PEDV也于2013年在美国出现并迅速传播。RNA病毒能够通过Toll样受体通路3(TLR3)和RIG-I样受体通路(RLR)诱导I型干扰素的产生。但以往的研究表明,PEDV感染能抑制I型干扰素的合成。近年来有关PEDV调节宿主天然免疫应答的研究取得了很大进展。PEDV主要通过编码作为干扰素拮抗剂的病毒蛋白以及隐藏病毒自身病原相关分子模式(PAMP)等两种方式逃逸宿主天然免疫应答。目前已报道,PEDV非结构蛋白1可通过降解CBP阻碍干扰素调节因子3(IRF-3)组装成增强子复合体;木瓜蛋白酶样蛋白酶可通过其去泛素化酶活性阻断天然免疫信号通路传递;3C样蛋白酶可通过剪切NEMO发挥干扰素拮抗剂活性;核衣壳蛋白通过结合TBK1抑制I型干扰素产生。PEDV也可通过合成加帽酶隐藏其病原相关分子dsRNA来避免激活天然免疫通路。PEDV抗病毒天然免疫机制阐明为研究PEDV感染免疫和致病机制提供了重要的理论依据,为研发抗PEDV新型疫苗和药物提供了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒天然免疫干扰素拮抗剂

用长距离RT-PCR扩增并克隆鸡传染性法氏囊病病毒的大节段全长基因组

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2001年第3期33卷 355-359页

作者：黄耀伟于涟丁红梅李建荣宋坤华杭州310027 浙江大学生物医学工程学系浙江大学动物预防医学研究所!杭州310029

使用长距离RT PCR方法扩增并克隆了一种双链RNA病毒———鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)的大节段全长基因组。首先比较 4种病毒纯化和基因组抽提方案 ,发现超速离心后用蛋白酶K消化病毒粒子是较好的方法 ,所得dsRNA不用精制模板即可直接... 详细信息

使用长距离RT PCR方法扩增并克隆了一种双链RNA病毒———鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)的大节段全长基因组。首先比较 4种病毒纯化和基因组抽提方案 ,发现超速离心后用蛋白酶K消化病毒粒子是较好的方法 ,所得dsRNA不用精制模板即可直接进入RT PCR体系。在 5 0℃下用SuperscriptII酶反转录合成单链cDNA ,经RNaseH除去杂交链的RNA后 ,用一对引物直接扩增到预期分子量的片段。PCR产物克隆并测序 ,序列分析证实获得了 3 2 5 9bp的大节段全长。该方法优于传统的双链RNA病毒分段克隆策略 ,大大简化了克隆程序

关键词：传染性法氏囊病病毒A节段长距离RT-PCR cDNA全长克隆

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中国农户信用行为研究

中国农户信用行为研究

作者：黄耀伟中央民族大学

学位级别：硕士

农户信用一直是农村金融的核心和难点问题,论文试图通过对中国农户借贷行为的研究,发现农户借贷行为演化的规律,以及当代农户信用行为特征和信贷供求影响因素,为提出符合中国实际的农村金融政策提供依据。研究对于农村金融机构乃至农村... 详细信息

农户信用一直是农村金融的核心和难点问题,论文试图通过对中国农户借贷行为的研究,发现农户借贷行为演化的规律,以及当代农户信用行为特征和信贷供求影响因素,为提出符合中国实际的农村金融政策提供依据。研究对于农村金融机构乃至农村金融体制的改革,促进农村社会的分化和转型均有较强的现实意义,对于深化农户行为、农户金融需求的研究,完善对中国农户经济社会行为的认识具有理论和实践意义。论文以介绍农户信用行为的概念和农户信用的三种相关理论为起点,历史地归纳总结了中国农户的信用行为特征,进而从供求两方面分析农户信贷的影响因素,最后得出农户信用行为特征的一般性结论,并给出农户信用行为调整和优化的政策建议。导论阐明了论文的选题背景、研究的目的和意义、研究的思路和方法,评述了国内外研究动态以及论文可能的创新之处。第一章农户信用行为的基本理论介绍了农户的概念、基本特征和农户类型的划分,信用的概念和基本分类,在综合农户和信用两个概念的基础上介绍了农户信用的内涵和发生基础。阐述了与农户信用相关的农业信贷补贴论、农村金融市场论和不完全竞争农村金融市场论。第二章中国农户行为特征的演变区分了传统自给自足社会和市场经济条件下两个历史阶段。民国之前的农户信用表现为从无息向有息、从实物向货币的转变,在用途上以生活性借贷为主,在期限和规模上以短期小额借贷为主。民国时期的农户信用进一步表现出借贷依赖性强、利率企高、资金来源以私人借贷为主的特征。市场经济条件下的农户信用表现出借贷水平整体快速增长、发生率较高、生产和生活借贷齐头并进、非正规借贷占据比重较大、期限不固定、不规范的特征。第三章中国农户信用行为影响因素分析从农户信贷需求来看,农户的经济类型、信贷利率、经营规模和生产投资规模、财产收入和自有资金状况、生活现金支出以及区域类型是较为显著的影响因素。从农户信贷供给来看,农村金融市场严重的信息不对称、缺乏可抵押物、特质性成本和风险以及非生产性借贷为主等四个方面的基本特质导致正规金融安排的不足和非正规金融产生的必然性,两者影响因素不同。第四章中国农户信用行为调整和优化的政策建议通过农户信用行为的历史分析,我们发现农户信用行为未发生质的变化,农户信用发展不平衡且出现明显的分层化特征,地域差异明显,针对这一结论本文认为应采取分类型、分地区的差异化农村金融政策;正规金融和非正规金融安排各有所长,两者应实现信贷分层、垂直合作,构建一个有效的农村金融体系。

关键词：农户信用行为正规金融非正规金融垂直合作

传染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的构建

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科学通报 2006年第14期51卷 1732-1734页

作者：李龙魏永伟黄耀伟于涟浙江大学动物预防医学研究所浙江省重点实验室

通过PCR方法，删除传染性法氏囊病毒HZ2株ORF A1和ORF A2非重叠区的33bp（96—129bp）的同时，引入Nhe Ⅰ酶切位点（GcTaGc）作为分子标记，构建含有A节段突变体的真核表达载体pCI-Nhe3，与HZ2株B节段真核表达载体pCI—mB在脂质体介导... 详细信息

通过PCR方法，删除传染性法氏囊病毒HZ2株ORF A1和ORF A2非重叠区的33bp（96—129bp）的同时，引入Nhe Ⅰ酶切位点（GcTaGc）作为分子标记，构建含有A节段突变体的真核表达载体pCI-Nhe3，与HZ2株B节段真核表达载体pCI—mB在脂质体介导下共转染鸡胚成纤维（CEF）细胞．用转染细胞的培养液上清不断地接种新鲜细胞，模拟病毒“传代”．结果表明，细胞的形态学特征发生变化，产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应（CPE）．电子显微镜观察显示，在细胞超薄切片中有IBDV病毒粒子．间接免疫荧光分析结果表明，拯救的ANhe3株病毒的结构蛋白在CEF细胞得到了表达，而非结构蛋白（VP5）则不能表达．针对A节段的RT—PCR，酶切鉴定及进一步的序列测定结果验证了相应核苷酸片段的缺失和分子标记的引入．ANhe3株病毒接种不能导致11日龄SPF鸡胚的死亡，相对HZ2株致死率（20％）明显下降．本研究利用基于cDNA转染和RNA聚合酶Ⅱ系统的IBDV反向遗传系统，构建了IBDV VP5基因大片段缺失的毒株ANhe3株，为IBDV基因组学的研究提供了新方向，为进一步探索病毒复制和致病机制以及开发基因缺失疫苗奠定基础．

关键词：传染性法氏囊病毒 VP5 基因缺失反向遗传

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新技术防治传染性法氏囊病的研究进展和思考

中国兽医学报 2001年第4期21卷 413-417页

作者：于涟黄耀伟丁红梅浙江大学动物预防医学研究所浙江杭州310029

传染性法氏囊病（IBD）自1962年被确认以来，已成为世界养禽业最严重的传染病之一。

关键词：传染性法氏囊病病毒分子生物学新型疫苗防治措施禽病